Природний штам гриба chaetomium globosum – продуцент комплексу целюлаз

Реферат: Природний штам гриба Chaetomium globosum 377, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером F-100063, призначений для одержання комплексу целюлаз з метою розкладання рослинних решток і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. UA 95427 U (12) UA 95427 U UA 95427 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікроорганізмів - біодеструкторів, які здатні розкладати рослинні рештки. Це активний штам природного гриба Chaetomium globosum 377, який проявляє високу целюлозолітичну активність і призначений для одержання комплексу целюлаз з метою розкладання рослинних решток і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Целюлазні ферментні комплекси мікроорганізмів (бактерій, дріжджів, грибів) можуть використовуватись для біодеградації целюлозних субстратів, в тому числі відходів сільського господарства (соломи і стерні). Найбільш активними продуцентами целюлаз є гриби, які належать до родів Aspergillus, Chaetomium, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma [1, 2, 3, 4]. Відомі високоактивні мутантні штами грибів - продуцентів комплексу целюлаз [2, 3]. Найбільш близьким аналогом корисної моделі є природний штам Aspergillus species продуцент білка і целюлаз. Однак зазначений гриб не досліджувався за здатністю розкладати відходи сільського господарства (солому) і підвищувати урожайність сільськогосподарських культур [1]. В основу корисної моделі поставлена задача розширити арсенал природних високоактивних штамів - продуцентів целюлазного ферментного комплексу, призначених для деструкції відходів сільського господарства (соломи) та підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Поставлена задача вирішується шляхом отримання нового природного штаму гриба Chaetomium globosum Kunze ex Fr.377 методом аналітичної селекції. Штам виділений з компосту, де вирощувались їстівні гриби. Ідентифікований за визначником Кириленко Т.С. [5] та депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Академіка Заболотного 154, м. Київ) 18 червня 2013 року за реєстраційним номером Chaetomium globosum F-100063. Культурально-морфологічні особливості штаму. Культивується на сусло-агарі з масовою часткою сухих речовин від 3 % до 4 %, рН 6,8-7,0 за температур від 26 °C до 27 °C протягом 16-18 діб. Зберігається у холодильнику за температур 4-6 °C. Пересів проводиться 1 раз у 10-12 місяців. Колонії на сусло-агарі швидко ростуть та досягають 40-50 мм у діаметрі через 4-5 днів за температури від 25 °C до 27 °C, спочатку вони мають білий колір, потім (через 8-10 днів) набувають оливково-зеленого забарвлення. Текстура колонії спочатку пухнаста, потім бархатиста, в міру утворення плодових тіл. Плодові тіла (перитеції) поверхневі, розміщені на міцелії, утворюються в значній кількості, круглі, овальні, 240-360×180-300 мкм, темно-зелені або темно-коричневі з відростками, у ніжній частині з ризоїдами. Верхівкові відростки двох типів: прямі знизу, з 3-5 вільними завитками зверху, товщина 4-5 мкм, шорсткі, коричневі, коричнюваті, блідо-коричневі з 3-5 завитками, товщина 2,8-3,2 мкм. Бокові відростки прямі, злегка хвилясті, основа товщиною 4,5-5,0 мкм, з перегородками, коричнюваті, на верхівці більш світлі. Сумки булавоподібні, містять вісім спор. Сумкоспори овальні до лимоноподібних, 8,5-11×6,0-7,0 мкм, коричневі до тютюново-бурого кольору, на обох кінцях з маленьким вістрям. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Аероб. Гриб розвивається за рН від 4,2 до 11,2 та температури від 14 °C до 35 °C. Оптимальне значення рН середовища 6,4-7,2, температурний оптимум від 25 °C до 28 °C. Відношення до джерел вуглецю: найкращий ріст на середовищах з лактозою, глюкозою, сахарозою, мальтозою; добрий - на середовищах з фруктозою, ксилозою, рафінозою. На середовищі Гетчинсона з карбоксиметилцелюлозою (КМЦ) утворює субстратний міцелій та крупніші, ніж на інших середовищах, плодові тіла. Відношення до джерел азоту: добре росте на середовищах з глутаміновою та аспарагіновою кислотами, валіном, виннокислим амонієм, азотнокислим калієм, азотнокислим амонієм, азотнокислим кальцієм, сірчанокислим амонієм. Штам Chaetomium globosum 377 характеризується високою целюлазною активністю, активно розкладає пшеничну солому, забезпечує підвищення урожайності сільськогосподарських культур. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. У лабораторному досліді целюлазний ферментний комплекс був охарактеризований за загальною целюлазною активністю, екзо-1,4-β-D-глюканазною, ендо-1,4-β-D-глюканазною, та βглюкозидазною активностями. Як субстрат при визначенні загальної целюлазної активності використовували фільтрувальний папір (Фільтрак), 50 мг якого інкубували у 1 мл 0,05 Μ натрій-цитратного буферу протягом 1 год. за температури 50 °C [1]. Залишки редукуючих вуглеводів визначали 1 UA 95427 U 5 10 15 20 25 30 35 40 методом Сомоджи-Нельсона [6]. Одиницею загальної целюлазної активності вважали активність такої кількості ферменту, яка за 30 хв дії на фільтрувальний папір утворює 1 мг редукуючих цукрів. При визначені екзо-1,4-β-D-глюканазної активності субстратом слугував авіцел, 50 мг якого інкубували у 1 мл 0,05 Μ натрій-цитратного буферу протягом 1 год. за температури 50 °C. Залишки редукуючих вуглеводів визначали методом Сомоджи-Нельсона [6]. За одиницю екзоглюканазної активності приймали активність такої кількості ферменту, яка за 30 хв дії на субстрат (авіцел) утворює 1 мг редукуючих цукрів. Субстратом при визначенні ендо-1,4-β-D-глюканазної активності була КМ-целюлоза: 0,5 мл 1 % розчину NaKMЦ, у 0,05 Μ натрій-цитратному буфері та 0,5 мл фільтрату культуральної рідини гриба інкубували протягом 30 хв. за температури 50 °C [1]. Залишки редукуючих вуглеводів визначали методом Сомоджи-Нельсона [6]. За одиницю ендоглюканазної активності приймали активність такої кількості ферменту, яка за 30 хв. дії на субстрат (КМ-целюлозу) утворює 1 мг редукуючих цукрів. β-глюкозидазну активність визначали за початковою швидкістю накопичення глюкози при гідролізі целобіози. Концентрацію глюкози встановлювали за допомогою глюкозооксидазнопероксидазного методу [7]. Характеристика целюлазного ферментного комплексу гриба Chaetomium globosum 377 наведена у табл. 1, з якої видно, що зазначений штам характеризується значною загальною целюлазною активністю, а також високою екзо-1,4-β-D-глюканазною, ендо-1,4-β-D-глюканазною та β-глюкозидазною активністю. В лабораторному досліді вивчали також здатність гриба розкладати солому пшениці озимої. Одержані результати показали, що за 21 день маса соломи під впливом Chaetomium globosum 377 зменшилась на 31,5 відсотка, тобто зазначений гриб активно впливає на процес деструкції пшеничної соломи. Приклад 2. Польовий дослід з кукурудзою було проведено на дерново-середньопідзолистому ґрунті. Вміст гумусу 1,2 (за Тюріним), рухомого азоту 5,0-6,0 мг/100 г ґрунту (за Тюріним і Кононовою), фосфору 11-12 мг/100 г ґрунту (за Чіріковим), калію 12-13 мг/100 г ґрунту (за Кірсановим), кислотність рН 6,0. У досліді використано гібрид кукурудзи Кремінь 200 СВ. Схема досліду: 1 - контроль; 2 - внесення соломи; 3 - внесення соломи, обробленої грибом 5 С. globosum 377 (2×10 КУО на 1 г соломи). Під осінню оранку вносили солому та азотні добрива (аміачну селітру) з розрахунку 15 кг/га діючої речовини на 1 т соломи. Як свідчать одержані у польовому досліді дані (табл. 2), наявність в ґрунті надлишку органічної речовини призводила до зменшення врожаю кукурудзи на 14,7 % у порівнянні з контрольним варіантом. Використання С. globosum 377 сприяло прискоренню процесів мінералізації соломи, при цьому врожай культури зростав на 27,6 % щодо варіанта з внесенням соломи і на 8,8 % у порівнянні з контролем. Таким чином, штам С. globosum 377 є активним продуцентом целюлозолітичних ферментів, здатен розкладати пшеничну солому і сприяти підвищенню урожаю кукурудзи. Таблиця 1 Характеристика целюлазного ферментного комплексу гриба Chaetomium globosum 377 Ферментативна активність, од.* Фермент Ендоглюканаза (ендо-1,4-β-D-глюканаза, ендоцелюлаза) Екзоглюканаза (екзо-1,4-β-D-глюканаза, екзоцелюлаза, авіцелаза) β-Глюкозидаза (целобіаза) Загальна целюлазна активність КМ-целюлаза, целобіогідралаза, 1,25±0,039 1,21±0,038 1,05±0,060 1,08±0,063 * - одиницею ферментативної активності вважалася активність такої кількості ферменту, яка за 30 хв дії на субстрат утворює 1 мг редукуючих цукрів. 2 UA 95427 U Таблиця 2 Вплив Chaetomium globosum 377 на урожайність зерна кукурудзи гібриду Кремінь 200 СВ у польовому досліді (вологість зерна - 14 %) Варіант досліду Урожай, т/га Контроль (без внесення соломи і гриба) Внесення соломи Внесення соломи + Chaetomium globosum 377 ΗΙΡ05 5 10 15 20 25 "+" чи "-" до контролю т/га % 7,26 6,19 -1,07 -14,7 7,90 +0,64 +8,8 "+" чи "-" до варіанта з соломою т/га % +1,07 +14,7 +1,71 +27,6 0,32 Джерела інформації: 6 1. Пат. 2029784 Российская Федерация, МПК С12Р21/00, C12N9/14, C12N1/14, C12R1:66. Штамм гриба Aspergillus species - продуцент белка и целлюлаз / Назаренко А.В., Соколов В.Н., Соколова Л.Н., Гинак А.И.; заявитель и патентообладатель Санкт-Петербургский технологический институт им. Ленсовета. - № 5031953/13; заявл. 12.03.1992; опубл. 27.02.1995. 2. Пат. 2361918 Российская Федерация, МПК 2006.01 C12N9/42, С12Р19/00, C12R1/80. Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum - продуцент комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы и способ получения ферментного препарата комплекса целлюлаз, ксиланазы и ксилоглюканазы для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы / Синицын А.П., Окунев О.Н., Черноглазов В.М., Синицына О.А., Попов В.О.; заявитель и патентообладатель ООО Научно-производственная компания "Фермтек". - № 2008106829/13; заявл. 26.02.2008; опубл. 20.07.2009. 3. Пат. 2361915 Российская Федерация, МПК 2006.01 C12N1/14, C12N9/42. Штамм мицелиального гриба Myceliophthora fergusii - продуцент нейтральных целлюлазы, бетаглюканазы и ксиланазы / Синицын А.П., Окунев О.Н., Черноглазов В.М., Цурикова Н.В., Новожилов Н.В., Синицына О.А.; заявитель и патентообладатель ООО НПК "Фермтек". - № 2008101252/13; заявл. 21.01.2008; опубл. 20.07.2009. 4. Анкудимова Н.В. Целлюлазный комплекс Chaetomium cellulolyticum: выделение и свойства основных компонентов / Н.В. Анкудимова, В.А. Баразненок, Е.Г. Беккер, О.Н. Окунев // Биохимия. - 1999. - Т. 64, вып. 9. - С. 1267-1273. 5. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов / Т.С. Кириленко. - Киев.: Наука думка, 1978. - 263 с. 6. Somogyi Μ. Notes on sugar determination // J. Biol. Chem. - 1952. - V. 6. - P. 17-23. 7. Методы экспериментальной микологии: Справочник / Под ред. В.И. Билай. - К.: Наук, думка, 1982. - 549 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 Природний штам гриба Chaetomium globosum 377, депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером F-100063, призначений для одержання комплексу целюлаз з метою розкладання рослинних решток і підвищення урожайності сільськогосподарських культур. 35 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3