Штам гриба тніеlаvіа теrrеsтrіs /аріnіs/ маllосн ет cain, 258 – продуцент целюлазного комплексу с нуклеодеполімеразною активністю

Штамм гриба Thielavla terrestrls (Aptnis) Malloch et Cain, 258 (коллекция отдела физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины, коллекционный номер-258)-продуцент целлюлазного комплекса с нуклеоде: полимеразной активностью. Целлюлоза, составляющая треть растительной ткани, является одним из возобновляемых источников углерода [1, 2]. Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляется цел л юл азами и имеет ряд преимуществ перед химическим гидролизом [2, 3]. Его эффективность в основном обуславливается активностью компонентов целлюлазного комплекса, в том числе эндоглюканаз неупорядоченно воздействующих на внутренние /М,4-связи [4] и экзоглюканаз. Биоконверсия целлюлозосодержащего сырья (например, соломы) в значительной степени зависит от активности эндо- и экзоглюканаз [2], биосинтез которых продуцентом происходит под влиянием индуктора целлюлозы. го ю 22477 В то же время использование целлюлаз при силосовании и облагораживании грубых кормов облегчает гидролиз растительных материалов и увеличивает их переваримость [12]. 5 Обсуждается также возможность использования штаммов грибов с повышенным синтезом целлюлаз при глубинном культивировании на среде, содержащей пшеничную солому (2%), для прямой фер- 10 ментации целлюлозных материалов в этанол [5]. Среди требований, предъявляемых к ферментам целлюлазного комплекса (цит. по [6Р особая роль принадлежит стабильно- 15 сти целлюлаз при температурах порядка 65°С, так как это позволяет интенсифицировать процесс гидролиза и в значительной мере снять проблему стерильности, К сожалению, традиционные промышленные про- 20 дуценты - лизофильные микромицеты секретируют ферменты целлюлазного комплекса, с термостабильностью, недостаточной для их использования выше 60°С [6]. Поэтому понятен интерес биотехноло- 25 гов к термофильным и термотолерантным продуцентам целлюлаз, синтезирующих, как правило, термостабильные ферменты. Внеклеточные нуклеодеполимеразы грибов выполняют экстраклеточную пище- 30 варительную функцию [7], проявляют противовирусную активность, благоприятствуют утилизации субстратов и способствуют накоплению белка, Известными продуцентами комплекса 35 целлюлолитических ферментов являются представители родов: Aspergillus, например, Aspergillus terreus [8], Aspergillus niger [9]; PenlcilHum в частности Penicilllum plnophiium (funlculosum) [4]; Humlcola- 40 Humlcola Insolens [9]; Geotrichum-Geotrlhum candidum [9] и др. Однако, при характеристике, указанных продуцентов целлюлаз нуклеодеполимеразная активность у них не фиксируется. 45 Большинство известных в настоящее время продуцентов целлюлолитических ферментов принадлежит к роду Trichoderma [2. 10,11]. 50 Известен продуцент целлюлаз - мутантный штамм гриба Trichoderma reesei [10], синтезирующий комплекс целлюлаз с незначительной целлобиазной активностью при культивировании на гидролизатах пше- 55 ничной соломы. Однако у наиболее активного варианта гриба образование такого компонента комплекса как эндо-1,4 - глюконаза повысилось после мутагенной обработки только на 45%. Недостаток штамма состоит в том, что он получен при помощи мутагенного воздействия следствием чего является неустойчивость его признаков, склонность к их реверсии, необходимость дорогостоящего поддержания стабильности его свойств. Наиболее близкий к предлагаемому продуцент целлюлаз Trichoderma lignorum штамм 88; селекционированный в Институте микробиологии и вирусологии АН Украины [12, 13]. Однако серьезным недостатком как самого штамма, так и представителей всего рода грибов Trichoderma, является способность к обильному спорообразованию, что приводит к загрязнению окружающей среды, к аллергическим заболеваниям у людей. К недостаткам штамма Trichoderma lignorum 88 следует также отнести сравнительно низкие величины активностей эндои экзоглюканаз, отсутствие нуклеодеполимеразной активности, узкий диапазон температурных границ роста по сравнению с предлагаемым. Будучи мезофильной культурой, Trichoderma lignorum 88 уступает предлагаемому в способности к росту при повышенных температурах. Задача изобретения - получение нового штамма гриба - продуцента целлюлазного комплекса с высоким выходом эндо- и экзонуклеаз, обладающего нуклеодеполимеразной активностью и растущего в широком диапазоне температур. Поставленная задача решается тем, что в качестве продуцента целлюлазного комплекса с нуклеодеполимеразной активностью используется штамм термофильного гриба Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258. Штамм гриба Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258 выделен в отделе физиологии и систематики микромицетов ИВМ АН Украины в 1993 году В. А. Захарченко из древесных отходов. Штамм многократно пассировался на субстрате, содержащем солому, а наиболее активные варианты по эндо- и экзонуклеазе, обладающие нуклеодеполимеразной активностью, пересевались на сусло-агаровые косяки. Культура обладает стабилизированной устойчивостью по активности вышеназванных ферментов. Штамм хранится в коллекции культур отдела физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины под № 258. Штамм гриба Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258 характеризуется более высокими по сравнению с прототипом вели 22477 чинами активности эндоглюканазы 1 (в 2,53,0 раза), эндоглюканазы If (в 2 раза), экзоглюканазы (в 2,2 раза). Разнообразные целлюлозосодержащие субстраты оказывают селективное воздейст- 5 вие на активность отдельных компонентов целлюлаз. Одно из преимуществ заявляемого гриба заключается в том, что активность синтезируемых им компонентов целлюлолити- 10 ческого комплекса, включая целлобиазу, варьирует в зависимости от среды культивирования. Будучи способным к синтезу активных эндо- и экзоглюканаз, обладая нуклеодепо- 15 лимеразной активностью, заявляемый продуцент отличается специфичностью по отношению к ферментативному гидролизу соломы, что выражается в интенсивном росте на указанном субстрате с образованием 20 значительного количества белка (сырого протеина до 10-15 г/л). Штамм Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258 характеризуется следующими культурально-морфологическими и 25 физиолого-биохимическими свойствами. Культурально-морфологические особенности. Штамм Thielavia Terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258 атоксичный, термофиль- ЗО ный, быстро растущий, образует хорошее конидиальное спороношение типа Acremonium при выращивании на агаризованных средах. На агаризованном пивном сусле на 7-й 35 день роста при 42°С колонии достигают 78 мм в диапазоне хлопьевидно-пушистые, белые, светло-серые, с нижней стороны светло-соломенные до светло-коричневых. Гифы мицелия неокрашенные, септиро- 40 ванные, до 3,5 мкм толщиной. Фиалиды лотеральные или терминальные на гифах, с поперечной перегородкой или без нее, иногда вздутые в базальной части, сужены к верхушке, простые или слаборазветвленные, 45 8-20x2-3 мкм. Конидии обратно яйцевидные до продолговато-цилиндрических, с усеченным основанием, 3,0-4,5x1,8-2,5 мкм, гладкие, неокрашенные, в цепочках, сплющиваю- 50 щихся в головки. Штамм хорошо растет и спороносит на искусственных и синтетических агаризованных питательных средах (крахмально-дрожжевом агаре, видоизмененной агаризован- 55 ной среде Чапека с пептоном вместо ІМаІМОз, картофельно-глюкозном, сусловом агаре, агаре Сабуро). Колонии на большинстве изученных сред высокопушистые, белые на среде Сабу ро - с образованием чередующихся секторов с хорошо развитым воздушным и субстратным мицелием. На агаризованной среде Чапека колонии тонкие со слаборазвитым воздушным мицелием, на картофельном агаре - слабый рост с образованием погруженного мицелия. На агаризованных средах с добавлением целлюлозосодержащих субстратов (соломы, Na-КМЩ- колонию войлочно-пушистые с обильным конидиеобразованием (14-16) (рис. 1). Физиолого-биологические свойства гриба Thielavia terrestris (Apinis) МаЛосп et Cain, 258. Отношение к источнику углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, рамнозу, сахарозу, крахмал. Целлюлозу гидрол изует. Усваивает янтарную и яблочные кислоты. Усваивает сорбит, маннит. В качестве источника азота использует пептон, аммонийный азот, нитраты. Протеолитическая и -амилазная активности обнаружены в следовых количествах; пектолитическая и липолитическая активности отсутствуют. Аэроб, атоксичный, быстрорастущий, термофил. Температурный диапазон роста культуры от 22 до 55°С с оптимумом для роста - при 42-45°С, для конидиеобразования - при 37°С, для синтеза комплекса целлюлаз - около 40°С. Штамм является адаптивным природным мутантом, характеризуется повышенной способностью к биосинтезу целлюлазного комплекса и его ведущих компонентов эндо- и экзоглюканаз -, обладает нуклеодеполимеразной активностью, трансформируя природные трудноразлагаемые целлюлозосодержащие субстраты (например, солому), образует белок (сырого протеина - до 10-15 г/л). Благодаря наличию нуклеодеполимеразной активности, а также способности штамма к оптимальному росту и развитию при повышенной температуре, снижается вероятность заражения среды посторонней микрофлорой, что особенно важно в случае использования продуцента при приготовлении кормовых смесей в животноводстве. Штамм получен методом накопительной культуры. Штамм хранится в пробирках на скошенных агаризованных средах; на фильтровальной бумаге, на зерне с периодическим пересевом 2 раза в год; пересевается на твердые питательные среды (сусло-агар, крахмально-дрожжевой агар, картофельноглюкозный агар). 22477 ПДК в воздухе рабочей зоны около 0,3 мг/м . (Культура депонирована в коллекции чистых культур отдела физиологии и систематики микромицетов ИМВ АН Украины под номером 258). 5 Данные по активности компонентов целлюлазного комплекса (ед/мл) у заявляемого штамма в сравнении с известным при росте грибов-продуцентов на минеральной среде с 1% пшеничной соломы в условиях 10 глубинного культивирования приведены в таблице. Максимум образования комплекса целлюлаз в культуральной жидкости Thielavia terrestris (Apinls) Malloch et Cain, 258 на жид- 15 кой минеральной среде с пшеничной соломой в качестве индуктора ферментов отмечен на 36-ом часу глубинного культивирования (рис. 2); нуклеодеполимеразная активность, достигнув максимума к 48-ому 20 часу культивирования (500 ед/мл) к 72-ому часу плавно снижается (до 300 ед.-мл). Максимум биомассы достигается к 72-ому часу культивирования. Внеклеточную целлюлолитическую ак- 25 тивность определяли согласно [17]. Активность осахаривающей эндоглюканазы 1 /КФ 3.2.1.4,1.4 (1,3:1,4) -Д-гл юкан-4 глюканогидролазы) определяли по методу Логиновой с сотр. [18]. В качестве субстрата использова- 30 ли КМЦ (1%-ный раствор) степень замещения 180-200. За единицу активности принимали количество фермента, которое за 30 мин, действия на КМЦ при температуре 50°С и рН 5,0 образует 1 мг глюкозы за 1 35 мин (метод Сомоджи-Нельсона [18]. Активность разжижающей эндоглюканазы И определяли вискозиметрически (субстрат 0,45%-ный раствор КМЦ средней вязкости). Активность зндоглюканазы II вы- 40 ражали в микромолях глюкозидиых связей, расщепленных под действием фермента за 1 мин (18). Активность экзоглюканазы (КФ 3.2.191, 1,4- Д-глюканцеллобиогидролазы) определяли методом Мандельс-Вебера [18]. 45 В качестве субстрата использовали фильтровальную бумагу. За единицу активности принимали количество фермента, которое в стандартных условиях за 1 мин образует 1 мг глюкозы, определяемой методом Со- 50 моджи-Нельсона. Активность целлобиазы (КФ) 3.2.1.2.1, Д-глюкозид-глюкогидролазы) определяли по способности фермента гидролизовать целлобиозу (глюкоза определяется глюкозо- 55 оксидазно-пероксидазным методом [18]. За единицу активности принимали количество фермента, которое в стандартных условиях вызывает образование 1 мг глюкозы за 1 мин. 8 Содержание сырого протеина определяли согласно [19]. П р и м е р 1 Для получения посевного материала (инокулюма) культуру гриба Thielavia terrestris (Apinis) Malloch et Cain, 258 выращивают глубинным способом при 40 ± 1°С в колбах объемом 750 мл на качалках с 220 об/мин в течение 24 час. на минеральной среде состава, О: сахар - 2,0; аммоний азотнокислый - 0,2; калий фосфорнокислый однозамещеиный - 0,1; калий хлористый - 01; кальций углекислый - 0,05; магний сернокислый - 0,1; вытяжка из пшеничных отрубей - 10: Ферментационную среду состава, %: солома - 1,0; аммоний азотнокислый - 0,2; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1; калий хлористый 0,1, кальций углекислый - 0,05; магний сернокислый - 0,1, засеянную 10% инокулюма культивируют глубинным способом при 40 ± 1°С в течение 36 час в колбах объемом 750 мл на качалке с 220 об/мин или в производственных ферментерах при 40 ± 1°С со скоростью вращения мешалки 200 об/мин и аэрацией 1,0 объема воздуха на 1 л среды в 1 мин. Культуральный фильтрат отделяют от биомассы центрифугированием или сепарацией. При этом величины активности компонентов целлюлолитического комплекса составляют, ед/мл: экзоглюканазы - 2.0; эндоглюканазы 1-8,2; эндоглюканазы II - 38; целлобиазы - 1,8. Осаждение фермента из культуральной жидкости проводят на холоде сульфатом аммония при 70%-ом насыщении (либо тремя объемами ацетона). Осадок сепарируют и ставят на диализ против дистиллированной воды (либо сушат). После обессоливания сушат лиофильно. Величины активности компонентов целлюлазного комплекса' ферментного препарата составляют: экзоглюканазы - 1500 ед/г; эндоглюканазы I 6500 ед/г; эндоглюканазы II - 32000 ед/г: целлобиазы - 1000 ед/г. Для получения биомассы с содержанием сырого протеина около 15 г/л гриб выращивают в течение 72 час. П р и м е р 2. Посевной материал (инокулюм) готовят аналогично примеру 1. Ферментационную среду состава, %: солома 2,0; аммоний азотнокислый - 0,2; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,1; калий хлористый - 0,1; кальций углекислый - 0,05; магний сернокислый - 0,1, засеянную 10-ью Уоинокулюма, культивируют глубинным способом при 40 ± 1 °С в течение 36 час в колбах 750 мл на качалке с 220 об/мин или в производственных ферментерах при 40 ± 1°С со 22477 скоростью вращения мешалки 200 об/мин и аэрацией 1 объем воздуха на 1 л среды в 1 мин Культуральный фильтрат отделяют от биомассы центрифугированием или сепарацией При этом величины активности компо- 5 нентов целлюлолитического комплекса составляют, ед/мл: экзоглюканазы - 2,5; эндоглюканззы 1-10; эндоглюканазы II - 40; целлобиазы - 2,0. Осаждение фермента из культуральной 10 жидкости проводят на холоду сульфатом аммония при 70%-ом насыщении (либо тремя объемами ацетона). Осадок сепарируют и ставят на диализ против дистиллированной воды (либо сушат). После обессоливания су- 15 шат лиофильно. Величины активности компонентов целлюлазного комплекса ферментного препарата составляют: экзоглюканазы - 1800 ед/r; эндоглюканазы I 8000 ед/г; эндоглюканазы II - 35000 ед/г; 20 целлобиазы - 1200 ед/г. Для получения биомассы с содержанием сырого протеина около 15 г/л гриб выращивают в течение 72 часов. Штамм гриба Thlelavla terrestris (Apfnis) 25 Malloch et Cain, 258 проверен на токсичность в Украинском научно-исследовательском Институте экогигиены и токсикологии химических веществ. Штамм гриба Thlelavla terrestris (Aplnls) 30 Malloch et Cain, 258 с повышенной способностью к биосинтезу ведущих компонентов целлюлазного комплекса - эндо- и экзоглюканаз, обладающий нуклеодеполимеразной активностью, представляет собой новую 35 культуру гриба, перспективную для промышленного производства, которую можно будет использовать в качестве продуцента целлюлаз для биоконверсии целлюлозосодержащего сырья. 40 Источники информации: (56) 1. Entrl Т. М., Markkaanen P. Production of cellulolytik enzymes by fungi. - Adv. Biochem. Eng., 1977, 5, p. 1-24 2. Кастельянос П. С. Окунев О. Н. Под- 45 бор штаммов-продуцентов целлобиаз и оптимизация питательной среды для биосинтеза культурами Aspergillus nlger, Прикл. биохимия и микробиология, 1986, т. 22, вып. 1, с. 80-85. 50 3. Wood Т. М. Cellulase mechanisms. Biodeteriorat. Symp , Cambridge, 6-11 Sept, 1987. - London, New York. 1988. - p. 333-346. 4. Bhat K. M., Mc-Crae S. I. Wood Т. М. Characterization of the major endo-1,4- -D- 55 glucanases from the cellulase of Penlcllllum pinophllum/ funiculosum, - Biochem. Soc. Trans. - 1989. - 17,1, p. 103-104. 5. Macriz В І., Christakopoulos P., Kekos D., Evangelidou X Enchanced cellulase 10 activities of Fusarlum oxysporum grown on straw for ethanol production. - Blomass Energy and Ind.: Proc. Int. Cons., Orleans, 11-15 May, 1987. - London, New York, 1987, p. 699-703. 6. Клесов А. А. и др. Биотехнология. 1987, т. 3, 2, с. 162-168. 7. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М м "Наука", 1979, с. 1-294. 8. Горкича Н. Б., Луста К. А., Хромина С. И,, Фихте Б. А. Продукция целлюлаз грибов Asperglllus terreus 17 Р, иммобилизированным на композитных носителях. Биотехнология. - 1991, 1, с. 61-64. 9. Родионова Н. А., Капрельянц Л. В., Середницкий П. В., Килимник А. Ю. Гемицеллюлозы зерна злаков и ферменты, катализирующие их расщепление (Обзор). Прикл. биохимия и микробиол., 1992, т. 28, вып. 5, с. 645-665. 10. Szczodrak lanusz, The use of cellulases from a Д-glucosidase ™ hyperproducing mutant of Trichoderma reesel In simultaneous saccharlfication end fermentation of wheat straw. - Biotechnol. and Bioeng. ~ 1989. 33,9, p. 1112-1116. 11. Sternberg D. Production of cellufase. by Trichoderma. - In: Enzimatlc conversion of cellulose materials: Technology and applications. - Biotechnol. Symp., 6/Eds.. Gaden et at,, New York, London, Wiley, 1976» p. 35-53. 12. Стрижевская А. Я., Мусич Е. Г., Дреймане М. А. и др. Образование целлюлозолитических ферментов грибами. Микробиол. журн., 1983-45, 2, с. 34-37. 13. Билай Т. И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. - Киев, Наукова думка, 1985, с. 171. 14. Билай Т. И., Захарченко В. А. Определитель термофильных грибов. - Киев, Наукова думка, 1987, с. 57-59. 15,ArxJ. A. On Thlelavla end some similar geneva of Ascomycetes. 11. Stud. Mycol. 1975. -Nfe 8. - P . 1-29. 16. Tansey M. R. Observation on the thermophillc ascomycete Thlelavla terrestris. II Trans. Brit. Mycol. Soc. - 1977- 69, № 3, P. 417-423. 17. Синицын А. П., Черноглазое В. М. Гусаков А. В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. (Итоги науки и техн. Сер. биотехнол.) ВИНИТИ, 1990, 25, с. 3-147. 18. Сивере В. С, Мусич Е. Г., Лизак Ю. В. Определение активности целлюлаз. - В кн.: Методы экспериментальной микологии.Справочник. Киев, Наукова думка, 1982, с. 180-187. 22477 11 19. Fahrich. P., Jrrgang K. Cellulase and protein production by Chaetomium, cellul&lyticunrv strains grown on cellulosic substrates. - Biotechnol. Zett., 1981, 3, № 5, p. 201-206; 12 20. Тихомиров Д. Ф., Столбова В. В., Светличный В. А., Клесов А. А. Высокотермостабильный целлюлазный комплекс новой экстремально термофильной бактерии. Прикл. биохим. и микробиол., 1992, том 28, вып. 3. с. 339-347. Активность компонентов целлюлазного комплекса (ед./мл) при росте грибов-продуцентов на синтетической среде с 1 % пшеничной соломы в условиях глубинного культивирования Активности Название гриба Экзоглюканаза Trichoderma lignorum 88 Thielavia terrestris 258 Эндоглюканаза I Эндоглюканаза I! Целлобиаза 1,2 2,9 22 10,8 2,0-2,5 8,2-10,0 38-40 1,8-2,0 Рис. I 22477 6 100 __ _ d 80 о 60 о я _ s • /' / ' У- '/ §40 : со Я «20 о о я Е-* о 0 А // / /• • ** / # / ' / * / // // / ' ' / ' // М? _ ж .....5 • У ••' • 0 12 24 36 48 60 72 Время культивирования, чес. Условные обозначения: I - экзоглюканаза, 2 - эндоглюканаза I , 3 - 9НД0ГЛЮК8НЄ38 II, 4 - ЦЄЛЛО(5И838, 5 НуКЛЄ0ДЄП0ЛИМЄр838 f 6 - белок (сырой протеин). Рис.2 Упорядник Замовлення 4489 Техред М.Келемеш Коректор О.Кравцова Тираж Підписне Державне патентне відомство УкраТни, 254655. ГСП, КиТв-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.Гагаріна, 101