Штам гриба penicillium roseopurpureum – продуцент курвуларину

Реферат: Винахід належить до галузі мікробіології і стосується отримання нового штаму гриба Penicillium roseopurpureum, який може бути використаний для отримання мікотоксину (вторинного метаболіту) курвуларину, що в складі препаратів з фунгіцидною активністю застосовується з UA 100804 C2 (12) UA 100804 C2 метою профілактики і захисту лікарських рослин, садових, декоративних та інших сільськогосподарських культур від хвороб. Штам Penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларину, депонований у депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України за реєстраційним номером IMB F-100055. Ін.п. ф-ли. UA 100804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі мікробіології і стосується отримання нового штаму гриба Penicillium roseopurpureum, який може бути використаний для отримання мікотоксину (вторинного метаболіту) курвуларину, що в складі препаратів з фунгіцидною активністю застосовується з метою профілактики і захисту лікарських рослин, садових, декоративних та інших сільськогосподарських культур від хвороб. Відомі штами Penicillium citreo-viride, Penicillium baradicum та ряд інших видів штамів продуцентів курвуларину. (Vesonder R. F., Ciegler Α., Fennell D., Tjarks L. W., Jensen A. H. Curvularin from Penicillium baradicum baghdadi NRRL 3754, and biological effects. // Journal of environmental science and health. J Environ Sci Health Part В Pestic Food Contam Agric Wastes 1976, 11 (4) p. 289-297; S. Kosemura-Meroterpenoids From Penicillium citreo-viride B. IFO 4692 and 6200 Hybrid // Tetrahedron, 2003, v. 59, № 27, pp. 5055-5072. Відомі штами мають меншу спроможність до синтезу курвуларину та його похідного гідроксикурвуларину, а також характеризуються тим, що продукують, крім курвуларину, інші вторинні метаболіти, які є токсичними для ссавців, що обмежує можливість їх використання у захисті рослин. На сьогодні у сільськогосподарській мікробіології невідомі штами-продуценти курвуларину, що мають більш високу активність у готовому препараті і є не токсичними для ссавців. Найбільш близьким до запропонованого штаму є Penicillium citreo-viride (S. KosemuraMeroterpenoids From Penicillium citreo-viride B. IFO 4692 and 6200 Hybrid // Tetrahedron, 2003, v. 59, № 27, pp. 5055-5072), який крім курвуларину продукує вторинний метаболіт цитреовіридин токсичний для ссавців, що і перешкоджає його використанню у сільськогосподарському виробництві. В основу винаходу поставлена задача одержати штам гриба Penicillium roseopurpureum продуцента курвуларину, шляхом використання методів селективного відбору з природної популяції штаму, який, маючи спроможність до синтезу курвуларину та його похідного гідроксикурвуларину, характеризується тим, що не продукує, крім курвуларину інші метаболіти, це дозволяє при його використанні одержувати препарати для використання в екологічно чистих технологіях захисту рослин. Поставлена задача вирішується шляхом одержання нового штаму гриба Penicillium roseopurpureum - продуцента курвуларину, який виділено із епіфітної мікрофлори хризантем, гриб був ідентифікований як Penicillium roseopurpureum (Dierckx, 1901), секція Monoverticillata lanata, стандартним методом мікологічних досліджень, депонований в депозитарії Інституту мікробіології і вірусології імені Д. К. Заболотного НАН України під номером Penicillium roseopurpureum IMB F-100055 (22 березня 2010 року). В результаті серії відборів запропонований (депонований) штам набуває таких культурально-морфологічних ознак та фізіолого-біохімічних властивостей, які забезпечують продукування курвуларину, що не проявляє токсичні властивості по відношенню до ссавців і в складі препаратів захисту рослин є безпечним до навколишнього середовища. Отриманий штам має наступні культурально-морфологічні ознаки та фізіолого-біохімічні властивості. Культивується на середовищах Чапека, Ваксмана, картопляно-глюкозному агарі (КГА), сусло-агарі. Оптимальна температура культивування - +(25-28)°С. Найвища швидкість росту спостерігається на КГА (0,26 мм/годину), менша на сусло-агарі (0,21 мм/годину), найменша швидкість росту на середовищі Ваксмана (0,19 мм/годину). На середовищі Чапека колони ростуть найповільніше (швидкість росту становить 0,18 мм/годину). Колонії у центральній частині підвищені, борозенчасті, сірувато-білі, блідо-рожеві, сірувато-зелені до горіхово-зелених. Конідієносці короткі 50 × 1,5-2μ, відходять від галуження переплетених між собою повітряних гіф, іноді від занурених у агар гіф, тоді вони досягають до 100μ завдовжки, дуже рідко розгалужені, гладкостінні, на верхівці з моновертицилятними китичками, які складаються з 8-20 стеригм, 6-7 × 1,5-2μ. Конідії кулясті слабошорсткуваті 2-2,5μ, швидко відпадають від стеригм. Реверзум оранжево-червоний, яскраво рожевий або цегляного кольору; агар забарвлений у ті ж кольори, але менш інтенсивно. Оптимальна температура росту штаму +(25-28)°С, росте і при більш високих температурах до +32 °C і при низьких температурах до +5 °C. Оптимальна температура токсиноутворення + 26 °C. Найбільша активність штаму до тест культур (у тому числі і фітопатогенних організмів) спостерігається на 21 добу культивування на КГА (картопляно-глюкозному агарі). Отриманий штам добре засвоює глюкозу. Приклад № 1. 1 UA 100804 C2 5 10 15 20 25 30 Гриб Penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларину культивували в колбах Ерленмейєра об'ємом 700 мл, які містили 100 мл рідкого середовища Чапека з глюкозою (20 г/л) як єдиним джерелом вуглецю, впродовж 21 доби при температурі +(27-28)°С без доступу світла. З одержаних культуральних фільтратів цього гриба шляхом триразової екстракції хлороформом та наступним упарюванням екстрактів був отриманий маслянистий залишок, який після попередньої очистки від неполярних ліпідних домішок за допомогою рідина-рідинного перерозподілу (н-гескан-ацетонітрил), фракціонували з застосуванням колонкової хроматографії. Елюція з колонки засвідчила, що фракції №№ 7-10 (хлороформ) мають високу активність щодо індикаторних культур, а хроматографічно представлені однією плямою з Rf 0,56 (система бензол: етилацетат: метанол, 5:5:1). Ці фракції об'єднували і упарювали під зниженим тиском. Шляхом кристалізації з бензолу було одержано 82,6 мг сполуки білого кольору, яка була позначена як Рr 10. Вміст курвуларину визначали методом екстракції та колонкової хроматографії активних сполук / екстрагенти: хлороформ чи етилацетат; колонкова хроматографія: сорбент силікагель II ступеня активності за Брокманом (100/160 мкм); елюенти: н-гексан, хлороформ, ацетон та їх системи; кристалізації: з бензолу чи суміші метанол: н-гексан. Із одного кілограма субстрату після перерахованого вище токсиноутворення одержується курвуларину кількості 16 г\л. Досліджені фізико-хімічні і спектральні характеристики виділених сполук (t°C, UV- та ІЧспектри) дають підстави для ідентифікації їх з курвуларином та його похідним гідроксикурвуларином. Приклад № 2. Вміст курвуларину визначали по кристалічному виходу препарату. Після біосинтезу гриба продуцента на зерновому субстраті, виділення курвуларину із нативної культури проводили шляхом триразової екстракції хлороформом з наступним упарюванням. Виділення токсину із екстракту включало очистку шляхом рідина-рідинного перерозподілу в системі ацетонітрилгексан з наступною переекстракцією токсину в системи бензол: етилацетат: метанол (5:5:1) і толуол: ізопропанол: мурашина кислота (6:3:1), висушуванню, упарюванню, осадженню на мінімальний об'єм силікагелю і хроматографією на колонці. Вміст курвуларинмістких фракцій об'єднували і проводили кристалізацію мітотоксину при кімнатній температурі. Вихід курвуларину шляхом кристалізації з бензолу складає 82,6 мг, а гідроксикурвуларину 12,7 мг з 5 л культурального фільтрату гриба. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 Штам гриба Penicillium roseopurpureum - продуцент курвуларину, депонований у депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології імені Д.К. Заболотного НАН України за реєстраційним номером IMB F-100055. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2