Спосіб диференціації m. avium subspecies paratuberculosis від m. avium subspecies avium на кроликах

Реферат: Спосіб диференціації M. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах включає внутрішньовенне зараження кроликів 1-місячного віку суспензією МАР, яке проводять дворазово з інтервалом 14 діб. UA 87413 U (54) СПОСІБ ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ M. AVIUM SUBSPECIES PARATUBERCULOSIS ВІД M. AVIUM SUBSPECIES AVIUM НА КРОЛИКАХ UA 87413 U UA 87413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі ветеринарної мікробіології і може бути використана для ідентифікації ізольованих на середовищі з вмістом фактору росту культур, для постановки остаточного діагнозу на паратуберкульоз, для вивчення імуногенезу і патогенезу паратуберкульозу. В ветеринарній медицині існує культуральний спосіб ідентифікації МАР, який ґрунтується на потребі збудника паратуберкульозу у mycobactin в перших генераціях (ОІЕ Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. - 2004; ch. 2.2.6). Недоліком цього способу є те, що інші підвиди комплексу M. avium і деякі первинні ізоляти М. avium subsp. avium також можуть бути мікобактінзалежними і навпаки, деякі штами МАР, при другому пасажі можуть рости на живильному середовищі без вмісту мікобактіну. Також був розроблений комерційний діагностичний тест, який базується на виявленні вставки IS900 послідовностей в культурі мікобактерій, виділеної з фекальних зразків і збагачення ДНК-фракції з IS900 послідовностей з використанням ПЛР. Тест доступний у виді набору (Тест-набір ДНК-зондів фірми IDEXX або набір для ПЛР фірми Adiavet Paratb для ідентифікації МАР). Однак у цього тесту низька діагностична чутливість, а проведення дослідження потребує спеціального обладнання і фахівців. Найбільш близьким аналогом до запропонованого способу є спосіб диференціації МАР шляхом відтворення паратуберкульозних уражень у кроликів (Сидорчук, В.А. Паратуберкулез овец, коз и кроликов в экспериментальных условиях [Текст]: автореф. діс. канд. вет. наук: 06.02.02 / В.А. Сидорчук; [ВИЭВ], - М, 2010. - 21 с.). За цим способом кроликам 6-місячного віку одноразово внутрішньовенно вводять суспензію 3 ізольованої культури у дозі 30 мг/см у стерильному фізіологічному розчині. Через 4 місяця після зараження проводять патологоанатомічне дослідження на наявність паратуберкульозних уражень. Недоліком цього способу є використання великої концентрації бактеріальної маси, яку попередньо необхідно отримати, а для цього треба адаптувати виділену культуру до середовища Сотона, що займе тривалий час. Також відомо, що до паратуберкульозу найбільш чутливі найбільш молоді тварини, тому інокуляція МАР кроликам 6-місячного віку не завжди обумовлює виникнення характерних щодо паратуберкульозу уражень. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб диференціації M. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах, який дозволяє ідентифікувати та диференціювати збудник паратуберкульозу на підставі характерних патологічних уражень. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб диференціації М. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах, що включає внутрішньовенне зараження кроликів суспензією МАР шляхом дворазового з інтервалом 14 діб внутрішньовенного 3 зараження кроликів 1-місячного віку суспензією МАР у дозі 1,0 мг/см при концентрації 3 бактеріальної маси 2,0 мг/см на стерильному фізіологічному розчині для відтворення патологічних уражень характерних для паратуберкульозу. Порівняльний аналіз з найближчим аналогом дозволяє зробити висновок, що спосіб, який заявляється, відрізняється використанням кроликів 1-місячного віку, дворазовим введенням суспензії ізольованої культури та кількістю введеної культури. Це дає можливість не накопичувати бактеріальну масу у великій кількості, що значно скорочує час диференціації та постановки остаточного діагнозу на паратуберкульоз. Спосіб виконують таким чином: 1. З ізольованої на спеціальному середовищі з вмістом фактору росту (бактеріальної маси М. phlei або її похідної - mycobactin) культури готують суспензію на стерильному фізіологічному розчині. 2. Клінічно здоровим, раніше не реагуючим на туберкулін (ППД) для ссавців ті птиці кроликам, дворазове з інтервалом 14 діб внутрішньовенно вводять завис дослідної культури. 3. Тварин, що загинули або піддали евтаназії через 4 місяця після зараження досліджують патологоанатомічним та мікроскопічним методами на наявність характерних уражень і кислотостійких паличок в мезентеріальних лімфатичних вузлах і уражених ділянках кишечнику. Приклад 1. Кроликам 1-місячного віку дворазово з інтервалом 14 діб внутрішньовенно інокулюють 3 суспензію культури МАР у дозі 2,0 мг/см на стерильному фізіологічному розчині у крайову вену вуха. Приклад 2. Зараження кроликів проводять як вказано вище, тільки використовують тварин 3-місячного віку. Приклад 3. 1 UA 87413 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Теж саме, що і в прикладі 1, тільки зараження проводять на кроликах 6-місячного віку. Приклад 4. Теж саме, що і в прикладі 1, тільки інокулюють суспензію епізоотичної культури М. avium, яка була ізольована від ВРХ і у перших генераціях росла тільки на середовищі з фактором росту. Результати ефективності запропонованого способу у порівнянні з найближчим аналогом наведені в таблиці. Із матеріалів таблиці видно, що ефективність відтворення патологічних уражень при зараженні малими дозами зменшується зі збільшенням віку, тварини. Так експериментальне інфікування кроликів 1-місячного віку (приклад 1) супроводжувалося клінічним проявом хвороби з ознаками діареї, втратою маси тіла, атрофією м'язів задніх кінцівок. При цьому способі інфікування тварини гинули протягом 2-3 місяців, у всіх тварин спостерігали патологічні зміни у тонкому відділі кишечнику, особливо в клубовій кишці та ілеоцекальному клапані. Вміст кишечнику - прозора світло-жовта із зловонним запахом слиз з пухирцями газів. Стінки кишечнику були в 3-4 рази потовщені, місцями виявляли наявність точкових крововиливів, на слизовій оболонці кишечнику спостерігали поздовжні і поперечні борозди та складки з дрібними сіруватими вузликами, сіро-білі серозні вузлики виявляли також на мезентеріальних лімфатичних вузлах і печінці. При мікроскопії уражених ділянок у всіх тварин (приклади 1, 2, 3 і найближчий аналог) виявляли скупчення дрібних кислотостійких паличок та коків. При інфікуванні кроликів 3-місячного віку (приклад 2) патологічні зміни відмічали у всіх тварин, але ураження були менш виражені. Клінічне проявлення хвороби і загибель тварин раніше ніж 4 місяця спостерігали у 50 % тварин. При зараженні кроликів 6-місячного віку (приклад 3 і прототип) клінічних ознак хвороби не виявляли, тварини залишалися живі протягом 4 місяців. На розтині відмічали збільшення селезінки, печінки у 3-4 рази. Патологічні ураження кишечнику і мезентеріальних лімфовузлів спостерігали у 50 % тварин (приклад 3) і у 70 % тварин (прототип). При зараженні кроликів суспензією епізоотичної мікобактінзалежною культурою (приклад 4) загибель тварин наступала протягом 1 місяця від септичної форми за типом Йерсена. При цьому на розтині спостерігали збільшення у 3-5 разі селезінки та печінки, точкові крововиливи внутрішніх органів, при мікроскопії мазків-відбитків з органів кислотостійких паличок не виявляли, це дало підставу віднести ізольовану культуру до М. avium subspecies avium. Результати проведених досліджень свідчать про те, що використання запропонованого способу диференціації М. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах дозволяє ідентифікувати та диференціювати збудник паратуберкульозу на підставі характерних патологічних уражень. Запропонований спосіб є більш ефективніший ніж існуючий. Таким чином запропонований спосіб диференціації М. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах відповідає сучасним вимогам при роботі з інфекційним матеріалом, є ефективним та може використовуватись при ідентифікації збудника у лабораторних умовах, відтворенні хвороби на кроликах для вивчення імунної відповіді, патогенезу і біологічних властивостей збудника. Таблиця Спосіб диференціації M. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах Приклади Тварини клінікою кахексія) 1 100 2 50 3 4 Найближчий аналог (%) з Тварини (%) (діарея, патологічними ураженнями з 100 100, але ураження менш виражені 50 100, септична форма за типом Йерсена 70 2 Тварини (%), у Тварини (%) які яких при загинули раніше мікроскопії органів 4-місяців виявляли МАР 100 100 100 50 100 100 100 UA 87413 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб диференціації M. avium subspecies paratuberculosis від М. avium subsp. avium на кроликах, що включає внутрішньовенне зараження кроликів суспензією МАР, який відрізняється тим, що внутрішньовенне зараження кроликів суспензією МАР проводять 3 3 дворазово з інтервалом 14 діб у дозі 1,0 мг/см при концентрації бактеріальної маси 2,0 мг/см , використовуючи кроликів 1-місячного віку. Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3