Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинного препарату “доксорубіцин”

Спосіб подолання лікарської резистентності до протипухлинного препарату "Доксорубіцин", що включає підвищення цитотоксичної активності доксорубіцину за рахунок додавання інших сполук, здатних взаємодіяти з Р-глікопротеїном, який відрізняється тим, що як допоміжну речовину використовують 5-[біс(дигідроксифосфорил)метил]25,27-дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арен. (19) (21) u200913933 (22) 30.12.2009 (24) 25.06.2010 (46) 25.06.2010, Бюл.№ 12, 2010 р. (72) ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ, ЛУК'ЯНОВА НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, ДЕМАШ ДМИТРО ВАЛЕРІЙОВИЧ, ЧЕРЕНОК СЕРГІЙ ОЛЕКСІЙОВИЧ, КАЛЬЧЕНКО ВІТАЛІЙ ІВАНОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕ 3 візуалізації EnVision (DakoCytomation, Данія), кон'юговану з лужною фосфатазою або пероксидазою. Через 30 хвилин проводять виявлення активності ферменту за допомогою модифікованого методу за Graham, Karnovsky [6] із застосуванням в якості субстратів ДАБ (3,3-діамінобензидину солянокислого) або 3-аміно-9-етилкарбазолу для системи візуалізації EnVision, кон'югованою з пероксидазою, або ПАП-метода. При застосуванні системи візуалізації EnVision, кон'югованою з лужною фосфатазою, проводять цитохімічне дослідження ферменту методом азосполучення за допомогою Fast Red TR (солі 4-хлоро-2-метилбензендіазонію). Після проведення імуноцитохімічної реакції препарати промивають водою та дофарбовують гематоксіліном 1-2 хвилини та заключають у Faramount Aqueous Mounting Medium (DakoCytomation, Данія). В якості позитивного контролю використовують моноклональні антитіла (МКАТ) проти пан-цитокератинів. В якості негативного контролю замість МКАТ на клітини наносять забуферений фізіологічний розчин. Позитивні за Р-глікопротеїном клітини є резистентними до дії доксорубіцину. Надалі резистентні до доксорубіцину клітини вирощують на покривних скельцях одну добу. Потім до клітин додають 5-[біс(дигідроксифосфорил) метил]-25,27-дипропокси-26,28дигідроксикалікс[4]арен в концентрації 50мкмоль/л та культивують протягом 24 годин, після чого знову оцінюють рівень експресії Р-глікопротеїну та Кі67 імуноцитохімічним методом. Також оцінюють здатність 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену підвищувати цитотоксичну активність доксорубіцину по відношенню до клітин досліджуваних ліній. Для цього резистентні клітини розсаджують в 96лункові планшети та інкубують з 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]ареном та з доксорубіцином протягом 24 годин. Чутливість до доксорубіцину оцінюють, використовуючи стандартний МТТ-колориметричний тест. Таким чином, використання 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену сприяє підвищенню цитототоксичної активності доксорубіцину шляхом зниження експресії Р-глікопротеїна та білка Кі-67. Прикладом виконання способу можуть бути витяги з двох протоколів досліджень. І. Резистентний варіант клітин раку молочної залози людини MCF-7/Dox було отримано шляхом вирощування вихідних клітин MCF-7 у культуральному середовищі з додаванням наростаючих концентрацій доксорубіцину в діапазоні доз від 0,1 до 32мкг/мл. Доксорубіцин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Величини ІС50 для клітин MCF-7 та MCF-7/Dox становили 0,5 та 8мкг/мл доксорубіцину відповідно, що відповідає рівню резистентності до цитотоксичної дії доксорубіцину 16. Імуноцитохімічне дослідження експресії Рглікопротеїну та Кі-67 показало, що на відміну від 50922 4 клітин чутливої лінії (MCF-7), в переважній більшості клітин, резистентних до доксорубіцину (MCF7/Dox) спостерігалась підвищена експресія даних білків. Надалі досліджувані клітини резистентної лінії вирощували на покривних скельцях одну добу, після чого додавали 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідрокси калікс[4]арен в концентрації 50мкмоль/л та культивували їх протягом 24 годин. Наступне імуноцитохімічне дослідження показало, що культивування клітин з 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]ареном призводить до зниження в них експресії Р-глікопротеїну з 80 до 30%, а Кі-67 - з 40 до 15% Дослідження цитотоксичної дії 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену на клітини резистентної лінії показало, що дані сполуки здатні підвищувати цитотоксичну активність доксорубіцину по відношенню до клітин MCF-7/Dox на 21%. II. Резистентний варіант клітин раку яєчника людини A2780/Dox було отримано шляхом вирощування вихідних клітин А2780 у культуральному середовищі з додаванням наростаючих концентрацій доксорубіцину в діапазоні доз від 0,1 до 32мкг/мл. Доксорубіцин додавали двічі на тиждень після пересіву клітин. Величини ІС50 для клітин А2780 та А2780/Dox становили 0,5 та 2мкг/мл доксорубіцину відповідно, що відповідає рівню резистентності до цитотоксичної дії доксорубіцину 4. Імуноцитохімічне дослідження експресії Рглікопротеїну та Кі-67 показало, що на відміну від клітин А2780, в переважній більшості клітин, А2780/Dox спостерігалась підвищена експресія даних білків. Надалі досліджувані клітини резистентної лінії вирощували на покривних скельцях одну добу, після чого додавали 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідрокси-калікс[4]арен в концентрації 50мкмоль/л та культивували їх протягом 24 годин. Наступне імуноцитохімічне дослідження показало, що культивування клітин з 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]ареном призводить до зниження в них експресії Р-глікопротеїну з 70 до 40%, а Кі-67 - з 60 до 25%. Дослідження цитотоксичної дії 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену на клітини резистентної лінії показало, що дані сполуки здатні підвищувати цитотоксичну активність доксорубіцину по відношенню до клітин MCF-7/Dox на 17%. Таким чином, використання 5[біс(дигідроксифосфорил)метил]-25,27дипропокси-26,28-дигідроксикалікс[4]арену сприяє підвищенню цитототоксичної активності доксорубіцину щодо пухлинних клітин різних локалізацій. Джерела інформації 1. Distinctive alteration of invasiveness, drug resistance and cell-cell organization in 3D-cultires of 5 50922 MCF-7, a human breast cancer cell line, and its multidrug resistance variant / M.A. dit Faute, L. Laurent, D. Ploton et al. // Clin. Exp. Metastasis. 2002. - Vol. 19. -P. 161-168. 2. Чехун В.Ф., Шишова Ю.В. Современные взгляды на формирование лекарственной устойчивости опухолей // Онкология. - 2000. - Vol. 2, №1-2. - Р. 11-15. 3. The mechanism of action of multidrugresistance-linked P-glycoprotein / Z.E. Sauna, M.M. Smith, M. Muller et al. // Journal of bioenergetics and biomembranes. - 2001. - Vol. 33, №6. - P. 481-491. 4. Using small molecules to overcome drug resistance induced by a viral oncogene / I. Smukste, Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 O. Bhalala, M. Persico, B.R. Stockwell // Cancer Cell. - 2006. - Vol. 9, №2. - P. 133-146. (прототип) 5. Calix[4]arene metbylenebisphosphonic acids as calf intestine alkaline phosphatase inhibitors / Vovk A.I., Kalchenko V.I., Cherenok S.A., Kukhar V.P., Muzychka O.V., Lozynsky M.O. // Org. Biomol. Chem. - 2004. - Vol.2. - P.3162-3166. 6. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique / R. С Graham Jr., M. J. Karnovsky // J. Histochem. Cytochem. - 1965. - Vol. 14. - P. 291-302. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601