Спосіб репаративної терапії за умов отруєння тварин кадмієм

Спосіб репаративної терапії за умов отруєння тварин кадмієм, який включає пероральне введення фосфоліпідвмісної суміші і α-токоферолу, який відрізняється тим, що тваринам, інтоксикованим кадмієм, при появі клінічних ознак патології, вводять 0,6-1,0 % розчин ліпосомальної форми БАД FLP-MD на основі фосфоліпідів, виділених з маслянки, у дозі 13,0-14,5 мг на 1 кг маси тіла тварини, причому введення проводять один раз на добу з мінімальним терміном застосування впродовж двох тижнів. Винахід відноситься до ветеринарії, медицини та токсикології, зокрема до способів активації репаративних процесів у внутрішніх органах, передусім апараті травлення, печінці, нирках, при отруєнні тварин кадмієм, що передбачає застосування ліпосомальної форми біологічно активної добавки (БАД) FLP-MD для прискорення відновлення структурно-функціонального стану зазначених органів і пов'язаного з їх діяльністю обміну речовин. Відомий спосіб (Верткин А.Л. Применение эссенциальных фосфолипидов в современной клинике. Метод, рекомендации. Μ.: 2000. -89 с; Кунц Э., Гундерманн К.-Й., Шнайдер Э. "Эссенциальные" фосфолипиды в гепатологии (экспериментальный и клинический опыт) // Терапевтический архив. - 1994. - Т. 66, № 2. - С. 66-72), який прискорює інтенсивність регенеративних процесів, за розвитку порушень і захворювань, що супроводжуються ураженням мембран клітин різних тканин та органів, особливо печінки, легень, серця, рекомендований в медицині і полягає у пероральному (можливо внутрішньовенне) введенні препарату "Есенціале-форте" у дозі від 900 до 1800 мг/добу (по 2 капсули тричі на добу) впродовж одного місяця і триває роками, прийнятий за прототип. Недоліком відомого способу є необхідність у тривалому застосуванні пацієнтам препарату "Есенціале-форте". Помітний ефект відмічається після З-місячного курсу лікування і його необхідно підтримувати роками, що неможливо у тваринництві, де тварин часто переводять у різні технологічні групи. Це створює практичні складності при їх ветеринарному обслуговуванні, а також економічно не рентабельно. В основу винаходу поставлене завдання одержати високий лікувально-профілактичний ефект від застосування ліпосомальної форми БАД FLPMD у лікуванні тварин, токсикованих кадмієм, що сприяє зростанню інтенсивності репаративних процесів у пошкоджених клітинах уражених органів, стабілізує метаболічний статус організму тварин, шляхом ефективного відновлення структурнофункціонального стану патологічно змінених мембранних систем і тісно взаємопов'язаних з ними метаболічних процесів. (19) UA (11) 91140 (13) C2 (21) a200813653 (22) 26.11.2008 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) МЕЛЬНИЧУК ДМИТРО ОЛЕКСІЙОВИЧ, ГРИЩЕНКО ВІКТОРІЯ АНАТОЛІЇВНА, ХИЖНЯК СВІТЛАНА ВОЛОДИМИРІВНА, ВОЙЦІЦЬКИЙ ВОЛОДИМИР МИХАЙЛОВИЧ, ЛИТВИНЕНКО ОЛЕСЯ МИКОЛАЇВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (56) UA 78306 C2, 15.12.2006 UA a200710252 C, 25.03.2008 RU 2 252 766 C1, 27.05.2005 RU 2 178 701 C2, 27.01.2002 CN 1 328 845 A, 02.01.2002 3 Відома фосфоліпідовмісна БАД FLP-MD ліпосомальної форми (Заявка на патент № а 2007 10252 від 14.09.2007. Ветеринарна біологічно активна добавка ліпосомальної форми та спосіб репаративної терапії в гепатології. Д.О. Мельничук, В.А. Грищенко, О.М. Литвиненко. Опубл. 25.03.2008, Бюл. № 6). БАД FLP-MD має рідку ліпосомальну форму (розчинник -фосфатний буфер з рН 7,5) і містить інгредієнти у такому співвідношенні, мас. %: ліпідну суміш з маслянки - 0,7 - 0,9, яка по суті складається з фосфоліпідів; суміш ненасичених жирних кислот (70 % ліноленової кислоти, решта - лінолева, олеїнова та інші) - 0,49 0,63 та вітаміни жиророзчинної групи, а саме: αтокоферол - 42,0 - 56,0 мг і ретинолу ацетат 14000 - 19600 МО із розрахунку на 1 л БАД.). Поставлене винаходом завдання досягається тим, що спосіб репаративної терапії за умов інтоксикації тварин кадмієм, який включає пероральне застосування фосфоліпідовмісної суміші та αтокоферолу, згідно винаходу, тваринам, інтоксикованим кадмієм, при появі клінічних ознак патології, вводять 0,6... 1,0 % розчин ліпосомальної форми БАД FLP-MD на основі фосфоліпідів, виділених з маслянки, у дозі 13,0... 14,5 мг на 1 кг маси тіла тварини, причому введення проводять один раз на добу з мінімальним терміном застосування впродовж двох тижнів. Спосіб репаративної терапії за умов отруєння тварин кадмієм відрізняється тим, що регулярне введення впродовж двох тижнів до організму тварин, які піддавалися інтоксикації кадмієм, ліпосомальної форми БАД FLP-MD, що характеризується оригінальним поєднанням у своєму складі отриманих з природної і дешевої сировини (маслянки) суміші ліпідів (переважно фосфоліпідів), які за своїм жирнокислотним спектром відповідають мембранним фосфоліпідам тканин ссавців, суміші природних моно- і поліненасичених жирних кислот та жиророзчинних вітамінів (α-токоферол і ретинолу ацетат), стимулює розвиток репаративних процесів в уражених органах та тканинах, перш за все шлунково-кишковому тракті, печінці, нирках, що сприяє більш інтенсивному відновленню їх структурно-функціонального стану та нормалізації метаболічного статусу організму інтоксикованих тварин. Компоненти БАД FLP-MD ліпосомальної форми характеризуються мембранно-модулюючими властивостями, що обумовлює вплив на структурно-функціональний стан уражених клітин та інтенсивність і спрямування обмінних процесів в організмі отруєних кадмієм тварин. Співвідношення компонентів у БАД FLP-MD ліпосомальної форми випливає з їх лікувальнопрофілактичних доз. Фосфоліпіди БАД FLP-MD забезпечують відновлення структури та функцій пошкоджених мембранних структур клітин, формують поверхневий заряд клітин, сприяють всмоктуванню жирів в кишечнику, необхідні для утворення вторинних внутріншьоклітинних посередників. Природні антиоксиданти - αтокоферол і ретинолу ацетат, які виявляють синергічну дію в комплексі з фосфоліпідами, стабілізують та захищають від пероксидного окиснення 91140 4 фосфоліпіди БАД FLP-MD та клітинних мембран. Ненасичені жирні кислоти беруть участь у регуляції активності факторів транскрипції, в трансдукції сигналів та експресії низки генів у лімфоцитах та фагоцитах, виступають субстратом для утворення важливої групи ліпідних регуляторів - ейкозаноїдів, володіють широким спектром імуностимулюючої дії, регулюють інтенсивність запалення, тромбоутворення, тонус і проникність судин, що в цілому значно покращує ультраструктуру і функціональний стан уражених органів та метаболічний статус організму інтоксикованих тварин. Приклад. Забруднення навколишнього середовища металами, в тому числі токсичними - плюмбумом, кадмієм, кобальтом, меркурієм, може бути результатом як природних процесів, так і антропогенної діяльності. Кадмій, який визнано як один із суттєвих забруднювачів біосфери, при надходженні до організму тварин спричиняє низку токсичних ефектів, впливаючи на різні органи та системи. Основними органами-мішенями при інтоксикації кадмієм виступає шлунково-кишковий тракт, печінка та нирки. Відомо, що один з основних механізмів, за допомогою яких більшість важких металів реалізують свою токсичну дію, є активація вільнорадикального окиснення, що супроводжується пошкодженням всіх основних класів біологічних макромолекул та надмолекулярних комплексів, у тому числі біологічних мембран. Існують дані, що порушення процесів ліпопероксидації відіграють важливу роль також і в механізмах токсичної дії іонів кадмію. Вважається, що кадмій спричиняє значне підсилення пероксидного окиснення ліпідів і зниження активності антиоксидантних ферментів: глутатіонпероксидази, супероксиддисмутази, каталази. Активація процесів пероксидного окиснення вільнорадикального ланцюгового процесу призводить до утворення пероксидів органічної та неорганічної природи. Субстратом пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) є поліненасичені жирні кислоти, які входять до складу фосфоліпідів біологічних мембран. Визначення вмісту продуктів ПОЛ за дії шкідливих факторів різноманітного походження є високо інформативним показником, що обумовлює використання його з метою діагностики ефективності лікування та профілактики захворювань різноманітної етіології. Постійний контроль, як ферментативний, так і неферментативний, за вмістом активних форм оксигену, вільних радикалів тощо чітко регламентує реакції ПОЛ та спрямований на підтримку гомеостазу в організмі. Зрив такого контролю, що може виникнути в результаті екзогенного чи ендогенного впливу, приводить до інтенсифікації процесів ПОЛ, збільшення концентрації та накопичення в організмі продуктів ліпопероксидації, яким притаманна висока реакційна здатність у відношенні системної пошкоджуючої дії на клітини. Показники, які визначають рівень ПОЛ та стан антиоксидантної системи, характеризують функціонування захисно-• пристосувальних механізмів організму на клітинному рівні, а отже, мо 5 жуть бути чутливими тестами на дію різних екзогенних чинників. Для проведення клінічних досліджень, використовували безпорідних шурів-самців, вагою 180 200 г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Тварин розділяли на 4 групи по десять голів у кожній. Тривалість досліду становила 20 діб. До 1-ї групи відносилися контрольні тварини (інтактні); П-а група - здоровим тваринам упродовж 14 діб перорально вводили БАД FLP-MD (13,5 мг на 1 кг маси тіла); ІП-я група - тваринам упродовж 14 діб (раз на добу) перорально вводили кадмію хлорид в дозі 1,0 мг на 1 кг маси тіла, що відповідає 1/50 ЛД50 (за разового введення); IV-a група - тваринам вводили БАД FLP-MD (13,5 мг на 1 кг маси тіла) упродовж 6 діб до та 14 діб після щоденного введення кадмію хлориду в дозі 1,0 мг на 1 кг маси тіла. При забої, шляхом декапітації, у лабораторних тварин, для дослідження біохімічних показників, відбирали зразки печінки та тонкої кишки для отримання гомогенних препаратів, а також крові, з якої в подальшому одержували сироватку. Результати проведених досліджень представлено в табл. 1. В умовах введення тваринам кадмію хлориду в сироватці крові встановлено вірогідне підвищення вмісту креатиніну (в середньому на 21 % ) та глюкози (на 30%). Ймовірно, регулярне надходження кадмію хлориду в організм тварин впродовж 14 діб викликає порушення метаболізму в паренхімі нирок, процесів клубочкової фільтрації та канальцевої реасорбції. Крім того, за умов введення кадмію можливе порушення функції підшлункової залози, що призводить до послаблення глікогенутворюючої та глікогенфіксуючої функції печінки і проявляється зростанням вмісту глюкози в крові. Водночас цей стан супроводжується характерним підвищенням активності ферментів: аспартатамінотрансферази (АсАТ) - в середньому на 22 % та γ-глутамілтраспептидази (ГГТП) - на 40 %, що вказує на гепатотоксичний ефект кадмію в умовах експерименту. Пероральне введення тваринам БАД FLP-MD, на тлі інтоксикації кадмієм, призводить до часткової нормалізації активності ГГТП і рівня глюкози в сироватці крові, а активність АсАТ і вміст креатиніну не відрізняється від контрольних значень. Слід відмітити, що введення БАД FLP-MD контрольним тваринам не призводить до змін біохімічних показників сироватки крові. В експериментах на щурах активацію інтенсивності ПОЛ оцінювали за накопиченням кінцевого продукту - ТБК-активних продуктів. Встановлено (табл. 2), що введення кадмію хлориду призводить до накопичення ТБК-активних продуктів у клітинах епітелію тонкої кишки (в середньому на 300 % ), у клітинах печінки (на 50 %) та сироватці крові (на 36 %). За умов введення БАД FLP-MD, поряд із надходженням кадмію хлориду, рівень накопичення ТБК-активних продуктів залишається підвищеним (на 203 %, порівняно з контрольними значеннями) лише у сироватці крові. Результати щодо визначення активності супероксиддисмутази (СОД) та каталази (КаТ) свідчать 91140 6 про різнонаправлені зміни в їх активності в умовах досліду (табл. 2). За умов введення кадмію, у клітинах печінки активність СОД знижується, в середньому на 50 %, а у клітинах епітелію тонкої кишки - на 37 %. Водночас, активність КаТ у досліджуваних органах за цих умов не змінюється. Однак, активність КаТ знижується на 77 % в сироватці крові, а активність СОД при цьому не змінюється. Введення БАД FLPMD, поряд із надходженням кадмію хлориду, вказує на нормалізацію показників активності СОД у досліджуваних об'єктах. Водночас, активність КаТ в препаратах печінки та сироватки крові навіть перевищує контрольні значення на 39 % та 25 %, відповідно. Оскільки КаТ причетна до окисного фосфорилування і перенесення оксигену до внутрішньоклітинних структур, збільшення активності цього ферменту може свідчити про мобілізацію захисних сил організму. Результати із дослідження активності ферментів глутатіон-залежної антиоксидантної (АО)системи різних органів щурів представлено в табл. 3. Так, вміст відновленого глутатіону (ГЛ) за умов введення кадмію знижується відповідно в середньому на 26, 12 та 18 % у препаратах печінки, слизової оболонки тонкої кишки та крові. За цих умов зменшується і активність досліджуваних ферментів - глутатіонтрансферази (ГТ) та глутатіонпероксидази (ГП). Найбільші зміни спостерігаються для крові, відповідно на 61 % та 37 %. За умов введення кадмію хлориду на тлі надходження БАД FLP-MD спостерігаються менш виражені зміни досліджуваних показників. Хоча вміст відновленого ГЛ у крові та печінці залишається знижений, відповідно на 18 та 27 % відносно контролю, як і за умов введення кадмію, активність ферментів ГТ та ГП зменшуються в меншій мірі. Так, активність ГТ та ГП зменшується у крові на 43 та 19 % , а у печінці на 9 та 17 % , відповідно, відносно контрольних значень. Отримані результати свідчать про інтенсифікацію процесів ПОЛ на тлі зниження потенціалу ферментативної та неферментативної ланок АОзахисту у крові, печінці та слизовій оболонці тонкої кишки за умов 14-добового надходження кадмію хлориду в дозі 1,0 мг на 1 кг маси тіла. Накопичення кінцевого продукту ПОЛ - ТБК-активних продуктів спостерігається у всіх досліджуваних об'єктах. Пероральне надходження до організму щурів кадмію хлориду призводить до активації ПОЛ в клітинах внутрішніх органів. Інтоксикація тварин кадмію хлоридом обумовлює підвищення радикалів оксигену у клітинах, у тому числі в мітохондріях та мікросомах гепатоцитів. Відомо, що іонам кадмію притаманний прооксидантний ефект: активні радикали здатні викликати окиснювальну модифікацію не лише ліпідів, а й білків та нуклеїнових кислот. При активації процесів ПОЛ важливе значення має стан антиоксидантної системи організму. Активність КаТ та СОД, які беруть участь у знешкоджені активних сполук оксигену, по різному змінюється у різних тканинах за умов введення кадмію. Активність СОД, особливо у тканині печінки знижується, що можна пояснити ушкодженням молекули фермента чи підвищенням концентрації гідроген 7 пероксиду, як його інгібітора. Підтвердженням слугують результати, які свідчать, що у тканинах печінки та тонкої кишки, за досліджуваних умов, активність КаТ майже не змінюється, а активність ГП, ферменту, що також бере участь у знешкодженні гідроген пероксиду, знижується. Глутатіонпероксидазна система є однією із універсальних систем розкладу і знешкодження пероксидів, яка запобігає ініціації вторинних реакцій окиснення ліпідів та бере участь в інактивації продуктів окисного метаболізму ксенобіотиків. ГТ належить провідна роль у біотрансформації та детоксикації ксенобіотиків різного походження шляхом каталізу реакцій їх кон'югації з відновле 91140 8 ним ГЛ. Зниження активності цього ферменту, поряд із зменшенням вмісту відновленого ГЛ, а також зниження активності ГП, КаТ та СОД свідчить про пригнічення функціонування систем ОА- захисту організму за умов введення кадмію хлориду. Одночасне із кадмієм надходження БАД FLPMD призводить до покращення стану окисноїантиокисної рівноваги. Спостерігається менш значне накопичення ТБК-активних продуктів у досліджуваних біологічних об'єктах. Активність СОД майже не відрізняється від контрольних значень, а активність КаТ навіть перевищує контрольні значення, що може свідчити про мобілізацію захисних сил організму. 9 Комп’ютерна верстка І. Скворцова 91140 Підписне 10 Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601