Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів

Реферат: Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів включає підвищення цитотоксичної активності доксорубіцину та цисплатину за рахунок додавання інших сполук, здатних приводити до зниження експресії важких та легких ланцюгів феритину. Як допоміжну речовину використовують попередники мікроРНК133а та 200b. UA 98248 U (54) СПОСІБ ПОДОЛАННЯ ЛІКАРСЬКОЇ РЕЗИСТЕНТНОСТІ ДО ПРОТИПУХЛИННИХ ПРЕПАРАТІВ UA 98248 U UA 98248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медико-біологічних наук, а саме до експериментальної онкології. Однією з найбільших перешкод при лікуванні хворих на злоякісні новоутворення, в тому числі - на рак молочної залози (РМЗ), є лікарська резистентність пухлин до цитостатиків [1]. Відомо, що близько половини всіх злоякісних пухлин мають природну резистентність до певних груп протипухлинних препаратів, а у 40 % хворих після декількох курсів хіміотерапії розвивається набута резистентність до протипухлинних препаратів [2]. Наслідком цього є значне зниження ефективності цитостатиків на фоні сильного токсичного впливу на здорові тканини та органи. Дослідження останніх років відродили інтерес до ролі обміну ендогенного заліза в пухлинному процесі, що дозволяє розглядати його як перспективну мішень для лікування пацієнтів зі злоякісними новоутвореннями [3-5]. Встановлено, що клітини з фенотипом лікарської стійкості до протипухлинних препаратів характеризуються значним підвищенням рівня феритину [6]. Відомі способи подолання резистентності пухлин до цитостатиків за допомогою використання їх ліпосомальних форм [7], кон'югатів зі специфічними сполуками [8] або моноклональними антитілами [9]. Спільним недоліком усіх зазначених методів є складний і працемісткий синтез, а також можливість покращання протипухлинного ефекту лише одного препарату. Найбільш близьким аналогом способу, що заявляється, вибраним як прототип, є спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинного препарату "Доксорубіцин" [10], який передбачає підвищення його протипухлинної активності за рахунок використання 5[біс(гідроксифосфорил)метил]-25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену. Позитивним у прототипі є те, що додавання допоміжних сполук дозволяє підвищити цитотоксичну дію доксорубіцину щодо резистентних пухлинних клітин. Недоліком прототипу є те що синтез цієї речовини є багатостадійним і працемістким, а також неможливість за допомогою зазначеної сполуки подолати резистентність до цитостатиків з іншим механізмом дії. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів шляхом використання попередників мікроРНК133а або мікроРНК-200b (пре-мікроРНК-133а та пре-мікроРНК-200b, відповідно), що дасть змогу підвищити цитотоксичну дію доксорубіцину та цисплатину за рахунок зниження експресії важких та легких ланцюгів феритину. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів базується на визначенні експресії феритину та чутливості злоякісних клітин в системі in vitro до протипухлинних препаратів, і, у разі підвищеного рівня легких або важких ланцюгів феритину (більше 200 балів), клітини культивують з пре-мікроРНК133а або пре-мікроРНК-200b, після чого визначають чутливість пухлинних клітин до доксорубіцину та цисплатину. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак способу, що заявляється, та технічним результатом корисної моделі наступний. Застосування наведеного способу подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів дозволяє підвищити ефективність протипухлинної терапії з використанням доксорубіцину та цисплатину та знизити токсичне навантаження на організм у випадку розвитку у пухлини фенотипу лікарської резистентності до зазначених препаратів. Схема застосування способу, що заявляється Пухлинні клітини культивують у 96-лункових планшетах протягом 1 доби, після чого у лунки планшетів додають зростаючі концентрації цисплатину та доксорубіцину для визначення показників ІС50 цих препаратів за допомогою класичного МТТ-тесту. За допомогою імуноцитохімічного методу визначають рівень експресії важких та легких ланцюгів феритину. Для цього пухлинні клітини вирощують на покривних скельцях у культуральному середовищі протягом однієї доби, після чого фіксують в 4 % розчині параформальдегіду протягом 20 хв. Проникнення реагентів імуноцитохімічної реакції всередину клітини забезпечують шляхом їх обробки0,1 % розчином тритону X100 впродовж 10 хв. при температурі 37 °C. Для зменшення неспецифічного забарвлення клітини інкубують 30 хв. з 1 % розчином бичачого сироваткого альбуміну. Далі клітини інкубують з моноклональними антитілами специфічними до важких або легких ланцюгів феритину впродовж 1 години, після чого застосовують систему візуалізації EnVision (DakoCytomation, Данія), кон'юговану з пероксидазою. Через 30 хв. визначають активність ферменту із застосуванням як субстрату 3-аміно-9-етилкарбазолу. 1 UA 98248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Після проведення імуноцитохімічної реакції препарати промивають водою, дофарбовують гематоксиліном 1-2 хв. та поміщають у FaramountAqueousMountingMedium (DakoCytomation, Данія). Як позитивний контроль використовують моноклональні антитіла проти панцитокератинів, як негативний контроль замість моноклональних антитіл на клітини наносять забуферений фізіологічний розчин. Експресію білків визначають за методом H-Score [11]. Експресія вважається сильною, якщо значення H-Score більше 200. Надалі, у клітини додають пре-мікроРНК-133а (у випадку підвищеного рівня легких ланцюгів феритину) або пре-мікроРНК-200b (у випадку підвищеного рівня важких ланцюгів феритину) з використанням реагенту Lipofectamine 2000 за стандартним протоколом [12]. Після культивування клітин з пре-мікроРНК-133а або пре-мікроРНК-200b знову визначають рівень експресії важких і/або легких ланцюгів феритину та перевіряють чутливість клітин до доксорубіцину і цисплатину. Приклади практичного застосування способу Приклад 1. Резистентний варіант клітин РМЗ людини MCF-7/Dox отримано шляхом вирощування вихідних клітин MCF-7 у культуральному середовищі з додаванням наростаючих концентрацій доксорубіцину в діапазоні доз від 0,1 до 32 мкг/мл. Доксорубіцин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Величини ІС50 для клітин MCF-7 становили 0,5 мкг/мл доксорубіцину, а для MCF-7/Dox - 8 мкг/мл доксорубіцину, що відповідає рівню 16 резистентності до цитотоксичної дії доксорубіцину [13]. Імуноцитохімічне дослідження експресії феритину показало, що, на відміну від клітин чутливої лінії, в переважній більшості клітин MCF-7/Dox експресія легких ланцюгів цього білка підвищена (195,4±3,8 та 276±2,1 одиниць H-Score, відповідно). Надалі клітини резистентної лінії MCF-7/Dox культивували з Lipofectamine 2000 та премікроРНК-133а, після чого за допомогою імуноцитохімічного методу виявили зниження експресії легких ланцюгів феритину (до 200,1±3,2 одиниць H-Score). МТТ-тест показав зниження ІС50 доксорубіцину на 82 % та цисплатину на 15 %. Приклад 2. Резистентний варіант клітин РМЗ людини MCF-7/CP було отримано шляхом вирощування вихідних клітин MCF-7 у культуральному середовищі з додаванням наростаючих концентрацій цисплатину в діапазоні доз від 0,01 до 6 мкг/мл. Цисплатин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Величини ІС 50 для клітин MCF-7 становили 0,25 мкг/мл цисплатину та для MCF-7/CP-1 мкг/мл цисплатину, що відповідає рівню 4 резистентності до цитотоксичної дії цисплатину [13]. Імуноцитохімічне дослідження експресії феритину показало, що на відміну від клітин чутливої лінії, в переважній більшості клітин MCF-7/CP спостерігали підвищену експресію важких ланцюгів цього білка (125,5±2,7 та 220,9±6,1 одиниць H-Score, відповідно). Надалі клітини резистентної лінії MCF-7/CP культивували з Lipofectamine 2000 та премікроРНК-200b, після чого за допомогою імуноцитохімічного методу виявили зниження експресії важких ланцюгів феритину до 133,8±2,7 одиниць H-Score). МТТ-тест показав зниження ІС50 цисплатину на 63 % та доксорубіцину на 22 %. Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє оптимізувати схеми лікування хворих за рахунок підвищення ефективності протипухлинної терапії з використанням доксорубіцину та цисплатину та знизити токсичне навантаження на організм у випадку розвитку у пухлини фенотипу лікарської резистентності до зазначених препаратів. Джерела інформації: 1. Kasper М, Toftgard R. Smoothing out drug resistance // Cancer Cel. - 2013. - Vol. 23, N1. - P. 3-5. 2. Gottesman, M.M. Mechanisms of cancer drug resistance // Annual Rev. med. - 2002. - Vol. 53, N1. - P. 615-627. 3. Torti S.V., Torti F.M. Iron and cancer: more ore to be mined // Nature Rev. Cancer. - 2013. Vol. 13. - P. 342-355. 4. Callens C, Coulon S., Naudin J. et al. Targeting iron homeostasis induces cellular differentiation and synergizes with differentiating agents in acute myeloid leukemia // J Exp Med. - 2010. - Vol. 207, N 4. - P. 731-750. 5. Чехун В.Ф. Создание новых лекарственных форм на основе нанокомпозитных материалов для решения современных проблем онкологии // Наносистеми, наноматеріали, нанотехнології. - 2011. - Т. 9, № 1. - С. 261-274. 6. Чехун В.Ф., Лук'янова Н.Ю., Бєздєнєжних Н.О. та ін. Особливості експресії білківрегуляторів обміну заліза у чутливих та резистентних до протипухлинних препаратів клітинах раку молочної залози в системі in vitro // Клиническая онкология. - 2011. - Спец. вып. II. - С. 227. 2 UA 98248 U 5 10 15 7. Riganti С., Voena С., Kopecka J. et al. Liposome-encapsulated doxorubicin reverses drug resistance by inhibiting P-glycoprotein in human cancer cells // Molecular pharmaceutics. - 2011. Vol. 8, N 3. - P. 683-700. 8. Hu C.M.J., Zhang L. Nanoparticle-based combination therapy toward overcoming drug resistance in cancer // Biochem. Pharmacol. - 2012. - Vol. 83, N8. - P. 1104-1111. 9. Goldmacher V.S., Kovtun Y.V. Antibody-drug conjugates: using monoclonal antibodies for delivery of cytotoxic payloads to cancer cells // Ther. Delivery. - 2011. - Vol. 2, N 3. - P. 397-416. 10. Пат. 50922 UA, МПК А61Р 35/00. Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинного препарату "Доксорубіцин" / Чехун В.Ф., Лук'янова Н.Ю., Демаш Д.В. та ін., Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. - З. № u200913933; заявл. 30.12.09; опубл. 25.06.10, Бюл. № 12. 11. Pierceall W.E., Wolfe M., Suschak J. et al. Strategies for H-score normalization of preanalytical technical variables with potential utility to immunohistochemical-based biomarker quantitation in therapeutic response diagnostics // Anal. Cell. Pathol. - 2011. - Vol. 34, N 3. - P. 159168. 12. Su J., Zhang A., Shi Z. et al. MicroRNA-200a suppresses the Wnt/-catenin signaling pathway by interacting with -catenin // Int. J.Oncol. - 2012. - Vol. 40, N 4. - P. 1162-1170. 13. Lukyanova N.Yu., Rusetskaya N.V., Tregubova N.A. Molecular profile and cell cycle in MCF-7 cells resistant to cisplatin and doxorubicin // Exp. Oncology. - 2009. - Vol. 31, N 2. - P. 87-91. 20 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинних препаратів, що включає підвищення цитотоксичної активності доксорубіцину та цисплатину за рахунок додавання інших сполук, здатних приводити до зниження експресії важких та легких ланцюгів феритину, який відрізняється тим, що як допоміжну речовину використовують попередники мікроРНК133а та 200b. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3