Амінотриазолопіридин для застосування в лікуванні запалення і його фармацевтичні композиції

Реферат: Даний винахід стосується нового медичного застосування сполуки формули І, зокрема, при лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів. Зокрема, сполука інгібує сімейство тирозинкіназ JAK і, конкретніше, JAK1. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять зазначену сполуку, способів профілактики і/або лікування захворювань, включаючи запальні стани, аутоімунні захворювання, проліферативні захворювання, алергію, відторгнення трансплантата, захворювання, що включають погіршення відновлення хряща, уроджені мальформації хряща і/або захворювання, пов'язані з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, за допомогою введення зазначеної сполуки. UA 112804 C2 (12) UA 112804 C2 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний винахід стосується медичного застосування сполуки за винаходом формули I. Зокрема даний винахід стосується застосування сполуки за винаходом формули I для лікування запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів. Зокрема, сполука інгібує JAK, сімейство тирозинкіназ, і конкретніше - JAK1. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, що містять сполуку, і способів для профілактики і/або лікування захворювань, що включають запальні стани, аутоімунні захворювання, проліферативні захворювання, алергію, відторгнення трансплантата, захворювання, що включають погіршення відновлення хряща, уроджені мальформації хряща і/або захворювання, пов'язані з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, за допомогою введення сполуки за винаходом формули I. Янус-кінази (JAK) являють собою цитоплазматичні тирозинкінази, що передають цитокінові сигнали з мембранних рецепторів на фактори транскрипції STAT. Описані чотири члени сімейства JAK, JAK1, JAK2, JAK3 і TYK2. При зв'язуванні цитокіну зі своїм рецептором члени сімейства JAK ауто- і/або трансфосфорилують один одного, за чим слідує фосфорилування STAT, що потім мігрують у ядро для того, щоб модулювати транскрипцію. JAK-STAT трансдукція внутрішньоклітинних сигналів служить для інтерферонів, більшості інтерлейкінів, а також різних цитокінів і ендокринних факторів, таких, як EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF і PRL (Vainchenker W. et al. (2008)). Дослідження комбінації генетичних моделей і низькомолекулярного інгібітора JAK виявило терапевтичний потенціал деяких JAK. JAK1 являє собою мішень у галузі імунно-запальних захворювань. JAK1 утворює гетеродимери з іншими JAK для того, щоб передавати прозапальні сигнали, які запускаються цитокінами. Отже, для імунно-запальних захворювань інтерес становить інгібування JAK1 із застосуванням асоційованих з патологією цитокінів, що використовують передачу сигналів через JAK1, таких, як IL-6, IL-4, IL-5, IL-12, IL-13, IL-23, або IFNγ, а також для інших захворювань, що запускаються за допомогою JAK-опосередкованої трансдукції сигналів. Серед членів сімейства JAK має місце деяке перекривання функцій, оскільки в більшість шляхів передачі сигналу залучені більше, ніж одна JAK, однак для деяких факторів росту, таких, як еритропоетин і тромбопоетин, залучена тільки JAK2. JAK3 виконує основну функцію у блокуванні імунної функції через передачу сигналів, генерованих інтерлейкіном 2 (IL-2). З іншого боку, TYK2 схоже працює в комбінації з JAK2 і JAK3 для того, щоб передавати сигнали цитокінів, таких, як IL-12 і IL-23. Роль ферментів JAK головним чином вивчали в мишей, у яких видаляли кожний із членів сімейства JAK. Миші з нокаутом JAK1 проявляють перинатальний летальний фенотип, а також мають дефективний розвиток і функціонування лімфоїдної тканини в результаті дефективної передачі сигналів цитокінів через JAK1. Недостатність JAK2 призводить до ембріональної летальності на 12 добу в результаті неможливості остаточного еритропоезу. Миші з недостатністю JAK3 мають фенотип із важким комбінованим імунодефіцитом (SCID), але не мають не імунологічних дефектів. (Verstovsek, 2009, Hematology Am Soc Hematol Educ Program., 636-42). Як спостерігали при застосуванні інгібіторів усіх JAK, невибірне інгібування може бути пов'язане з побічними ефектами, такими, як анемія, підвищений рівень інфекцій, нижчі кількості нейтрофілів і лімфоцитів, зниження гемоглобіну і підвищені рівні холестерину (Elie Dolgin, 2011, Nature Reviews Drug Discovery 10, 717-718). Отже, розробка селективного інгібітора JAK буде корисна для того, щоб мінімізувати такі побічні ефекти. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Дегенерація хряща є ознакою різних захворювань, серед яких ревматоїдний артрит і остеоартрит є найбільш значущими. Ревматоїдний артрит (РА) являє собою хронічне дегенеративне захворювання суглобів, що відрізняється запаленням і руйнуванням суглобових структур. Коли захворювання не припиняють, воно призводить до істотної непрацездатності і болів через втрату функціональності суглобів і навіть до передчасної смерті. Отже, ціль терапії РА полягає в тому, щоб не тільки сповільнювати захворювання, а і досягати ремісії для того, щоб зупиняти руйнування суглоба. Крім важкості кінця захворювання, висока поширеність РА (у всьому світі уражені ~0,8 % дорослих) передбачає виражений соціально-економічний вплив. 1 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Огляди по РА див. у Smolen and Steiner (2003); Lee and Weinblatt (2001); Choy and Panayi (2001); О'Dеll (2004) і Firestein (2003)). JAK1 залучена у внутрішньоклітинну трансдукцію сигналів для багатьох цитокінів і гормонів. Патології, пов'язані з яким-небудь з цих цитокінів і гормонів, можна поліпшувати за допомогою інгібіторів JAK1. Таким чином, деякі з алергії, запалення й аутоімунних порушень можуть одержувати користь від лікування сполуками, описаними в цьому винаході, включаючи ревматоїдний артрит, системний червоний вовчак, ювенільний ідеопатичний артрит, остеоартрит, астму, хронічне обструктивне захворювання легенів (COPD), фіброз тканин, еозинофільне запалення, езофагіт, запальні захворювання кишечнику (наприклад, хвороба Крона, виразковий коліт), трансплантат, реакцію "трансплантат проти хазяїна", псоріаз, міозит, псоріатичний артрит, анкілозивний спондиліт, ювенільний ідеопатичний артрит і розсіяний склероз (Kopf et al., 2010). Псоріаз являє собою захворювання, що може вражати шкіру. Причина псоріазу зрозуміла не повністю, однак, думають, що він являє собою імуно-опосередковане захворювання, пов'язане з вивільненням цитокінів, зокрема, TNFα, що викликає запалення і швидку репродукцію клітин шкіри. Цю гіпотезу підтверджують спостереження про те, що лікування імуносупресантами може усувати псоріазні бляшки (Zenz R, Eferl R, Kenner L, et al. (2005). "Psoriasis-like skin disease and arthritis caused by inducible epidermal deletion of Jun proteins". Nature 437 (7057): 369-75). Псоріаз також може викликати запалення суглобів, яке відоме як псоріатичний артрит. Від 10 до 30 % усіх людей із псоріазом також мають псоріатичний артрит (Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (18 November 2004). "Guideline on Clinical Investigation of Medicinal Products indicated for the treatment of Psoriasis"). У зв'язку з його хронічною рецидивною природою, псоріаз являє собою терапевтичну проблему. Останнім часом продемонстровано, що інгібування JAK може призводити до успішного поліпшення псоріатичного стану. (Punwani et al., (2012) "Preliminary clinical activity of a topical JAK1/2 inhibitor in the treatment of psoriasis" J Am Acad Dermatol., 67, 4, 658-664). Запальне захворювання кишечнику (IBD) являє собою групу запальних станів ободової кишки і тонкої кишки. Основними типами IBD є хвороба Крона і виразковий коліт. Останнім часом у дослідженнях повногеномних зв'язків (GWAS) виявлено, що T-клітинна білкова тирозинова фосфатаза (TCPTP) являє собою фосфатазу рецепторів JAK/STAT і факторів росту, яка пов'язана з патогенезом діабету 1 типу, ревматоїдного артриту і хвороби Крона за допомогою GWAS (Zikherman et al., J Clin Invest. 2011 Dec;121(12):4618-21). Отже, інгібування каскаду реакцій JAK може надавати шлях для лікування IBD. Члени сімейства JAK залучені в додаткові стани, включаючи мієлопроліферативні збудження (О'Sullіvаn et al., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506), де ідентифіковані мутації в JAK2. Це вказує на те, що інгібітори JAK, зокрема JAK2, також можна використовувати при лікуванні мієлопроліферативних порушень. Додатково, сімейство JAK, зокрема JAK1, JAK2 і JAK3, пов'язане зі злоякісними пухлинами, зокрема, лейкеміями, наприклад, гострим мієлолейкозом (О'Sullіvаn et al., 2007, Mol Immunol. 44(10):2497-506; Xiang et al., 2008, "Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia" Blood First Edition Paper, попередньо опублікована онлайн 26 грудня 2007 року; DOI 10.1182/blood-2007-05090308) і гострою лімфобластною лейкемією (Mullighan et al., (2009)), T-клітинною лімфомою шкіри (Zhang et al., 1996, PNAS, 93, 9148-9153) або солідними пухлинами, наприклад, лейоміосаркома матки (Constantinescu et al., 2007, Trends in Biochemical Sciences 33(3): 122131), злоякісною пухлиною передміхурової залози (Tarn et al., 2007, British Journal of Cancer, 97, 378-383) і злоякісною пухлиною молочної залози (Berishaj et al., 2007, Breast Cancer Research 9: R32). Ці результати показують, що інгібітори JAK, зокрема JAK1, також можуть мати корисність при лікуванні злоякісних пухлин (лейкемій і солідних пухлин, наприклад, лейоміосаркоми матки, злоякісної пухлини передміхурової залози). Крім того, хвороба Кастлемана, множинна мієлома, мезангіальний проліферативний гломерулонефрит, псоріаз і саркома Капоші ймовірно визначені гіперсекрецією цитокіну IL-6, біологічні ефекти якого опосередковані внутрішньоклітинною JAK-STAT передачею сигналів (Tetsuji Naka, Norihiro Nishimoto and Tadamitsu Kishimoto, Arthritis Res 2002, 4 (suppl 3):S233S242). Цей результат показує, що інгібітори JAK також можуть мати корисність при лікуванні зазначених захворювань. Існуючі способи терапії не задовільні і, отже, залишається потреба ідентифікувати додаткові сполуки, які можна використовувати при лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема ревматоїдного артриту. 2 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 Додатково, ці стани являють собою хронічні стани, що вимагають тривалої терапії і повторюваного прийому лікарського засобу. Тривале лікування може бути важким тягарем для пацієнта, а також практикуючого лікаря, оскільки пацієнт може бути або ставати не здатним переносити лікарський засіб, і, крім того, висока доза або висока частота доз може вести до неприємних побічних ефектів і/або знижувати дотримання пацієнтом схеми лікування, де пацієнт може іноді, навмисно або ненавмисно, пропускати дозу. Вплив несхильності варіює серед хронічних захворювань і знаходиться в діапазоні від мінімального до дуже значущого. (Ingersoll et al., 2008 J Behav Med.; 31(3): 213-224). Отже, існує необхідність ідентифікувати додаткові сполуки, щоб підсилювати арсенал практикуючого лікаря, і сполуки зі схемою дозування з низькою частотою, щоб поліпшувати життя пацієнтів. У спробі відкрити нові ліки часто встановлюють критерії для того, щоб ідентифікувати найкращого придатного кандидата, і, таким чином, багато сполук швидко оцінюють у моделі in vitro, і також швидко відкидають, якщо вони не відповідають зазначеним критеріям. Дослідження in vitro звичайно має вищу пропускну здатність, ніж дослідження in vivo, і надають значну допомогу в процесі ухвалення рішення. Таким чином, звичайно очікують, що модель in vitro може прогнозувати властивості лікарського засобу in vivo, і відкидають сполуки, які на перший погляд не виглядають такими, що мають придатний профіль in vitro. У цьому контексті, сполука за винаходом формули I при дослідженні демонструвала профіль in vitro, що викликав слабкий інтерес, однак, дослідження in vivo виявляли несподівані властивості, зокрема, у людини. СУТЬ ВИНАХОДУ Даний винахід оснований на тому відкритті, що сполуку за винаходом формули I можна застосовувати як лікарський засіб. У конкретному аспекті сполука за винаходом формули I являє собою інгібітор JAK і конкретніше, JAK1. Даний винахід також стосується способів одержання сполуки за винаходом формули I, фармацевтичних композицій, що містять сполуку за винаходом формули I, і способів профілактики і/або лікування запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, за допомогою введення сполуки за винаходом формули I. Відповідно, у першому аспекті винаходу надана сполука за винаходом для застосування в медицині, що має формулу I: 35 40 Сполука за винаходом формули I, до подиву, виявляє в людини in vivo профіль, що сильно відрізняється від інших видів тварин, що контрастує з передбаченнями in vitro. У дійсності, in vivo продемонстровано, що в людини видимий кінцевий період напіввиведення сполуки за винаходом формули I значно довший, ніж в інших видів тварин, щонайменше в 3 рази. Це викликає в людини накопичення, що призводить до терапевтичного ефекту, що зберігається, протягом тривалого періоду часу, тим самим, роблячи можливим дозування від одного разу на добу до одного разу на тиждень. Таким чином, сполука за винаходом формули I може забезпечувати переваги, включаючи схему дозування з низькою частотою і/або підвищене 3 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дотримання пацієнтом схеми лікування. Зокрема, можна знижувати вплив несхильності, якщо пацієнт пропускає дозу. У конкретному аспекті передбачена сполука за винаходом формули I для застосування в профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту. У додатковому аспекті, даний винахід передбачає фармацевтичні композиції, що містять сполуку за винаходом формули I і фармацевтичний носій, ексципієнт або розріджувач. У конкретному аспекті фармацевтична композиція може додатково містити додаткові терапевтично активні інгредієнти, придатні для застосування в комбінації зі сполукою за винаходом формули I. У конкретнішому аспекті додатковий терапевтично активний інгредієнт являє собою сполуку для лікування артриту. У найконкретнішому аспекті додатковий терапевтично активний інгредієнт являє собою сполуку для лікування ревматоїдного артриту. Крім того, сполука за винаходом формули I, яку можна використовувати у фармацевтичних композиціях і способах лікування, описаних у даному документі, є фармацевтично прийнятною, як одержують і використовують. У додатковому аспекті винаходу даний винахід передбачає спосіб лікування ссавця, зокрема, людини, яка схильна до або страждає від стану, вибраного серед тих, які перераховані в даному документі, і, зокрема, запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща, і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, конкретніше, ревматоїдного артриту, що включає введення терапевтично ефективної кількості фармацевтичної композиції або сполуки за винаходом формули I, як описано в даному документі. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, які містять сполуку за винаходом формули I і придатний фармацевтичний носій, ексципієнт або розріджувач для застосування в медицині. У конкретному аспекті фармацевтична композиція призначена для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту. У додаткових аспектах даний винахід передбачає способи синтезу сполуки за винаходом формули I із застосуванням репрезентативних протоколів і шляхів синтезу, розкритих далі в даному документі. Інші цілі і переваги будуть видні фахівцям у даній галузі при розгляді наступного докладного опису. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ На фіг. 1: представлена клінічна оцінка КІА (CIA) у щурів після лікування сполуками, описаними в даному документі. На фіг. 2: представлена еволюція діаметра щиколотки в моделі КІА на щурах після лікування сполуками, описаними в даному документі. На фіг. 3: представлений метаболічний профіль in vitro сполуки формули II. На фіг. 4: представлене співвідношення експозиції (виражене у вигляді AUC) для формули I і формули II, виміряне при введенні сполуки формули II. На фіг. 5: представлені значення для рівнів експозиції розкритих сполук після введення сполуки формули II, виражених у вигляді кратного для значення IC50. На фіг. 6: представлені комбіновані значення для рівнів експозиції протягом 24 год періоду для сполуки формули I і формулою II після введення сполуки формули II, виражені у вигляді кратного для значення IC50. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Визначення Мають на увазі, що наступні терміни мають значення, представлені наведеним нижче, і їх можна використовувати для розуміння опису і передбачуваного об'єму даного винаходу. Коли описують винахід, що може включати сполуки, фармацевтичні композиції, що містять такі сполуки, і способи застосування таких сполук і композицій, наступні терміни, якщо присутні, мають наступні значення, якщо не зазначене інше. Також варто розуміти, що при описі в даному документі який-небудь із фрагментів, визначених нижче, можна заміщувати різними замісниками, і що відповідні визначення призначені для того, щоб включати такі заміщені фрагменти у свій об'єм, як викладено нижче. Якщо не зазначено інше, термін "заміщений" варто 4 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 визначати, як викладено нижче. Крім того, варто розуміти, що терміни "групи" і "радикали" можна вважати взаємозамінними при застосуванні в даному документі. Форму однини можна використовувати в даному документі, щоб відіслати до одного або більше, ніж одного (тобто щонайменше одного) граматичного об'єкта виробу. Як приклад "аналог" позначає один аналог або більше, ніж один аналог. Як використовують у даному документі, термін "JAK" стосується сімейства Янус-кіназ (JAK), які являють собою цитоплазматичні тирозинкінази, що здійснюють передачу цитокінових сигналів від мембранних рецепторів до факторів транскрипції STAT. Описано чотири члени сімейства JAK, JAK1, JAK2, JAK3 і TYK2, і термін JAK може стосуватися всіх членів сімейства JAK разом або одного або декількох членів сімейства JAK, як указує контекст. "Фармацевтично прийнятний" позначає схвалений або такий, що заслуговує схвалення, регулювальним органом федерального або державного уряду або відповідного органа в країнах, відмінних від Сполучених Штатів, або перерахований у Фармакопеї США або іншій загальновизнаній фармакопеї для застосування у тварин і, конкретніше, у людини. "Фармацевтично прийнятна сіль" стосується солі сполуки формули I, яка є фармацевтично прийнятною і має бажану фармакологічну активність вихідної сполуки. Зокрема, такі солі нетоксичні і можуть являти собою неорганічні або органічні кислотно-адитивні солі й основноадитивні солі. Зокрема, такі солі включають: (1) кислотно-адитивні солі, утворені з неорганічними кислотами, такими, як хлористоводнева кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. п.; або утворені з органічними кислотами, такими, як оцтова кислота, пропанова кислота, гексанова кислота, циклопентанпропанова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, молочна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, яблучна кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, 3-(4-гідроксибензоїл)бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфонова кислота, етансульфонова кислота, 1,2-етандисульфонова кислота, 2-гідроксіетансульфонова кислота, бензолсульфонова кислота, 4-хлорбензолсульфонова кислота, 2-нафталінсульфонова кислота, 4толуолсульфонова кислота, камфорсульфонова кислота, 4-метилбіцикло[2.2.2]-окт-2-ен-1карбонова кислота, глюкогептонова кислота, 3-фенілпропанова кислота, триметилоцтова кислота, третинна бутилоцтова кислота, лаурилсірчана кислота, глюконова кислота, глутамінова кислота, гідроксинафтойна кислота, саліцилова кислота, стеаринова кислота, муконова кислота і т. п.; або (2) солі, утворені так, що протон кислоти, який присутній у вихідній сполуці, або замінюють на іон металу, наприклад, іон лужного металу, іон лужноземельного металу або іон алюмінію; або утворюють координаційні сполуки з органічними основами, такими, як етаноламін, діетаноламін, триетаноламін, N-метилглюкамін і т. п. Солі додатково включають, тільки як приклад, солі натрію, калію, кальцію, магнію, аміаку, тетраалкіламонію і т. п.; і коли сполука містить основну функціональність, солі нетоксичних органічних або неорганічних кислот, такі, як гідрохлорид, гідробромід, тартрат, мезилат, ацетат, малеат, оксалат і т. п. Термін "фармацевтично прийнятний катіон" стосується прийнятного катіонного протиіону кислої функціональної групи. Прикладами таких катіонів є катіони натрію, калію, кальцію, магнію, амонію, тетраалкіламонію і т. п. "Фармацевтично прийнятний наповнювач" стосується розріджувача, ад'юванту, ексципієнта або носія, з яким вводять сполуку за винаходом формули I. "Сольват" стосується форм сполуки, що зв'язані з розчинником, звичайно за допомогою реакції сольволізу. Це фізичне об'єднання включає утворення водневих зв'язків. Стандартні розчинники включають воду, етанол, оцтову кислоту і т. п. Сполуку за винаходом формули I можна одержувати, наприклад, у кристалічній формі і вона може бути сольватованою або гідратованою. Придатні сольвати включають фармацевтично прийнятні сольвати, такі, як гідрати, і, крім того, включають як стехіометричні сольвати, так і нестехіометричні сольвати. У визначених випадках сольват буде здатний до виділення, наприклад, коли одна або декілька молекул розчинника вбудовуються в кристалічні решітки кристалічної твердої речовини. "Сольват" охоплює як сольвати в розчиненій фазі, так і сольвати, що піддаються виділенню. Репрезентативні сольвати включають гідрати, етанолати і метанолати. "Суб'єкт" включає людину. Терміни "людина", "пацієнт" і "суб'єкт" використовують у даному документі взаємозамінно. "Терапевтично ефективна кількість" позначає кількість сполуки, що при введенні суб'єкту для лікування захворювання є достатньою для того, щоб здійснювати таке лікування захворювання. "Терапевтично ефективна кількість" може варіювати залежно від сполуки, захворювання і його важкості, а також віку, маси суб'єкта, що підлягає лікуванню, і т. д. 5 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Запобігання" стосується зниження ризику виникнення або розвитку захворювання або збудження (тобто, забезпечують не розвиток щонайменше одного з клінічних симптомів захворювання в суб'єкта, що може бути підданий агенту, який викликає захворювання, або схильний до захворювання до початку захворювання). Термін "профілактика" пов'язаний із "запобіганням", і стосується ступеня або процедури, ціль якої полягає в тому, щоб запобігати, а не лікувати або виліковувати захворювання. Необмежуючі приклади профілактичних заходів можуть включати уведення вакцин; уведення низькомолекулярного гепарину пацієнтам у лікарні з ризиком тромбозу, наприклад, через іммобілізацію; і введення антималярійних засобів, таких, як хлорохін, перед відвідуванням географічної зони, де малярія є ендемічним захворюванням або високий ризик контакту з малярією. "Лікування" будь-якого захворювання або збудження в одному з варіантів здійснення стосується поліпшення захворювання або збудження (тобто, припинення захворювання або зниження маніфестації, ступеня або важкості щонайменше одного з його клінічних симптомів). В іншому варіанті здійснення "лікування" стосується поліпшення щонайменше одного фізикального параметра, який може бути не видимий суб'єкту. У ще одному іншому варіанті здійснення "лікування" стосується модулювання захворювання або збудження, або фізично (наприклад, стабілізація видимого симптому), фізіологічно (наприклад, стабілізація фізичного параметра), або і те, й інше. У додатковому варіанті здійснення "лікування" стосується уповільнення прогресування захворювання. Як використовують у даному документі, термін "запальний стан(и)" стосується групи станів, яка включає ревматоїдний артрит, остеоартрит, ювенільний ідеопатичний артрит, псоріаз, псоріатичний артрит, алергійне захворювання дихальних шляхів (наприклад, астма, риніт), запальні захворювання кишечнику (наприклад, хвороба Крона, виразковий коліт), патологічні стани, викликані токсинами (наприклад, ускладнення після шунтування або хронічні стани ендотоксикації, що сприяють, наприклад, хронічній серцевій недостатності), і пов'язані захворювання хрящів, такі, як захворювання суглобів. Зокрема, термін стосується ревматоїдного артриту, остеоартриту, алергійного захворювання дихальних шляхів (наприклад, астмі) і запальних захворювань кишечнику. Як використовують у даному документі, термін "аутоімунне(і) захворювання" стосується групи захворювань, яка включає обструктивні захворювання дихальних шляхів, включаючи такі стани, як COPD, астму (наприклад, спадкоємну астму, набуту астму, пилову астму або дитячу астму), зокрема, хронічну або застарілу астму (наприклад, пізню астму і гіперчутливість дихальних шляхів), бронхіт (включаючи бронхіальну астму), системний червоний вовчак (SLE), шкірний червоний вовчак (CLE), розсіяний склероз, цукровий діабет I типу й ускладнення, пов'язані з ним, атопічну екзему (атопічний дерматит), контактний дерматит і, крім того, екзематозний дерматит, запальне захворювання кишечнику (наприклад, хворобу Крона або виразковий коліт), атеросклероз і аміотрофічний бічний склероз. Зокрема термін стосується COPD, астми, цукрового діабету I типу і запального захворювання кишечнику. Як використовують у даному документі термін "проліферативне(і) захворювання" стосується таких станів, як злоякісна пухлина (наприклад, лейоміосаркома матки або злоякісна пухлина передміхурової залози), мієлопроліферативні збудження (наприклад, справжня поліцитемія, есенційний тромбоцитоз і мієлофіброз), лейкоз (наприклад, гострий мієлолейкоз і гострий лімфобластний лейкоз), множинна мієлома, псоріаз, рестеноз, склеродермія або фіброз. Зокрема, термін стосується злоякісної пухлини, лейкозу, множинної мієломи і псоріазу. Як використовують у даному документі, термін "злоякісна пухлина" стосується злоякісного або доброякісного росту клітин у шкірі або органах тіла, наприклад, але без обмеження, молочна залоза, передміхурова залоза, легені, нирки, підшямкова залоза, шлунок або кишечник. Злоякісна пухлина прагне інфільтрувати суміжні тканини і поширюватися (метастазувати) у віддалені органи, наприклад, у кістки, печінку, легені або головний мозок. Як використовують у даному документі, термін злоякісна пухлина включає як метастатичні пухлинні типи клітин, такі, як, але не обмежуючись цим, меланома, лімфома, лейкемія, фібросаркома, рабдоміосаркома і мастоцитома, і типи карциноми тканин, такі, як, але не обмежуючись цим, злоякісна пухлина товстої кишки, злоякісна пухлина передміхурової залози, дрібноклітинний рак легень і недрібноклітинний рак легень, злоякісна пухлина молочної залози, злоякісна пухлина підшямкової залози, злоякісна пухлина сечового міхура, злоякісна пухлина нирки, злоякісна пухлина шямка, гліобластома, первинна злоякісна пухлина печінки, злоякісна пухлина яєчників, злоякісна пухлина передміхурової залози і лейоміосаркома матки. Як використовують у даному документі, термін "лейкоз" стосується неопластичних захворювань крові й органів кровотворення. Такі захворювання можуть викликати збудження 6 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 функцій кісткового мозку й імунної системи, що роблять носія сильно схильним до інфікування і кровотеч. Зокрема, термін лейкоз стосується гострого мієлолейкозу (AML) і гострого лімфобластного лейкозу (ALL). Як використовують у даному документі, термін "відторгнення при трансплантації" стосується гострого або хронічного відторгнення ало- або ксенотрансплантатів клітин, тканин або солідних органів, наприклад, панкреатичних острівців, стовбурових клітин, кісткового мозку, шкіри, м'язів, рогівкової тканини, нервової тканини, серця, легень, комбінованого серцево-легеневого трансплантата, нирки, печінки, кишечнику, підшямкової залози, трахеї або стравоходу або реакції "трансплантат проти хазяїна". Як використовують у даному документі, термін "захворювання, що включають погіршення відновлення хряща" включають такі стани, як остеоартрит, псоріатичний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, подагричний артрит, септичний або інфекційний артрит, реактивний артрит, симпатична рефлекторна дистрофія, альгодістрофія, синдром Тітце або реберний хондрит, фіброміалгія, остеохондрит, нейрогенний або нейропатичний артрит, артропатія, ендемічні форми артриту, такі, як ендемічний деформуючий остеоартрит, хвороба Мселені і хвороба Гандігоду; дегенерація в результаті фіброміалгія, системний червоний вовчак, склеродермія й анкілозивний спондиліт. Як використовують у даному документі, термін "уроджена мальформація хряща" включає стани, такі, як уроджений хондроліз, хондродисплазії і псевдохондродисплазії, зокрема, але без обмеження, мікротія, анотія, метафізарна хондродисплазія і пов'язані збудження. Як використовують у даному документі термін "захворювання, пов'язане(і) з гіперсекрецією IL-6" включає стани, такі, як хвороба Кастлемана, множинна мієлома, псоріаз, саркома Капоші і/або мезангіальний проліферативний гломерулонефрит. Як використовують у даному документі, термін "захворювання, пов'язане(і) з гіперсекрецією інтерферонів" включає стани, такі, як системний і шкірний червоний вовчак, вовчаковий нефрит, дерматоміозит, синдром Шегрена, псоріаз, ревматоїдний артрит. "Сполука за винаходом" і еквівалентні вирази позначають як такі, що включають сполуку за винаходом формули I або формули II (як говорить контекст), як описано раніше в даному документі, цей вираз включає фармацевтично прийнятні солі і сольвати, наприклад, гідрати і сольвати фармацевтично прийнятних солей, де контекст допускає це. Аналогічним чином, вказівку на проміжні сполуки, незалежно від того, заявлені вони самі або ні, розуміють як таку, що включає їх солі і сольвати, де контекст допускає це. Інші похідні сполуки за винаходом мають активність у формі як їх кислот, так і похідних кислот, але в чутливій до кислоти формі часто мають переваги у вигляді розчинності, тканинної сумісності або відстроченого вивільнення в організмі ссавця (Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Як використовують у даному документі, термін "ізотопний варіант" стосується сполуки, що містить неприродні співвідношення ізотопів одного або декількох атомів, що утворюють таку сполуку. Наприклад, "ізотопний варіант" сполуки може містити один або кілька нерадіоактивних ізотопів, таких, як, наприклад, дейтерій (2H або D), вуглець 13 (13C), азот 15 (15N) або тому подібне. Зрозуміло, що, в сполуці, де виконана така ізотопна заміна, наступні атоми, де присутні, можуть варіювати для того, щоб, наприклад, будь-який водень міг являти собою 2H/D, який-небудь вуглець міг являти собою 13C або який-небудь азот міг являти собою 15N, і що присутність і розташування таких атомів можна визначати згідно зі знаннями в даній галузі. Аналогічним чином, винахід може включати одержання ізотопних варіантів із застосуванням радіоізотопів, у випадку, наприклад, коли одержувані сполуки можна використовувати для лікарського засобу і/або в дослідженнях розподілу субстрату в тканинах. Радіоактивні ізотопи тритій, тобто 3H, і вуглець 14, тобто 14C, зокрема, можна використовувати з цією метою через простоту їхнього вбудовування і готових засобів виявлення. Крім того, можна одержувати сполуки, що заміщені ізотопами, які випускають позитрони, такими, як 11C, 18F, 15O і 13N, і які можна використовувати в дослідженнях позитронно-емісійної томографії (PET) для дослідження заповнення рецепторів субстратом. Припускають, що всі ізотопні варіанти сполуки, наданої в даному документі, радіоактивні або ні, включені в об'єм винаходу. "Таутомери" стосуються сполук, які являють собою взаємозамінні форми конкретної структури сполуки і варіюють по зміщенню атомів водню й електронів. Таким чином, дві структури можуть знаходитися в рівновазі за рахунок руху π-електронів і атома (звичайно H). Наприклад, еноли і кетони являють собою таутомери, оскільки вони швидко взаємоперетворюються при обробці кислотою або основою. Іншим прикладом таутомерії є аци 7 UA 112804 C2 5 10 15 і нітроформи фенілнітрометану, що аналогічним чином формують за допомогою обробки кислотою або основою. Таутомірні форми можуть мати значення для досягнення оптимальної хімічної реакційної здатності і біологічної активності сполуки, що становить інтерес. ВИНАХІД Даний винахід оснований на тому відкритті, що сполука за винаходом формули I може бути корисна як лікарський засіб. У конкретному аспекті, сполука за винаходом формули I являє собою інгібітор JAK і, конкретніше, JAK1. Даний винахід також стосується способів одержання сполуки за винаходом формули I, фармацевтичних композицій, що містять сполуку за винаходом формули I, і способів профілактики і/або лікування запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, за допомогою введення сполуки за винаходом формули I. Відповідно, у першому варіанті здійснення винаходу сполуку за винаходом формули I надають для застосування в медицині, що має формулу I: 20 В іншому варіанті здійснення винаходу сполука за винаходом, що являє собою інгібітор JAK, надана для застосування в медицині: 25 Сполука за винаходом формули I, до подиву, виявляє in vivo у людини профіль, який сильно відрізняється від інших видів тварин і який сильно контрастує з передбаченнями in vitro. У дійсності, in vivo демонстрували, що в людини видимий кінцевий період напіввиведення сполуки 8 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 за винаходом формули I значно довший, ніж в інших видів тварин, щонайменше в 3 рази. Це викликає накопичення в людини, що призводить до терапевтичного ефекту, що зберігається, протягом тривалого періоду часу, тим самим допускаючи дозування від одного разу на добу до одного разу на тиждень. Таким чином, сполука за винаходом формули I може забезпечувати переваги, включаючи схему дозування з низькою частотою і/або підвищене дотримання пацієнтом схеми лікування. Зокрема, можна знижувати ефект недотримання вказівок, якщо пацієнт пропускає дозу. В одному з варіантів здійснення сполука за винаходом формули I не є ізотопним варіантом. В одному з аспектів сполука за винаходом формули I є присутньою у вигляді вільної основи. В одному з аспектів сполука за винаходом формули I являє собою фармацевтично прийнятну сіль. В одному з аспектів сполука за винаходом формули I являє собою сольват сполуки за винаходом формули I. В одному з аспектів сполука за винаходом формули I являє собою сольват фармацевтично прийнятної солі сполуки за винаходом формули I. Сполука за винаходом формули I являє собою інгібітор JAK. Зокрема, сполука за винаходом формули I являє собою сильний інгібітор JAK1, однак він може інгібувати JAK2, JAK3 і TYK2 з меншою активністю. У додатковому варіанті здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, яка містить сполуку за винаходом формули I і фармацевтичний носій, ексципієнт або розріджувач. У ще одному додатковому варіанті здійснення фармацевтична композиція додатково містить додатковий терапевтичний засіб. У конкретному аспекті, інша сполука являє собою сполуку для лікування артриту. У конкретнішому аспекті інша сполука являє собою сполуку для лікування ревматоїдного артриту. У найконкретнішому варіанті здійснення додатковий терапевтичний засіб являє собою сполуку за винаходом формули II: . 30 35 40 ФАРМАЦЕВТИЧНІ КОМПОЗИЦІЇ Коли використовують як фармацевтичний засіб, сполуку за винаходом формули I типово вводять у формі фармацевтичної композиції. Такі композиції можна одержувати способом, добре відомим в галузі фармацевтики, і вони містять щонайменше одну активну сполуку за винаходом формули I. Звичайно сполуку за винаходом формули I вводять у фармацевтично ефективній кількості. Кількість сполуки за винаходом формули I, що вводиться в даний момент, типово визначає лікар, у світлі значущих обставин, включаючи стан, який підлягає лікуванню, вибраний шлях уведення, сполуки за винаходом формули I, що вводиться в даний момент, вік, масу і відповідь окремого пацієнта, важкість симптомів пацієнта і т. п. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити за допомогою різних шляхів, включаючи пероральний, ректальний, трансдермальний, підшкірний, внутрішньосуглобовий, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий й інтраназальний. Залежно від планованого шляху доставки, сполуку за винаходом формули I за даним винаходом переважно формулюють у вигляді або ін'єктованих, або пероральних композицій, або у вигляді мазей, у вигляді лосьйонів або у вигляді пластирів, усі - для трансдермального введення. 9 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Композиції для перорального введення можуть приймати форму нерозфасованих рідких розчинів або суспензій або нерозфасованих порошків. Однак частіше композиції представляють у стандартних дозованих формах для того, щоб сприяти точному дозуванню. Термін "стандартні дозовані форми" стосується фізично окремих одиниць, що підходять як одиничні дози для людських суб'єктів й інших ссавців, кожна одиниця містить попередньо обумовлену кількість активного матеріалу, обчислену для одержання бажаного терапевтичного ефекту, у поєднанні з придатним фармацевтичним ексципієнтом, наповнювачем або носієм. Типові стандартні дозовані форми включають попередньо заповнені, попередньо відміряні ампули або шприци з рідкими композиціями, або пігулки, таблетки, капсули або тому подібне, у випадку твердих композицій. У таких композиціях сполука за винаходом формули I звичайно являє собою мінорний компонент (приблизно від 0,1 приблизно до 50 % за масою або переважно приблизно від 1 приблизно до 40 % за масою), де інше являє собою різні наповнювачі або носії і технологічні добавки, які можна використовувати для формування бажаної форми дозування. Рідкі форми, що підходять для перорального введення, можуть містити придатні водні або неводні наповнювачі з буферами, суспендуючими і диспергуючими засобами, забарвлювальними речовинами, ароматами і т. п. Тверді форми можуть містити, наприклад, якінебудь з наступних інгредієнтів або сполуки за винаходом зі схожими властивостями: зв'язувальний засіб, такий, як мікрокристалічна целюлоза, трагакантова камедь або желатин; ексципієнт, такий, як крохмаль або лактоза, засіб для поліпшення розпадання, такий, як альгінова кислота, Primogel або кукурудзяний крохмаль; змащувальний засіб, такий, як стеарат магнію; ковзний засіб, такий, як колоїдний діоксид кремнію; підсолоджувач, такий, як сахароза або сахарин; або ароматизатор, такий, як перцева м'ята або апельсиновий ароматизатор. Ін'єктовані композиції типово основані на ін'єктованому стерильному фізіологічному розчині або фосфатно-сольовому буфері або інших ін'єктованих носіях, відомих у даній галузі. Як раніше, активна сполука за винаходом формули I у таких композиціях типово являє собою мінорний компонент, що часто становить приблизно від 0,05 до 10 % за масою, причому інше являє собою ін'єктований носій і т. п. Трансдермальні композиції типово формулюють у вигляді топічної мазі або крему, що містить активний інгредієнт(и), звичайно в кількості в діапазоні приблизно від 0,01 приблизно до 20 % за масою, переважно приблизно від 0,1 приблизно до 20 % за масою, переважно приблизно від 0,1 приблизно до 10 % за масою, і більш переважно приблизно від 0,5 приблизно до 15 % за масою. Коли формулюють у вигляді мазі, активні інгредієнти типово поєднують або з парафіновою або змішуваною з водою основою мазі. Альтернативно, активні інгредієнти можна формулювати в кремі, наприклад, із застосуванням основи крему масло-в-воді. Такі трансдермальні сполуки добре відомі в даній галузі і звичайно містять додаткові інгредієнти для того, щоб підсилювати проникнення в шкіру або стабільність активних інгредієнтів або складу. Усі такі відомі трансдермальні склади й інгредієнти включені в об'єм даного винаходу. Сполуку за винаходом формули I також можна вводити за допомогою трансдермального пристрою. Відповідно, трансдермальне введення можна виконувати із застосуванням пластиру за типом резервуара або пористої мембрани або різних твердих матриць. Описані вище компоненти композицій, які вводяться перорально, ін'єктованих композицій або композицій, які вводяться топічно, є лише репрезентативними. Інші матеріали, а також способи обробки і т. п., викладені в Part 8 у Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, включеному в даний документ за допомогою посилання. Сполуку за винаходом формули I також можна вводити у формах з уповільненим вивільненням або із систем доставки лікарських засобів з уповільненим вивільненням. Опис репрезентативних матеріалів з уповільненим вивільненням можна знайти в Rеміngtоn's Pharmaceutical Sciences. Наступні приклади складів ілюструють репрезентативні фармацевтичні композиції, які можна одержувати відповідно до даного винаходу. Однак даний винахід не обмежений наступними фармацевтичними композиціями. Склад 1 - Таблетки Сполуку за винаходом формули I можна змішувати у вигляді сухого порошку із сухим зв'язувальним засобом желатин приблизно в масовому співвідношенні 1:2. Незначну кількість стеарату магнію можна додавати як змащувальний засіб. Суміш можна формувати в таблетки 240-270 мг (80-90 мг активної сполуки за винаходом формули I на таблетку) у таблетковому пресі. Склад 2 - Капсули 10 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сполуку за винаходом формули I можна змішувати у вигляді сухого порошку з розріджувачем крохмалем приблизно в масовому співвідношенні 1:1. Сумішшю можна заповнювати 250 мг капсули (125 мг активної сполуки за винаходом формули I на капсулу). Склад 3 - Рідина Сполуку за винаходом формули I (125 мг) можна змішувати із сахарозою (1,75 г) і ксантановою камеддю (4 мг), і одержувану суміш ретельно перемішувати, пропускати через США сито 10 меш і потім змішувати з попередньо одержаним розчином мікрокристалічної целюлози і карбоксиметилцелюлози натрію (11:89, 50 мг) у воді. Бензоат натрію (10 мг), ароматизатор і барвник можна розводити у воді і додавати при перемішуванні. Після цього при перемішуванні можна додавати достатньо води. Крім того, достатньо води можна додавати після цього, щоб одержувати загальний об'єм 5 мл. Склад 4 - Таблетки Сполуку за винаходом формули I можна змішувати у вигляді сухого порошку із сухим зв'язувальним засобом желатином приблизно в масовому співвідношенні 1:2. Незначну кількість стеарату магнію можна додавати як змащувальний засіб. Суміш можна формувати в 450-900 мг таблетки (150-300 мг активної сполуки за винаходом формули I) у таблетковому пресі. Склад 5 - Ін'єкція Сполуку за винаходом формули I можна розчиняти або суспендувати у забуференому стерильному ін'єктованому водному фізіологічному розчині до концентрації приблизно 5 мг/мл. Склад 6 - Топічний засіб Стеариловий спирт (250 г) і білий вазелін (250 г) можна молоти приблизно при 75 °C і потім можна додавати суміш сполуки за винаходом формули I (50 г), метилпарабену (0,25 г), пропілпарабену (0,15 г), лаурилсульфату натрію (10 г) і пропіленгліколю (120 г), розчинених у воді (приблизно 370 г) і одержувану суміш можна перемішувати доти, поки вона не загусне. СПОСОБИ ЛІКУВАННЯ В одному з варіантів здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування в медицині. У конкретному варіанті здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту. В іншому варіанті здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при виготовленні лікарського засобу для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту. В одному з варіантів здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I й інший терапевтичний засіб. У конкретному варіанті здійснення інший терапевтичний засіб являє собою засіб для лікування артриту. У конкретнішому варіанті здійснення, інший терапевтичний засіб являє собою засіб для лікування ревматоїдного артриту. У найконкретнішому варіанті здійснення інший терапевтичний засіб являє собою сполуку за винаходом формули II. У додаткових аспектах способу лікування даний винахід передбачає способи профілактики і/або лікування ссавця, який схильний до або страждає від запального стану, ці способи включають уведення терапевтично ефективної кількості сполуки за винаходом формули I або однієї або декількох фармацевтичних композицій, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення запальний стан вибраний з ревматоїдного артриту, остеоартриту, алергійного захворювання дихальних шляхів (наприклад, астми) і запальних захворювань кишечнику (наприклад, хвороби Крона або виразкового коліту). В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці запального стану. У конкретному варіанті здійснення запальний стан вибирають із ревматоїдного артриту, остеоартриту, алергійного захворювання дихальних шляхів (наприклад, астми) і запальних захворювань кишечнику. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування у 11 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 виготовленні лікарського засобу для лікування або профілактики запального стану. У конкретному варіанті здійснення запальний стан вибирають із ревматоїдного артриту, остеоартриту, алергійного захворювання дихальних шляхів (наприклад, астми) і запальних захворювань кишечнику (наприклад, хвороби Крона або виразкового коліту). В аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від алергійної реакції, що включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики алергійного захворювання дихальних шляхів, синуситу, екземи і/або висипу, харчових алергій або алергій на отрути комах. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці алергійної реакції. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики алергійного захворювання дихальних шляхів, синуситу, екземи і/або висипу, харчових алергій або алергій на отрути комах. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування у виготовленні лікарського засобу для лікування або профілактики алергійної реакції. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики алергійного захворювання дихальних шляхів, синуситу, екземи і/або висипу, харчових алергій або алергій на отрути комах. У додаткових аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від аутоімунного захворювання, що включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення аутоімунне захворювання вибирають із ревматоїдного артриту, COPD, астми, системного червоного вовчака, цукрового діабету I типу, псоріатичного артриту, анкілозивного спондиліту, ювенільного ідеопатичного артриту і запального захворювання кишечнику (наприклад, хворобу Крона або виразковий коліт). У конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою системний червоний вовчак. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит або псоріатичний артрит. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою запальне захворювання кишечнику (наприклад, хворобу Крона або виразковий коліт). В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці аутоімунного захворювання. У конкретному варіанті здійснення аутоімунне захворювання вибирають з ревматоїдного артриту, COPD, астми, системного червоного вовчака, цукрового діабету I типу, псоріатичного артриту, анкілозивного спондиліту, ювенільного ідеопатичного артриту і запального захворювання кишечнику (наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт). У конкретнішому варіанті здійснення, аутоімунне захворювання являє собою системний червоний вовчак. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит або псоріатичний артрит. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою запальне захворювання кишечнику (наприклад, хворобу Крона або виразковий коліт). В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування у виготовленні лікарського засобу для лікування або профілактики аутоімунного захворювання. У конкретному варіанті здійснення аутоімунне захворювання вибирають із ревматоїдного артриту, COPD, астми, системного червоного вовчака, цукрового діабету I типу, псоріатичного артриту, анкілозивного спондиліту, ювенільного ідеопатичного артриту і запального захворювання кишечнику (наприклад, хвороба Крона або виразковий коліт). У конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою системний червоний вовчак. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення аутоімунне захворювання являє собою ревматоїдний артрит або псоріатичний артрит. У ще одному конкретнішому варіанті здійснення, аутоімунне захворювання являє собою запальне захворювання кишечнику (наприклад, хворобу Крона або виразковий коліт). У додаткових аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від проліферативного захворювання, ці 12 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 способи включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення проліферативне захворювання являє собою злоякісну пухлину (наприклад, солідні пухлини, такі, як лейоміосаркома матки або злоякісна пухлина передміхурової залози), Tклітинну лімфому шкіри, злоякісну пухлину молочної залози, лейкоз (наприклад, AML, ALL або CLL), множинну мієлому і/або псоріаз. У конкретнішому варіанті здійснення проліферативне захворювання являє собою псоріаз. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці проліферативного захворювання. У конкретному варіанті здійснення проліферативне захворювання являє собою злоякісну пухлину (наприклад, солідні пухлини, такі, як лейоміосаркома матки або злоякісна пухлина передміхурової залози), T-клітинну лімфому шкіри, злоякісну пухлину молочної залози, лейкоз (наприклад, AML, ALL або CLL), множинну мієлому і/або псоріаз. У конкретнішому варіанті здійснення, проліферативне захворювання являє собою псоріаз. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування у виготовленні лікарського засобу для лікування або профілактики проліферативного захворювання. У конкретному варіанті здійснення проліферативне захворювання являє собою злоякісну пухлину (наприклад, солідні пухлини, такі, як лейоміосаркома матки або злоякісна пухлина передміхурової залози), T-клітинну лімфому шкіри, злоякісну пухлину молочної залози, лейкоз (наприклад, AML, ALL або CLL), множинну мієлому і/або псоріаз. У конкретнішому варіанті здійснення, проліферативне захворювання являє собою псоріаз. У додаткових аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від відторгнення трансплантата, ці способи включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики відторгнення трансплантата органа. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці відторгнення трансплантата. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики відторгнення трансплантата органа. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування у виготовленні лікарського засобу для лікування або профілактики відторгнення трансплантата. У конкретному варіанті здійснення винахід стосується способів лікування або профілактики відторгнення трансплантата органа. В одному з аспектів способу лікування даний винахід передбачає спосіб лікування або профілактики в ссавця, який схильний до або страждає від захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, ці способи включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці захворювань, що включають погіршення відновлення хряща. Даний винахід також стосується способу лікування або профілактики уроджених мальформацій хряща, що включає введення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці уроджених мальформацій хряща. У додаткових аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6, ці способи включають уведення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті 13 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 здійснення захворювання, пов'язане з гіперсекрецією IL-6, вибирають із хвороби Кастлемана і мезангіального проліферативного гломерулонефриту. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6. У конкретному варіанті здійснення захворювання, пов'язане з гіперсекрецією IL-6, вибирають із хвороби Кастлемана і мезангіального проліферативного гломерулонефриту. У додаткових аспектах способів лікування даний винахід передбачає способи лікування або профілактики ссавця, який схильний до або страждає від захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією інтерферонів, ці способи включають введення терапевтично ефективної кількості однієї або декількох з фармацевтичних композицій або сполуки за винаходом формули I, описаних у даному документі, для лікування або профілактики зазначеного стану. У конкретному варіанті здійснення захворювання, пов'язане з гіперсекрецією інтерферону, вибирають із системного і шкірного червоного вовчака, вовчакового нефриту, дерматоміозиту, синдрому Шегрена, псоріазу і ревматоїдного артриту. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, для застосування при лікуванні або профілактиці захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією інтерферонів. У конкретному варіанті здійснення захворювання, пов'язане з гіперсекрецією інтерферону, вибирають із системного і шкірного червоного вовчака, вовчакового нефриту, дерматоміозиту, синдрому Шегрена, псоріазу і ревматоїдного артриту. Конкретна схема за даним способом включає введення суб'єкту, що страждає на захворювання, в яке залучене запалення, зокрема, ревматоїдний артрит, остеоартрит, алергійне захворювання дихальних шляхів (наприклад, астмою) і/або запальні захворювання кишечнику, терапевтично ефективної кількості сполуки за винаходом формули I протягом періоду часу, достатнього для того, щоб знижувати рівень запалення в суб'єкта і переважно зупиняти процеси, що відповідають за зазначене запалення. Конкретний варіант здійснення способу включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки за винаходом формули I суб'єкту-пацієнту, що страждає від або схильному до розвитку ревматоїдного артриту, протягом періоду часу, достатнього для того, щоб знижувати або запобігати, відповідно, запаленню в суглобах зазначеного пацієнта, і переважно зупиняти, процеси, що відповідають за зазначене запалення. Додаткова конкретна схема даного способу включає введення суб'єкту, що страждає від захворювання або стану, що відрізняється руйнуванням хряща або суглобів (наприклад, ревматоїдний артрит і/або остеоартрит), терапевтично ефективної кількості сполуки за винаходом формули I протягом періоду часу, достатнього для того, щоб знижувати і переважно зупиняти нескінченні процеси, що відповідають за зазначене руйнування. Конкретний варіант здійснення способу включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки за винаходом формули I суб'єкту-пацієнту, що страждає від або схильному до розвитку остеоартриту, протягом періоду часу, достатнього для того, щоб знижувати або запобігати, відповідно, руйнуванню хряща в суглобах зазначеного пацієнта, і переважно зупиняти, нескінченні процеси, що відповідають за зазначене руйнування. У конкретному варіанті здійснення зазначена сполука за винаходом формули I може виявляти анаболічні і/або антикатаболічні властивості в хрящі. В одному з аспектів даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, де сполуку вводять у від однієї до чотирьох (1-4) регулярних дозах кожну добу і зокрема від однієї до трьох (1-3) регулярних дозах кожну добу, типово від однієї до двох (1-2) регулярних дозах кожну добу і найбільш типово в одній (1) регулярній дозі кожну добу. В іншому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули I для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, де сполуку вводять у від однієї до тринадцяти (1-13) регулярних доз за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення сполуку за винаходом формули I вводять у від однієї до дванадцяти (1-12), 14 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 від однієї до десяти (1-10) або від двох до семи (2-7) регулярних дозах за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення сполуку за винаходом формули I вводять раз на тиждень. У додатковому аспекті даний винахід передбачає сполуку за винаходом формули II для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, де сполуку вводять у від однієї до тринадцяти (1-13) регулярних дозах за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення сполуку за винаходом формули II вводять у від однієї до дванадцяти (1-12), від однієї до десяти (1-10) або від двох до семи (2-7) регулярних дозах за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення сполуку за винаходом формули II вводять раз на тиждень. У ще одному додатковому аспекті даний винахід передбачає комбінацію сполуки за винаходом формули I і сполуки за винаходом формули II для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, де сполуку вводять у від однієї до чотирьох (1-4) регулярних дозах кожну добу і зокрема від однієї до трьох (1-3) регулярних дозах кожну добу, типово від однієї до двох (1-2) регулярних дозах кожну добу, і найбільш типово одну (1) регулярну дозу кожну добу. У ще одному іншому додатковому аспекті даний винахід передбачає комбінацію сполуки за винаходом формули I і сполуки за винаходом формули II для застосування при профілактиці і/або лікуванні запальних станів, аутоімунних захворювань, проліферативних захворювань, алергії, відторгнення трансплантата, захворювань, що включають погіршення відновлення хряща, уроджених мальформацій хряща і/або захворювань, пов'язаних з гіперсекрецією IL-6 або інтерферонів, зокрема, ревматоїдного артриту, де сполуку вводять у від однієї до тринадцяти (1-13) регулярних дозах за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення комбінацію сполуки за винаходом формули I і сполуки за винаходом формули II вводять у від однієї до дванадцяти (1-12), від однієї до десяти (1-10) або від двох до семи (2-7) регулярних дозах за двотижневий період. У конкретному варіанті здійснення комбінацію сполуки за винаходом формули I і сполуки за винаходом формули II вводять раз на тиждень. Рівні ін'єкційних доз варіюють приблизно від 0,1 мг/кг/год до щонайменше 10 мг/кг/год, усі протягом приблизно від 1 приблизно до 120 год і частково від 24 до 96 год. Також можна вводити болюс для попереднього завантаження приблизно від 0,1 мг/кг приблизно до 10 мг/кг або більше, щоб досягати достатніх рівнів стійкого стану. Приблизно, максимальна сумарна доза не перевищує приблизно 1 г/добу для людини-пацієнта від 40 до 80 кг. Для профілактики і/або лікування тривалих станів, таких, як дегенеративні стани, схему лікування звичайно розтягують на багато місяців або років, так що пероральне дозування краще для зручності і терпіння пацієнта. При пероральному дозуванні від однієї до чотирьох (1-4) регулярних доз кожну добу, зокрема, від однієї до трьох (1-3) регулярних доз кожну добу, типово від однієї до двох (1-2) регулярних доз кожну добу і найбільш типово одна (1) регулярна доза кожну добу являють собою репрезентативні схеми. Альтернативно для лікарських засобів із тривалим ефектом, при пероральному дозуванні, один раз на два тижнів, один раз на тиждень і один раз на добу являють собою репрезентативні схеми. Зокрема, схема дозування може бути кожні 1-14 доби, конкретніше 1-10 доби, навіть конкретніше 1-7 доби і найбільш конкретно 1-3 доби. При застосуванні цих патернів дозування кожна доза передбачає приблизно від 1 приблизно до 1000 мг сполуки за винаходом формули I, причому кожна конкретна доза передбачає приблизно від 10 приблизно до 500 мг і зокрема приблизно від 30 приблизно до 250 мг. При застосуванні цих патернів дозування кожна доза передбачає приблизно від 1 приблизно до 1000 мг сполуки за винаходом формули II, причому кожна конкретна доза передбачає приблизно від 10 приблизно до 500 мг і зокрема приблизно від 30 приблизно до 250 мг. Трансдермальні дози звичайно вибирають для того, щоб забезпечувати схожі або нижчі рівні доз, ніж досягають при застосуванні ін'єкційних доз. Коли використовують для того, щоб запобігати початку стану, сполуку за винаходом формули I варто вводити пацієнту з ризиком розвитку стану, типово за порадою і під спостереженням лікаря, при рівнях дози, описаних вище. Пацієнти з ризиком розвитку конкретного стану звичайно включать тих, які мають стан у сімейному анамнезі, або тих, кого 15 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ідентифікували за допомогою генетичного або тестування скринінгу як особливо схильних до розвитку стану. Сполуку за винаходом формули I можна вводити у вигляді єдиного активного засобу або її можна вводити в комбінації з іншими терапевтичними засобами, включаючи інші сполуки за винаходом, що демонструють ту ж або схожу терапевтичну активність і які визначають як безпечні й ефективні для такого комбінованого введення. У конкретному варіанті здійснення спільне введення двох (або більше) засобів робить можливими значно нижчі дози кожного, що підлягає застосуванню, тим самим знижуючи побічні ефекти, що спостерігаються. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I або фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, вводять як лікарський засіб. У конкретному варіанті здійснення зазначена фармацевтична композиція додатково містить додатковий активний інгредієнт. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики захворювання, в яке залучене запалення; конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим, імунорегуляторні засоби, наприклад, азатіоприн, кортикостероїди (наприклад, преднізолон або дексаметезон), циклофосфамід, циклоспорин A, такролімус, мікофенолат мофетил, муромонаб-CD3 (OKT3, наприклад, ортоколон®), ATG, аспірин, ацетамінофен, ібупрофен, напроксен, і піроксикам. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики артриту (наприклад, ревматоїдного артриту); конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим, аналгетики, нестероїдні протизапальні засоби (НПЗС), стероїди, синтетичні DMARDS (наприклад, але без обмеження, метотрексат, лефлуномід, сульфасалазин, ауранофін, ауротіомалат натрію, пеніциламін, хлорохін, гідроксихлорохін, азатіоприн, тофацитиніб, барицитніб, фостаматиніб і циклоспорин), і біологічні DMARDS (наприклад, але без обмеження, інфліксимаб, етанерцепт, адалімумаб, ритуксимаб і абатацепт). В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики проліферативних порушень; конкретні засоби включають, але не обмежуючи цим: метотрексат, лейковорин, адріаміцин, преднізон, блеоміцин, циклофосфамід, 5-фторурацил, паклітаксел, доцетаксел, вінкристин, вінбластин, вінорелбін, доксорубіцин, тамоксифен, тореміфен, мегестрол ацетат, анастрозол, гозерелін, моноклональне антитіло проти HER2 (наприклад, герцептин™), капецитабін, гідрохлорид ралоксифену, інгібітори EGFR (наприклад, іреса®, тарцева™, ербітукс™), інгібітори VEGF (наприклад, авастин™), інгібітори протеасом (наприклад, велкад™), глівек® й інгібітори hsp90 (наприклад, 17-AAG). Додатково, сполуку за винаходом формули I можна вводити в комбінації з іншою терапією, включаючи як необмежуючі приклади променеву терапію або хірургічне втручання. У конкретному варіанті здійснення проліферативні збудження вибирають зі злоякісної пухлини, мієлопроліферативного захворювання або лейкемії. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики аутоімунного захворювання, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: глюкокортикоїди, цитостатичні засоби (наприклад, аналоги пурину), алкілуючі засоби (наприклад, азотисті іприти (циклофосфамід), нітрозосечовини, сполуки платини за винаходом й інші), антиметаболіти (наприклад, метотрексат, азатіоприн і меркаптопурин), цитотоксичні антибіотики (наприклад, дактиноміцин, антрацикліни, мітоміцин C, блеоміцин і мітраміцин), антитіла (наприклад, моноклональні антитіла проти CD20, проти CD25 або проти CD3 (OTK3), атгам® і тимоглобулін®), циклоспорин, такролімус, рапаміцин (сиролімус), інтерферони (наприклад, IFN-β), білки, що зв'язують TNF (наприклад, інфліксимаб, етанерцепт або адалімумаб), мікофенолат, фінголімод і міріоцин. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики відторгнення трансплантата, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: інгібітори кальциневрину (наприклад, циклоспорин або такролімус (FK506)), інгібітори mTOR (наприклад, сиролімус, еверолімус), антипроліферативні засоби (наприклад, азатіоприн, мікофенолова кислота), кортикостероїди (наприклад, преднізолон, гідрокортизон), антитіла (наприклад, моноклональні антитіла проти рецептора IL-2Rα, базиліксимаб, даклізумаб), поліклональні антитіла проти T-клітин (наприклад, антитимоцитарний глобулін (ATG), антилімфоцитарний глобулін (ALG)). В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики астми і/або риніту і/або COPD, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: агоністи β2-адренорецептора 16 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (наприклад, сальбутамол, левальбутерол, тербуталін і битолтерол), епінефрин (в інгаляціях або таблетках), антихолінергічні засоби (наприклад, бромід іпратропію), глюкокортикоїди (пероральні або інгаляційні), β2-агоністи тривалої діі (наприклад, салметерол, формотерол, бамбутерол і пероральний альбутерол з уповільненим вивільненням), комбінації інгаляційних стероїдів і тривалої діі бронходілататори (наприклад, флутиказон/салметерол, будесонід/формотерол), антагоністи й інгібітори синтезу лейкотриєнів (наприклад, монтелукаст, зафірлукаст і зилейтон), інгібітори вивільнення медіаторів (наприклад, кромоглікат і кетотифен), біологічні регулятори IgE-відповіді (наприклад, інфліксимаб), антигістаміни (наприклад, цетиризин, цинаризин, фексофенадин) і судинозвужувальні засоби (наприклад, оксиметазолін, ксилометазолін, нафазолін і трамазолін). Додатково, сполуку за винаходом формули I можна вводити в комбінації з невідкладною терапією для астми і/або COPD, така терапія включає введення кисню або киснево-гелієвокисневої суміші, небулізований сальбутамол або тербуталін (необов'язково в комбінації з антихолінергічним засобом (наприклад, іпратропієм), системні стероїди (перорально або внутрішньовенно, наприклад, преднізон, преднізолон, метилпреднізолон, дексаметезон або гідрокортизон), сальбутамол внутрішньовенно, неспецифічні β-агоністи, ін'єкційно або інгаляційно (наприклад, епінефрин, ізоетарин, ізопротеренол, метапротеренол), антихолінергічні засоби (внутрішньовенно або небулізовані, наприклад, глікопіролат, атропін, іпратропій), метилксантини (теофілін, амінофілін, баміфілін), інгаляційні анестетики, що здійснюють бронходилатуючий ефект (наприклад, ізофлуран, галотан, енфлуран), кетамін і сульфат магнію внутрішньовенно. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики запального захворювання кишечнику (IBD), конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: глюкокортикоїди (наприклад, преднізон, будесонід) синтетичні імуномодулюючі засоби, що модифікують захворювання (наприклад, метотрексат, лефлуномід, сульфасалазин, месалазин, азатіоприн, 6меркаптопурин і циклоспорин) і біологічні імуномодулюючі засоби, що модифікують захворювання (інфліксимаб, адалімумаб, ритуксимаб і абатацепт). В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики SLE, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: антиревматичні лікарські засоби, модифікуючі захворювання (DMARD), такі, як протималярійні засоби (наприклад, плаквеніл, гідроксихлорохін), імуносупресанти (наприклад, метотрексат і азатіоприн), циклофосфамід і мікофенолова кислота; імуносупресорні лікарські засоби й анальгетики, такі, як нестероїдні протизапальні засоби, опіати (наприклад, декстропропоксифен і кокодамол), опіоїди (наприклад, гідрокодон, оксикодон, МС контин або метадон) і трансдермальний пластир із фентанілом дюрогезик. В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики псоріазу, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: топічне лікування, таке, як розчини для ванн, зволожувачі, лікувальні креми і мазі, які містять кам’яновугільну смолу, дитранол (антралін), кортикостероїди, такі, як дезоксиметазон (топікорт™), флуоцинонід, аналоги вітаміну D3 (наприклад, кальципотриол), олію аргані і ретиноїди (етретинат, ацитретин, тазаротен), системне лікування, таке, як метотрексат, циклоспорин, ретиноїди, тіогуанін, гідроксисечовина, сульфасалазин, мікофенолат мофетил, азатіоприн, такролімус, складні ефіри фумарової кислоти або біологічні засоби, такі, як амевів™, енбрел™, хуміра™, ремікейд™, раптива™ і устекінумаб (блокатор IL-12 і IL-23). Додатково, сполуку за винаходом формули I можна вводити в комбінації з іншою терапією, включаючи, як необмежуючі приклади, фототерапію або фотохіміотерапію (наприклад, псорален і фототерапія ультрафіолетом A (PUVA)). В одному з варіантів здійснення сполуку за винаходом формули I вводять разом з іншим терапевтичним засобом для лікування і/або профілактики алергійної реакції, конкретні засоби включають, але не обмежуючись цим: антигістамінні засоби (наприклад, цетиризин, дифенгідрамін, фексофенадин, левоцетиризин), глюкокортикоїди (наприклад, преднізон, бетаметазон, беклометазон, дексаметезон), епінефрин, теофілін або антилейкотриєнові (наприклад, монтелукаст або зафірлукаст), антихолінергічні і протизастійні засоби. Спільне введення включає будь-який засіб доставки двох або більше терапевтичних засобів пацієнту як частину однієї і тієї ж схеми лікування, як буде очевидно фахівцю. Хоча два або більше засобів і можна вводити одночасно в одному складі, тобто у вигляді однієї фармацевтичної композиції, це не необхідно. Засоби можна вводити в різних складах і в різні моменти часу. 17 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 В одному з варіантів здійснення даний винахід передбачає фармацевтичну композицію, що містить сполуку за винаходом формули I, і сполуку за винаходом формули II, де співвідношення сполуки за винаходом формули I/формули II становить від 1/5 до 1/20. У конкретному варіанті здійснення співвідношення становить від 1/5 до 1/10. ОСНОВНІ ПРОЦЕДУРИ СИНТЕЗУ Основне Сполуку за винаходом формули I можна легко одержувати з доступних вихідних матеріалів із застосуванням наступних основних способів і процедур. Варто брати до уваги, що коли задають типові або переважні умови процесу (тобто температури, час реакції, молярні співвідношення реагентів, розчинники, тиск і т. д.), інші умови процесу також можна використовувати, якщо не зазначене інше. Оптимальні умови реакції можуть варіювати при застосуванні конкретних реагентів або розчинника, але такі стани може визначати фахівець у даній галузі за допомогою стандартних процедур оптимізації. Додатково, як буде очевидно фахівцям у даній галузі, стандартні захисні групи можуть бути необхідні для того, щоб запобігати протіканню небажаних реакцій із визначеними функціональними групами. Вибір придатної захисної групи для конкретної функціональної групи, а також придатної умови для приєднання і зняття захисних груп добре відомі в даній галузі. Наприклад, множина захисних груп, а також їхнє введення і видалення, описане в T. W. Greene і P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, New York, 1991, і цитованих в них літературних джерелах. Наступні способи представлені в деталях відносно одержання сполуки за винаходом формули I, як визначено вище в даному документі і порівняльних прикладах. Фахівець в галузі органічного синтезу може одержувати сполуку за винаходом формули I з відомих або комерційно доступних вихідних матеріалів і реактивів. Усі реактиви були комерційних сортів і їх використовували, як одержували, без додаткового очищення, якщо не зазначене інше. Комерційно доступні безводні розчинники використовували для реакцій, проведених в інертній атмосфері. У всіх інших випадках використовували хімічно чисті розчинники, якщо не зазначене інше. Колонкову хроматографію здійснювали на силікагелі 60 (35-70 мкм). Тонкошарову хроматографію здійснювали із застосуванням попередньо покритих силікагелем F-254 пластин (товщина - 0,25 мм). 1H ЯМР спектри реєстрували на спектрометрі Bruker DPX 400 ЯМР (400 МГц). Хімічні зсуви (δ) для 1H ЯМР спектрів наведені в мільйонних частках (м. ч.) відносно тетраметилсилану (δ 0,00) або придатного піку залишкового розчинника, тобто CHCl3 (δ 7,27), як внутрішнього еталону. Мультиплетність задають у вигляді синглету (с.), дублету (д.), триплету (т.), квартету (кв.), мультиплету (м.) і уширеного (ушир.). Константи взаємодіі (J) дані в Гц. Спектри МС із електророзпиленням одержували на платформі LC/MS спектрометра Micromass. Для LC/MS аналізу використовували колонки: Hichrom, Kromasil Eternity, 2,5 мкм C18, 1504,6 мм, Waters Xbridge 5 мкм C18 (2), 2504,6 мм (артикул 86003117), Waters Xterra MS 5 мкм C18, 1004,6 мм (картридж Plus Guard) (артикул 186000486), Gemini-NX 3 мкм C18 1003,0 мм (артикул 00D-4453-Y0), Phenomenex Luna 5 мкм C18 (2), 1004,6 мм (картридж Plus Guard) (артикул 00D-4252-E0), Kinetix Fused-Core 2,7 мкм C18 1004,6 мм (артикул 00D-4462-E0), Supelco, Ascentis® Express C18 (артикул 53829-U), або Hichrom Halo C18, 2,7 мкм C18, 1504,6 мм (артикул 92814-702). LC-MS реєстрували на Waters Micromass ZQ, з'єднаному з HPLC Waters 2795, обладнаному УФ детектором Waters 2996. LC також проводили на HPLC Agilent 1100, з'єднаному з УФ детектором Agilent G1315A. Препаративна HPLC: Waters Xbridge Prep C18 5 мкм ODB 19 мм ID100 мм L (номер виробу 186002978). В усіх способах використовують градієнти MeCN/H2O. H2O містить або 0,1 % TFA або 0,1 % NH3. Список скорочень, які використовуються в експериментальному розділі: AUC АРС DCM DiPEA MeCN DMF Кат. TFA THF ЯМР Площа під кривою Аденоматозний поліпоз товстої кишки Дихлорметан N,N-діізопропілетиламін Ацетонітрил N,N-диметилформамід Каталітична кількість Трифтороцтова кислота Тетрагідрофуран Ядерний магнітний резонанс 18 UA 112804 C2 Диметилсульфоксид Рідинна хроматографія-масLC-MS спектрометрія м. ч. Мільйонні частки EtOAc Етилацетат Rt Час утримання s Синглет br s Уширений синглет m Мультиплет хв Хвилина мл Мілілітр мкл Мікролітр г Грам мг Міліграм [1,1'-біс(дифенілфосфіно)фероцен] PdCl2dppf дихлорпаладій(II) ММР Матриксна металопротеїназа РНК Рибонуклеїнова кислота АРМА Ацетат 4-амінофенілртуті FBS Ембріональна теляча сироватка Комплементарна кДНК дезоксирибонуклеїнова кислота h Година FITC Флуоресцеїнізотіоціанат ммоль Мілімолі Quaque Die (дозування один раз QD на добу) BID Bis in Die (два рази кожну добу) Віднос. Відносний Високоефективна рідинна HPLC хроматографія DMSO 5 10 15 20 ОДЕРЖАННЯ СПОЛУКИ ЗА ВИНАХОДОМ ЗА ДОПОМОГОЮ СИНТЕЗУ Приклад 1. Синтез сполук 1.1. Шлях 1 1.1.1. Синтез 5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2-іламіну (Проміжна сполука 3) 1.1.1.1. 1-(6-бромпіридин-2-іл)-3-карбоетокситіосечовина (2) У розчин 2-аміно-6-бромпіридину (1) (253,8 г, 1,467 моль) у DCM (2,5 л), охолоджений до 5 °C, додавали етоксикарбонілізотіоціанат (173,0 мл, 1,467 моль) по краплинам протягом 15 хв. Після цього реакційну суміш залишали нагріватися до кімнатної температури (20 °C) і перемішували протягом 16 год. Випаровування in vacuo давало тверду речовину, яку збирали за допомогою фільтрування, ретельно промивали бензином (3600 мл) і сушили на повітрі, щоб одержати (2). Тіосечовину використовували як таку на наступній стадіі без будь-якого очищення. 1Н-ЯМР (400 Мгц, CDCl3) δ 12,03 (1Н, уш.с, NH), 8,81 (1Н, д, J=7,8 Гц, Н-3), 8,15 (1Н, уш.с, NH), 7,60 (1Н, т, J=8,0 Гц, Н-4), 7,32 (1Н, дд, J=7,7 і 0,6 Гц, Н-5), 4,31 (2Н, кв., J=7,1 Гц, CH2), 1,35 (3Н, т, J=7,1 Гц, CН3). 1.1.1.2. 5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2-іламін (3) У суспензію гідроксиламінгідрохлориду (101,8 г, 1,465 моль) у EtOH/MeOH (1:1, 900 мл) додавали N,N-діізопропілетиламін (145,3 мл, 0,879 моль) і суміш перемішували при кімнатній температурі (20 °C) протягом 1 год. Після цього додавали 1-(6-бромпіридин-2-іл)-3карбоетокситіосечовину (2) (89,0 г, 0,293 моль) і суміш повільно нагрівали зі зворотним 19 UA 112804 C2 5 10 холодильником (примітка: вибільний скрубер був потрібний для того, щоб гасити H2S, який виділявся). Після 3 год нагрівання зі зворотним холодильником суміш залишали охолоджуватися і фільтрували для того, щоб збирати осаджену тверду речовину. Додатковий продукт збирали за допомогою випарювання фільтрату in vacuo, додавання H2O (250 мл) і фільтрування. Об'єднану тверду речовину промивали послідовно в H2O (250 мл), EtOH/MeOH (1:1, 250 мл) і Et2O (250 мл), потім сушили in vacuo, щоб одержувати похідне триазолопіридину (3) у вигляді твердої речовини. Сполуку використовували як таку на наступній стадіі без будьякого очищення. 1Н-ЯМР (400 Мгц, ДМСО-d6) δ 7,43-7,34 (2Н, г, 2 ароматичний-H), 7,24 (1Н, дд, J=6,8 і 1,8 Гц, ароматичний-H), 6,30 (2Н, уш, NH2); m/z 213/215 (1:1, Г+Н+, 100 %). 1.1.2. Синтез 4-[4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]діоксаборолан-2-іл)бензил]тіоморфолін-1,1діоксиду (проміжна сполука 4) 15 20 2-(4-бромметилфеніл)-4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]діоксаборолан (1 екв.) і DIPEA (2 екв.) розчиняли в DCM/MeOH (5:1 об.:об.) під N2 і частинами додавали тіоморфолін 1,1-діоксид (2 екв.). Одержуваний розчин перемішували при кімнатній температурі протягом 16 год. Після цього часу реакцію завершували. Розчинник випаровували. Сполуку екстрагували в EtOAc і воді, промивали сольовим розчином і сушили над безводним MgSO4. Органічні шари фільтрували і випаровували. Кінцеву сполуку виділяли без додаткового очищення. 1.1.3. Синтез 5-[4-(1,1-діоксотіоморфолін-4-ілметил)феніл]-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2іламіну (формула I) 25 30 35 40 4-[4-(4,4,5,5-тетраметил-[1,3,2]діоксаборолан-2-іл)бензил]тіоморфолін-1,1-діоксид (1,1 екв.) додавали в розчин 5-бром-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2-іламіну (4:1). У розчин додавали K2CO3 (2 екв.) і PdCl2dppf (0,03 екв.). Після цього одержувану суміш нагрівали на масляній бані при 90 °C протягом 16 год під N2. Додавали воду і розчин екстрагували етилацетатом. Органічні шари сушили над безводним MgSO4 і випаровували in vacuo. Кінцеву сполуку одержували після очищення флеш-хроматографією. 1Н-ЯМР (400 Мгц, CDCl3) δ 7,94-7,92 (д, 2H), 7,52-7,48 (г, 3Н), 7,37-7,34 (г, 1Н), 7,02-7,00 (г, 1Н), 6,00 (д, 2Н), 3,76 (д, 2Н), 3,15-3,12 (г, 4Н), 2,93-2,91 (г, 4Н). m/z 358,2 (Г+Н+, 100 %). 1.2. Шлях 2 1.2.1. {5-[4-(1,1-діоксотіоморфолін-4-ілметил)феніл]-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2-іл}амід циклопропанкарбонової кислоти (формула II) Сполуку за винаходом формули II можна синтезувати відповідно до процедури, описаної в WO 2010/149769. 20 UA 112804 C2 1.2.2. Синтез 5-[4-(1,1-діоксотіоморфолін-4-ілметил)феніл]-[1,2,4]триазоло[1,5-a]піридин-2іламіну (формула I) Сполуку за винаходом формули I також можна одержувати гідролізом сполуки формули II: 5 10 15 20 25 30 35 40 Хлористоводневу кислоту 30 % водн. (12,06 кг; 3,9 віднос. об'єму) додавали в суспензію сполуки формули II (3,45 кг; 1,0 екв.) у демінералізованій воді (10,0 кг; 3,0 віднос. об'єму). Згодом здійснювали промивання лінії демінералізованою водою (3,4 кг; 1,0 віднос. об'єму). Реакційну суміш нагрівали до 80±5 °C протягом 14,5 год. Після завершення реакції (вихід > 99 %>), реакційну суміш охолоджувалися до 20±5 °C. Реакційну суміш розводили демінералізованою водою (6,8 кг; 2,0 віднос. об'єму) і гідроксид натрію 33 % водн. (9,52 кг; 3,7 віднос. об'єму) дозували на такій швидкості, що температура вмісту реактора залишалася нижче 35 °C. Була потрібна додаткова кількість гідроксиду натрію 33 % водн. (2,55 кг; 1,0 віднос. об'єму), щоб одержувати pН>10. Продукт відфільтровували, промивали два рази демінералізованою водою (1,5 віднос. об'єму) і сушили під вакуумом протягом 1 год, таким чином, одержуючи неочищену сполуку за винаходом формули I. Повторно одержували суспензію неочищеної сполуки формули I (5,70 кг) у демінералізованій воді (23,0 кг; 8,5 віднос. об'єму). Додавали хлористоводневу кислоту 30 % водн. (1,65 кг; 0,7 віднос. об'єму) і демінералізовану воду (4,3 кг; 1,6 віднос. об'єму) і реакційну суміш перемішували при 20±5 °C протягом 45 хв. Оскільки сполука за винаходом формули I не розчинялася повністю, реакційну суміш перемішували при 45±5 °C протягом 1 год. Реакційну суміш фільтрували і залишок промивали демінералізованою водою (2,0 кг 0,75 віднос. об'єму). У фільтрат додавали гідроксид натрію 33 % водн. (1,12 кг; 0,6 віднос. об'єму). Була потрібно додаткова кількість гідроксиду натрію 33 %> водн. (1,01 кг), щоб одержувати pН>10. Одержувану реакційну суміш перемішували при 20±5 °C протягом приблизно 3 год. Продукт відфільтровували, промивали два рази демінералізованою водою (4,1 кг; 1,5 віднос. об'єму), і два рази трет-бутилметиловим простим ефіром (MTBE; 3,0 кг; 1,5 віднос. об'єму) і сушили під вакуумом протягом 15,5 год на фільтрі. Продукт додатково сушили у вакуумній печі при 40±5 °C протягом 202 год, таким чином одержуючи бажану сполуку за винаходом формули I. БІОЛОГІЧНІ ПРИКЛАДИ Приклад 2. Аналізи in vitro 2.1. Аналіз інгібування JAK1 2.1.1. Субстрат полі-GT для аналізу JAK1 Рекомбінантний каталітичний домен JAK1 людини (амінокислоти 866-1154; номер за каталогом PV4774) купували в Invitrogen. 25 нг JAK1 інкубували з 6,25 мкг субстрату полі-GT (Sigma номер за каталогом P0275) у буфері для кіназної реакції (15 мМ Hepes рН 7,5, 0,01 % Tween20, 10 мМ MgCl2, 2 мкМ нерадіоактивного АТФ, 0,25 мКі 33P-γ-АТФ (Perkin Elmer, номер за каталогом NEG602K001MC) кінцеві концентрації) з або без 5 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, кінцева концентрація - 1 %), у загальному об'ємі 25 мкл, у поліпропіленовому 96-ямковому планшеті (Greiner, V-подібне дно). Після 75 хв при 30 °C реакцію зупиняли за допомогою додавання 25 мкл/ямка 150 мМ фосфорної кислоти. Усі зупинені кіназні реакції переносили в попередньо промиті (75 мМ фосфорною кислотою) 96 21 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ямкові фільтрувальні планшети (Perkin Elmer номер за каталогом 6005177) із застосуванням збирача клітин (Perkin Elmer). Планшети промивали 6 разів у 300 мкл на ямку 75 мМ розчину фосфорної кислоти і дно планшетів герметизували. Додавали 40 мкл/ямка Microscint-20, верхню частину планшетів герметизували і здійснювали зчитування із застосуванням Topcount (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання рахунків на хв (рахунки/хв), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкм ставроспорин) з рахунків/хв, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати цю активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((рахунки/хв, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (рахунки/хв, визначені в присутності наповнювача, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполук одержували серійне розведення доз, що уможливлює тестування дозоззалежних ефектів при аналізі JAK1 і обчисленні IC50 для сполуки. Сполуку тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало 1/3 серійне розведення, 8 точок (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) у кінцевій концентрації 1 % DMSO. Коли зростає активність сполуки, одержують більше розведень і/або знижують максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Активність сполуки формули I відносно JAK1 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 460,1, 586, 494,3, 758,2 і 432,7 нМ (середнє 546,26 нМ). 2.1.2. Аналіз JAK1 з пептидом Ulight-JAK1 Рекомбінантний JAK1 людина (каталітичний домен, амінокислоти 866-1154; номер за каталогом PV4774) купували в Invitrogen. 1 нг JAK1 інкубували з 20 нМ пептиду Ulight-JAK1 (tyr1023) (Perkin Elmer номер за каталогом TRF0121) у буфері для кіназної реакції (15 мМ MOPS рН 6,8, 0,01 % Brij-35, 5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 7 мкМ АТФ) з або без 4 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, 1 % кінцева концентрація), у загальному об'ємі 20 мкл, у білому планшеті 384 Opti (Perkin Elmer, номер за каталогом 6007290). Після 60 хв при кімнатній температурі реакції зупиняли за допомогою додавання 20 мкл/ямка суміші для виявлення (1  буфер для виявлення (Perkin Elmer, номер за каталогом CR97-100C), 0,5 нМ європій-антифосфотирозину (PT66) (Perkin Elmer, номер за каталогом AD0068), 10 мМ ЕДТА). Зчитування здійснювали з застосуванням Envision з збудженням на 320 нм і вимірюванням випромінювання на 615 нм (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання відносних одиниць флуоресценції (RFU), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкМ ставроспорин), з RFU, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати цю активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((RFU, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки - RFU, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (RFU, визначені в присутності наповнювача - RFU, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполуки одержували серійне розведення доз, що уможливлює тестування дозозалежних ефектів в аналізі JAK1 і обчислення IC50 для сполуки. Сполуку звичайно тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало серійне розведення 1/5, 10 точок у кінцевій концентрації 1 % DMSO. Коли активність сполуки зростала, одержували більше розведень і/або знижували максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Дані виражали у вигляді середнього IC50 з аналізу ± стандартна помилка середнього. Активність сполуки формули I відносно JAK1 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 346,8, 714,3, 166,6, 103,3, 187,2, 582,3, 295,3, 241,7, 159,2, 355,3 і 221,6 нМ (середнє = 307 нМ). 2.1.3. Аналіз визначення Ki JAK1 Для визначення Ki різні кількості сполуки змішують із ферментом і проводять ферментативну реакцію як функцію від концентрації АТФ. Ki визначають за допомогою графіка подвійної зворотної залежності Km від концентрації сполуки (графік Лайнуівера-Берка). В аналізі використовують 1 нг JAK1 (Invitrogen, PV4774). Субстрат являє собою 20 нМ пептиду Ulight-JAK-1 (Tyrl023) (Perkin Elmer, TRF0121). Реакцію здійснюють у 15 мМ MOPS рН 6,8, 0,01 %, Brij-35, 2 мМ DTT, 5 мМ MgCl2 з різними концентраціями АТФ і сполуки. Фосфорилований субстрат вимірюють із застосуванням міченого європієм антитіла проти фосфотирозину PT66 (Perkin Elmer, AD0068), як описано в 1.1.2. Зчитування здійснюють на EnVision (Perkin Elmer) зі збудженням на 320 нм і наступним випромінюванням на 615 нм і 665 нм. 22 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2.2. Аналіз інгібування JAK2 2.2.1. Субстрат полі-GT для аналізу JAK2 Рекомбінантний каталітичний домен JAK2 людини (амінокислоти 808-1132; номер за каталогом PV4210) купували в Invitrogen. 0,05 мОД JAK2 інкубували з 2,5 мкг субстрату полі-GT (Sigma номер за каталогом P0275) у буфері для кіназної реакції (10 мМ MOPS рН 7,5, 0,5 мМ ЕДТА, 0,01 % Brij-35, 1 мМ DTT, 15 мМ MgAc, 1 мкМ нерадіоактивного АТФ, 0,25 мкКі 33P-γ-АТФ (Perkin Elmer, номер за каталогом NEG602K001MC) кінцеві концентрації) з або без 5 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, 1 % кінцева концентрація), у загальному об'ємі 25 мкл, у поліпропіленовому 96-ямковому планшеті (Greiner, V-подібне дно). Після 90 хв при 30 °C реакцію зупиняли за допомогою додавання 25 мкл/ямка 150 мМ фосфорної кислоти. Усі зупинені кіназні реакції переносили в попередньо промиті (75 мМ фосфорною кислотою) 96-ямкові фільтрувальні планшети (Perkin Elmer номер за каталогом 6005177) із застосуванням збирача клітин (Perkin Elmer). Планшети промивали 6 разів із застосуванням 300 мкл на ямку 75 мМ розчину фосфорної кислоти і дно планшетів герметизували. Додавали Microscint-2040 мкл/ямка, верхню частину планшетів герметизували і здійснювали зчитування із застосуванням Topcount (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання рахунків у хв (рахунки/хв), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкМ ставроспорин) з рахунків/хв, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати цю активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((рахунки/хв, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (рахунки/хв, визначені в присутності наповнювача, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполук одержували серійне розведення доз, що уможливлює тестування дозозалежних ефектів в аналізі JAK2 і обчислення IC50 для кожної сполуки. Сполуку тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало 1/3 серійне розведення, 8 точок (20 мкМ - 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) у кінцевій концентрації 1 % DMSO. Коли зростала активність серії сполуки, одержували додаткові розведення і/або знижували максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Активність сполуки формули I відносно JAK1 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином одержуючи значення IC50 566,9, 365,5, 256,4, 915,1 і 1017 нМ (середнє = 624 нМ). 2.2.2. Аналіз JAK2 з пептидом Ulight-JAK1 Рекомбінантний JAK2 людини (каталітичний домен, амінокислоти 866-1154; номер за каталогом PV4210) купували в Invitrogen. 0,0125 мкОд JAK2 інкубували з 25 нМ пептиду UlightJAK1 (tyr1023) (Perkin Elmer номер за каталогом TRF0121) у буфері для кіназної реакції (25 мМ HEPES рН 7,0, 0,01 % Triton X-100, 7,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 7,5 мкМ АТФ) з або без 4 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, 1 % кінцева концентрація), у загальному об'ємі 20 мкл, у білому планшеті 384 Opti (Perkin Elmer, номер за каталогом 6007290). Після 60 хв при кімнатній температурі реакції зупиняли за допомогою додавання 20 мкл/ямка суміші для виявлення (1 буфер для виявлення (Perkin Elmer, номер за каталогом CR97-100C), 0,5 нм європій-антифосфотирозину (PT66) (Perkin Elmer, номер за каталогом AD0068), 10 мМ ЕДТА). Здійснювали зчитування із застосуванням EnVision зі збудженням на 320 нМ і вимірюванням випромінювання на 615 нм (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання відносних одиниць флуоресценції (RFU), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкМ ставроспорин), з RFU, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати цю активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((RFU, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки, - RFU, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (RFU, визначені в присутності наповнювача, - RFU, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполуки одержували серійне розведення доз, що уможливлює тестування дозозалежних ефектів в аналізі JAK2 і обчислення IC50 для сполуки. Сполуку тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало 1/5 серійне розведення, 10 точок у кінцевій концентрації 1 % DMSO. Коли зростала активність сполуки, одержували додаткові розведення і/або знижували максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Дані виражали у вигляді середнього IC50 з аналізу ± стандартна помилка середнього. Активність сполуки формули I відносно JAK2 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 1031, 351,2, 137,5, 367,2, 310,2, 729,2, 151,7, 203,0, 168,0 і 517,0 (середнє = 397 нМ). 23 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2.2.3. Аналіз визначення Kd/Ki для JAK2 2.2.3.1. Аналіз визначення Ki для JAK2 Для визначення Ki різні кількості сполуки змішують з ферментом і проводять ферментативну реакцію як функцію концентрації АТФ. Ki визначають за допомогою графіка подвійної зворотної залежності Km від концентрації сполуки (графік Лайнуівера-Берка). В аналізі використовують 0,0125 мкОд JAK1 (Invitrogen, PV4210). Субстрат являє собою 25 нМ пептиду Ulight-JAK-1 (Tyr1023) (Perkin Elmer, TRF0121). Реакцію здійснюють у 25 мМ HEPES p7,0, 0,01 % Triton X100, 7,5 мМ MgCl2, 2 мМ DTT з різними концентраціями АТФ і сполуки. Фосфорилований субстрат вимірюють із застосуванням мічених європієм антитіл проти фосфотирозину PT66 (Perkin Elmer, AD0068), як описано в 1.2.2. Зчитування здійснюють на EnVision (Perkin Elmer) зі збудженням на 320 нм і наступним випромінюванням на 615 нм і 665 нм. 2.2.3.2. Аналіз визначення Kd для JAK2 JAK2 (Invitrogen, PV4210) використовують у кінцевій концентрації 2,5 нМ. Експеримент зі зв'язування здійснюють у 50 мМ Hepes рН 7,5, 0,01 % Brij-35, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA із застосуванням 25 нМ Kinase Tracer 236 (Invitrogen, PV5592) і 2 нМ Europium-anti-GST (Invitrogen, PV5594) з мінливими концентраціями сполуки. Виявлення Tracer здійснюють відповідно до процедури виробника. 2.2.4. Аналіз інгібування JAK3 Рекомбінантний каталітичний домен JAK3 людини (амінокислоти 795-1124; номер за каталогом 08-046) купували в Carna Biosciences. 0,5 нг білка JAK3 інкубували з 2,5 мкг субстрату полі-GT (Sigma номер за каталогом P0275) у буфері для кіназної реакції (25 мМ Tris рН 7,5, 0,5 мМ EGTA, 10 мМ MgCl2, 2,5 мМ DTT, 0,5 мМ Na3VO4, 5 мМ b-гліцеролфосфат, 0,01 % Triton X100, 1 мкМ нерадіоактивного АТФ, 0,25 мкКі 33P-γ-АТФ (Perkin Elmer, номер за каталогом NEG602K001MC) кінцеві концентрації) з або без 5 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, 1 % кінцева концентрація), у загальному об'ємі 25 мкл, у поліпропіленовому 96-ямковому планшеті (Greiner, V-подібне дно). Після 45 хв при 30 °C реакції зупиняли за допомогою додавання 25 мкл/ямка 150 мМ фосфорної кислоти. Усі зупинені кіназні реакції переносили в попередньо промиті (75 мМ фосфорною кислотою) 96-ямкові фільтрувальні планшети (Perkin Elmer номер за каталогом 6005177) із застосуванням збирача клітин (Perkin Elmer). Планшети промивали 6 разів у 300 мкл на ямку 75 мМ розчину фосфорної кислоти і дно планшетів герметизували. Додавали Microscint-20 40 мкл/ямка, верхні частини планшетів герметизували і здійснювали зчитування з застосуванням Topcount (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання рахунків на хв (рахунки/хв), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкм ставроспорин), з рахунків/хв, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати цю активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((рахунки/хв, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (рахунки/хв, визначені в присутності наповнювача, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполук одержували серійні розведення доз, що уможливлює тестування дозозалежнихефектів в аналізі JAK3 і обчислення IC50 для сполуки. Сполуку тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало 1/5 серійне розведення, 10 точок у кінцевій концентрації 1 % DMSO. Коли сполука збільшувалася, одержували додаткові розведення і/або знижували максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Активність сполуки формули I відносно JAK3 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 2497, >4000, >4000, >3333, >3333, 3939, >4000, >4000, >4000, 3201 і 3368 (середнє >3606 нМ). 2.2.5. Аналіз визначення Ki для JAK3 Для визначення Ki різні кількості сполуки змішують із ферментом і проводять ферментативну реакцію як функцію від концентрації АТФ. Ki визначають за допомогою графіка подвійної зворотної залежності Km від концентрації сполуки (графік Лайнуівера-Берка). JAK3 (Carna Biosciences, 08-046) використовують у кінцевій концентрації 20 нг/мл. Субстрат являє собою сіль полі(Glu, Tyr) натрію (4:1), молекулярна маса 20000-50000 (Sigma, P0275), Реакцію здійснюють у 25 мМ Tris рН 7,5, 0,01 % Triton X-100, 0,5 мМ EGTA, 2,5 мМ DTT, 0,5 мМ Na3VО4, 5 мМ b-гліцеролфосфат, 10 мМ MgCl2 з різними концентраціями АТФ і сполуки і зупиняють за допомогою додавання 150 мМ фосфорної кислоти. Вимірювання включеного фосфату в субстраті полі-GT виконують за допомогою завантаження зразків на фільтрувальний планшет (із застосуванням збирача, Perkin Elmer) і наступного промивання. Включений 33P у полі-GT вимірюють на сцинтиляційному лічильнику Topcount після додавання сцинтиляційної рідини у фільтрувальні планшети (Perkin Elmer). 24 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2.3. Аналіз інгібування TYK2 Рекомбінантний каталітичний домен TYK2 людини (амінокислоти 871-1187; номер за каталогом 08-147) купували в Carna biosciences. 4 нг TYK2 інкубували з 12,5 мкг субстрату поліGT (Sigma номер за каталогом P0275) у буфері для кіназної реакції (25 мМ Hepes рН 7,2, 50 мМ NaCl, 0,5 мМ ЕДТА, 1 мМ DTT, 5 мМ MnCl2, 10 мМ MgCl2, 0,1 % Brij-35, 0,1 мкМ нерадіоактивного АТФ, 0,125 мкKі 33P-γ-АТФ (Perkin Elmer, номер за каталогом NEG602K001MC) кінцеві концентрації) з або без 5 мкл тестованої сполуки або наповнювача, що міститься (DMSO, 1 % > кінцева концентрація), у загальному об'ємі 25 мкл, у поліпропіленовому 96-ямковому планшеті (Greiner, V-подібне дно). Після 90 хв при 30 °C реакції зупиняли за допомогою додавання 25 мкл/ямка 150 мМ фосфорної кислоти. Усі зупинені кіназні реакції переносили в попередньо промиті (75 мМ фосфорною кислотою) 96-ямкові фільтрувальні планшети (Perkin Elmer номер за каталогом 6005177) із застосуванням збирача клітин (Perkin Elmer). Планшети промивали 6 разів у 300 мкл на ямку 75 мМ розчину фосфорної кислоти і дно планшетів герметизували. Додавали Microscint-20 40 мкл/ямка, верхні частини планшетів герметизували і здійснювали зчитування з застосуванням Topcount (Perkin Elmer). Кіназну активність обчислювали за допомогою віднімання рахунків у хв (рахунки/хв), одержуваних у присутності інгібітора позитивного контролю (10 мкМ ставроспорин), з рахунки/хв, одержуваних у присутності наповнювача. Здатність тестованої сполуки інгібувати його активність визначали як: Процентна частка інгібування = ((рахунки/хв, визначені для зразка в присутності тестованої сполуки, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю), поділені на (рахунки/хв, визначені в присутності наповнювача, - рахунки/хв, визначені для зразка з інгібітором позитивного контролю))  100. Для сполук одержували серійні розведення доз, що уможливлює тестування дозозалежних ефектів в аналізі TYK2 і обчислення IC50 для кожної сполуки. Кожну сполуку звичайно тестували в концентрації 20 мкМ, після чого слідувало 1/3 серійне розведення, 8 точок (20 мкМ 6,67 мкМ - 2,22 мкМ - 740 нМ - 247 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) у кінцевій концентрації 1 % DMSO. При збільшенні активності серії сполук одержували додаткові розведення і/або знижували максимальну концентрацію (наприклад, 5 мкМ, 1 мкМ). Активність сполуки формули I відносно TYK2 визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 >3333, >3333, >3333, 1973, 2121, 3852, 3819, і 2207 (середнє >2996 нМ). 2.3.1. Аналіз визначення Kd/Ki для TYK2 2.3.1.1. Аналіз визначення Ki для TYK2 Для визначення Ki різні кількості сполуки змішують з ферментом і проводять ферментативну реакцію як функцію від концентрації АТФ. Ki визначають за допомогою графіка подвійної зворотної залежності Km від концентрації сполуки (графік Лайнуівера-Берка). TYK2 (Carna Biosciences, 08-147) використовують у кінцевій концентрації 160 нг/мл. Субстрат являє собою сіль полі(Glu, Tyr) натрію (4:1), молекулярна маса 20000-50000 (Sigma, P0275) Реакцію здійснюють у 25 мМ Hepes рН 7,2, 50 мМ NaCl, 0,5 мМ ЕДТА, 1 мМ DTT, 5 мМ MnCl2, 10 мМ MgCl2, 0,1 % Brij-35 з різними концентраціями АТФ і сполуки і зупиняють за допомогою додавання 150 мМ фосфорної кислоти. Вимірювання включеного фосфату в субстраті полі-GT виконують за допомогою завантаження зразків на фільтрувальний планшет (із застосуванням збирача, Perkin Elmer) і наступного промивання. Включений 33P у полі-GT вимірюють на сцинтиляційному лічильнику Topcount після додавання сцинтиляційної рідини у фільтрувальні планшети (Perkin Elmer). 2.3.1.2. Аналіз визначення Kd для TYK2 TYK2 (Carna Biosciences, 08-147) використовують у кінцевій концентрації 50 нМ. Експеримент зі зв'язування здійснюють у 50 мМ Hepes рН 7,5, 0,01 % Brij-35, 10 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA із застосуванням 15 нМ Kinase Tracer 236 (Invitrogen, PV5592) і 10 нМ Europium-anti-GST (Invitrogen, PV5594) з різними концентраціями сполук. Виявлення Tracer здійснюють відповідно до процедури виробника. Приклад 3. Клітинні аналізи 3.1. Аналіз передачі сигналу JAK-STAT Клітини HeLa утримували в модифікованому за способом Дульбеко середовищі Ігла (DMEM), що містить 10 % інактивованої теплом ембріональної телячої сироватки, 100 Од/мл пеніциліну і 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини HeLa використовували при конфлуентності 70 % для трансфекції. 20000 клітин у 87 мкл клітинного культурального середовища тимчасово трансфікували із застосуванням 40 нг репортера pSTAT1(2)-люциферази (Panomics), 8 нг репортера LacZ як репортера внутрішнього контролю і 52 нг pBSK із застосуванням 0,32 мкл 25 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Jet-PEI (Polyplus) як трансфекційного реактиву на ямку у форматі 96-ямкового планшета. Після інкубації протягом ночі при 37 °C, 5 % > CO2, видаляли трансфекційне середовище. Додавали 81 мкл DMEM+1,5 % інактивованої теплом ембріональної телячої сироватки. Додавали 9 мкл сполуки в 10Ч концентрації протягом 60 хв і потім 10 мкл OSM людини (Peprotech) у кінцевій концентрації 33 нг/мл. Сполуку тестували двічі, починаючи з 20 мкМ, після чого слідувало 1/3 серійне розведення, всього 8 доз (20 мкМ - 6,6 мкМ - 2,2 мкМ - 740 нМ - 250 нМ - 82 нМ - 27 нМ - 9 нМ) у кінцевій концентрації 0,2 % DMSO. Після інкубації протягом ночі при 37 °C, 5 % CO2 клітини лізували за допомогою додавання 100 мкл лізуючого буфера/ямка (PBS, 0,9 мМ CaCl2, 0,5 мМ MgCl2, 10 % трегалоза, 0,05 % Tergitol NP9, 0,3 % BSA). 40 мкл клітинного лізату використовували для зчитування β-галактозидазної активності за допомогою додавання 180 мкл розчину β-Gal (30 мкл ONPG 4 мг/мл + 150 мкл буфера βгалактозидази (0,06 M Na2HPO4, 0,04 M Na2PO4, 1 мМ MgCl2) протягом 20 хв. Реакцію зупиняли за допомогою додавання 50 мкл Na2CO3 1 M. Поглинання зчитували на 405 нм. Люциферазну активність вимірювали із застосуванням 40 мкл клітинного лізату плюс 40 мкл Steadylite®, як описано виробником (Perkin Elmer), нВ EnVision (Perkin Elmer). Виключення OSM використовували як позитивний контроль (100 % інгібування). Як негативний контроль 0,5 % використовували DMSO (0 % інгібування). Позитивні і негативні контролі використовували для того, щоб обчислювати значення z' і "відсоток інгібування" (PIN). Процентна частка інгібування = ((флуоресценція, обумовлена в присутності наповнювача, флуоресценція, обумовлена для зразка в присутності тестованої сполуки), поділена на (флуоресценція, обумовлена в присутності наповнювача, - флуоресценція, обумовлена для зразка без тригера))  100. Будували графіки значень PIN для сполук, що тестували на дозозалежний ефект, і одержували значення EC50. Активність сполуки формули I відносно JAK-STAT визначали відповідно до аналізу, описаного вище, таким чином, одержуючи значення IC50 для не активного, >6670, >6670, 8943 (середнє >7427 нМ). 3.2. Аналіз передачі сигналу OSM/IL-1β Показано, що OSM і IL-1β синергічно здійснюють підвищувальну регуляцію MMP13 у клітинній лінії хондросаркоми людини SW1353. Клітини висівають у 96-ямкові планшети по 15000 клітин/ямка в об'ємі 120 мкл DMEM (Invitrogen), що містить 10 % (об./об.) FBS і 1 % пеніциліну/стрептоміцину (InVitrogen), інкубовані при 37 °C 5 % CO2. Клітини попередньо інкубують з 15 мкл сполуки в середовищі M199 з 2 % DMSO 1 год перед запуском із застосуванням 15 мкл OSM і IL-1β, щоб досягати 25 нг/мл OSM і 1 нг/мл IL-1β, і вимірюють рівні MMP13 у кондиціонованому середовищі через 48 год після запуску. Активність MMP13 вимірюють із застосуванням аналізу активність захоплення антитіл. З цією метою 384-ямкові планшети (NUNC, 460518, MaxiSorb чорні) покривають 35 мкл розчину антитіла проти MMP13 людини 1,5 мкг/мл (R&D Systems, MAB511) протягом 24 год при 4 °C. Після промивання клітин 2 рази в PBS+0,05 %) Tween, сайти зв'язування, які залишилися, блокують із застосуванням 100 мкл 5 % знежиреного сухого молока (Santa Cruz, sc-2325, Blotto) у PBS протягом 24 год при 4 °C. Потім ямки промивають два рази в PBS+0,05 % Tween і 35 мкл 1/10 розведення культурального супернатанта, що містить MMP13 у 100-кратно розведеному блокуючому буфері, додають і інкубують протягом 4 год при кімнатній температурі. Потім ямки промивають два рази в PBS + 0,05 % Tween, після чого випливає активація MMP13 за допомогою додавання 35 мкл 1,5 мМ розчину ацетату 4-амінофенілртуті (APMA) (Sigma, A9563) і інкубація при 37 °C протягом 1 год. Ямки знову промивають у PBS + 0,05 % Tween і 35 мкл додають субстрату MMP13 (Biomol, P-126, флуорогенний субстрат OmniMMP). Після інкубації протягом 24 год при 37 °C флуоресценцію перетвореного субстрату вимірюють у Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 Multilabel Reader (довжина хвилі збудження: 320 нм, довжина хвилі випромінювання: 405 нм). Процентна частка інгібування = ((флуоресценція, обумовлена в присутності наповнювача, флуоресценція, обумовлена для зразка в присутності тестованої сполуки), поділена на (флуоресценцію, обумовлену в присутності наповнювача, - флуоресценція, обумовлена для зразка без тригера))  100. 3.3. Аналіз проліферації PBL Лімфоцити периферичної крові людини (PBL) стимулюють із застосуванням IL-2 і вимірюють проліферацію із застосуванням аналізу вбудовування BrdU. PBL спочатку стимулюють протягом 72 год з PHA, щоб індукувати рецептор IL-2, потім їх позбавляють поживних речовин протягом 24 год для того, щоб зупиняти клітинну проліферацію, за чим слідує стимуляція IL-2 протягом 26 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інших 72 год (включаючи мічення BrdU протягом 24 годин). Клітини попередньо інкубують з тестованими сполуками 1 год перед додаванням IL-2. Клітини культивують у RPMI 1640, що містить 10 % (об./об.) FBS. 3.4. Аналіз цільної крові людини (hWBA) 3.4.1. Протоколу 1 3.4.1.1. Протокол стимуляції IL-6 Аналіз проточної цитометрії здійснювали для того, щоб установлювати вибірковість сполуки до JAK1 відносно JAK2 ex vivo із застосуванням цільної крові людини. Отже, кров беруть у людей-добровольців, що давали інформовану згоду. Потім кров врівноважують протягом 30 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні, потім ділять на аліквоти в пробірки Eppendorf. Сполуку додають у різних концентраціях і інкубують при 37 °C протягом 30 хв при м'якому погойдуванні і потім стимулюють протягом 20 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні із застосуванням інтерлейкіну 6 (IL-6) для стимуляції JAK1-залежного шляху або GM-CSF для стимуляції JAK2залежного шляху. Потім фосфо-STAT1 і фосфо-STAT5 оцінюють із застосуванням FACS аналізу. 3.4.1.1.1. Аналіз фосфо-STAT1 3.4.1.1.1.1. Одержання реактивів 5 буфер Lyse/Fix (BD PhosFlow, номер за каталогом 558049) розводили 5-кратно дистильованою водою і попередньо нагрівали при 37 °C. Розведений буфер Lyse/Fix, який залишився, викидали. 10 мкг rhIL-6 (R&D Systems, номер за каталогом 206-IL) розчиняли в 1 мл PBS 0,1 % BSA, щоб одержувати основний розчин 10 мкг/мл. Основний розчин розділяли на аліквоти і зберігали при -80 °C. 3-кратне послідовне розведення сполуки одержували в DMSO (10 мМ основний розчин). Оброблені контролем зразки одержували DMSO замість сполуки. Усі зразки інкубували з кінцевою концентрацією DMSO 1 %. 3.4.1.1.1.2. Інкубація крові зі сполукою і стимуляція IL-6 Кров людини збирали в гепаринізовані пробірки. Кров ділили на аліквоти 148,5 мкл. Потім 1,5 мкл розведення тестованої сполуки додають у кожну аліквоту крові і зразки крові інкубують протягом 30 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні. Півтора мікролітра 10-кратно розведеного основного розчину IL-6 додають у зразки крові (кінцева концентрація - 10 нг/мл) і зразки інкубують при 37 °C протягом 20 хв при м'якому погойдуванні. 3.4.1.1.1.3. Одержання білих клітин крові Наприкінці періоду стимуляції 3 мл 1 попередньо нагрітого буфера Lyse/Fix негайно додають у зразки крові, швидко перемішують на вортексі і інкубують протягом 15 хв при 37 °C на водній бані для того, щоб лізувати червоні клітини крові і фіксувати лейкоцити. Пробірки центрифугують протягом 5 хв на 400g при 4 °C. Клітинний осад промивають у 3 мл холодного 1PBS, і після центрифугування клітинний осад ресуспендують у 100 мкл крижаного 1PBS і додають 900 мкл крижаного 100 % метанолу. Потім клітини інкубують при 4 °C протягом 30 хв для пермеабілізації. Перемеабілізовані клітини після цього промивають у 1PBS, що містить 3 % BSA і нарешті ресуспендують у 80 мкл 1PBX, що містить 3 % BSA. 3.4.1.1.1.4. Мічення клітин антитілами проти фосфо-STAT1 і проти CD4 20 мкл антитіла миші PE проти STAT1 (pY701) або ізотипічного контрольного антитіла миші PE IgG2aK (BD Biosciences, номер за каталогом 612564 і 559319, відповідно) і FITCкон'югованого антитіла проти CD4 або контрольного FITC-кон'югованого ізотипічного антитіла додавали і змішували, потім інкубували протягом 30 хв при 4 °C у темряві. Потім клітини промивали один раз у 1PBS і аналізували на проточному цитометрі FACSCanto II (BD Biosciences). 3.4.1.1.1.5. Аналіз флуоресценції на FACSCanto II Підраховували всього 50000 подій і позитивні за фосфо-STAT1 клітини вимірюють після визначення дискримінаційного вікна на CD4+ клітинах, у лімфоцитарному дискримінаційному вікні. Дані аналізують із застосуванням програмного забезпечення FACSDiva і обчислюють процентну частку інгібування стимуляції IL-6 за процентною часткою позитивних клітин за фосфо-STAT1 на CD4+ клітинах. 3.4.1.1.2. Аналіз фосфо-STAT5 3.4.1.1.2.1. Одержання реактивів 5 буфер Lyse/Fix (BD PhosFlow, номер за каталогом 558049) розводили 5-кратно дистильованою водою і попередньо нагрівали при 37 °C. Розведений буфер Lyse/Fix, що залишився, викидали. 27 UA 112804 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 10 мкг rhGM-CSF (AbCys S.A., номер за каталогом P300-03) розчиняли в 100 мкл PBS 0,1 % BSA, щоб одержувати основний розчин 100 мкг/мл. Основний розчин зберігали в аліквотах при 80 °C. Одержували 3-кратне серійне розведення сполуки в DMSO (10 мМ основний розчин). Оброблені контролем зразки одержували DMSO без тестованої сполуки. Усі зразки інкубували з кінцевою концентрацією DMSO 1 %. 3.4.1.1.2.2. Інкубація крові зі сполукою і стимуляція із застосуванням GM-CSF Кров людини збирали в гепаринізовані пробірки. Кров ділили на аліквоти 148,5 мкл. Потім 1,5 мкл розведення сполуки додавали в кожну аліквоту і зразки крові інкубували протягом 30 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні. 5000-кратне розведення основного розчину GM-CSF (1,5 мкл) додавали в зразки крові (кінцева концентрація - 20 пг/мл) і зразки інкубували при 37 °C протягом 20 хв при м'якому погойдуванні. 3.4.1.1.2.3. Одержання білих клітин крові Наприкінці періоду стимуляції 3 мл 1 попередньо нагріті буфери Lyse/Fix негайно додавали в зразки крові, швидко перемішували на вортексі і інкубували протягом 15 хв при 37 °C на водній бані для того, щоб лізувати червоні клітини крові і фіксувати лейкоцити. Пробірки центрифугували протягом 5 хв на 400g при 4 °C. Клітинний осад промивали в 3 мл холодного 1PBS і після центрифугування клітинний осад ресуспендували в 100 мкл крижаного 1PBS і додавали 900 мкл крижаного 100 % метанолу. Потім клітини інкубували при 4 °C протягом 30 хв для пермеабілізації. 3.4.1.1.2.4. Мічення клітин антитілами проти фосфо-STAT5 і проти CD33 Додавали 20 мкл антитіла миші PE проти STAT5 (pY694) або ізотопічного контрольного антитіла миші PE IgGlK (BD Biosciences, номер за каталогом 612567 і 554680, відповідно) і антитіла миші APC проти CD33 (BD Biosciences #345800) або контрольного ізотопічного антитіла миші APC IgG1 (BD Biosciences #345818), перемішували, потім інкубували протягом 30 хв при 4 °C, у темряві. Потім клітини промивали один раз у 1PBS і аналізували на проточному цитометрі FACSCanto II (BD Biosciences). 3.4.1.1.2.5. Аналіз флуоресценції на FACSCanto II Підраховували всього 50000 подій і позитивні за фосфо-STAT5 клітини вимірювали після визначення дискримінаційного вікна на CD33+ клітинах. Дані аналізували із застосуванням програмного забезпечення FACSDiva і обчислювали відповідність процентній частці інгібування GM-CSF стимуляції за процентною часткою позитивних за фосфо-STAT5 клітин на CD33+ клітинах. 3.4.2. Протокол 2 3.4.2.1. Протокол стимуляції Аналіз проточної цитометрії здійснювали для того, щоб встановлювати вибірковість сполуки до JAK1 відносно JAK2 ex vivo із застосуванням цільної крові людини. Отже, кров беруть у людей-добровольців, що давали інформовану згоду. Потім кров врівноважують протягом 30 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні, потім ділять на аліквоти в пробірки Eppendorf. Сполуку додають у різних концентраціях й інкубують при 37 °C протягом 30 хв при м'якому погойдуванні і згодом стимулюють протягом 20 хв при 37 °C при м'якому погойдуванні інтерлейкіном 6 (IL-6) для стимуляції JAK1-залежного шляху, інтерфероном-α (IFN α) для стимуляції шляху JAK1/TYK2, інтерлейкіном 2 (IL-2) для стимуляції шляху JAK1/JAK3 або GM-CSF для стимуляції JAK2-залежного шляху. Потім оцінюють рівні фосфо-STAT1 (для IL-6- і IFNα-стимульованих клітин) і фосфо-STAT5 (для IL-2- і GM-CSF-стимульованих клітин) із застосуванням FACS аналізу. 3.4.2.2. Аналіз фосфо-STAT 3.4.2.2.1. Одержання реактивів 5 буфер Lyse/Fix (BD PhosFlow, номер за каталогом 558049) розводили 5-кратні дистильованою водою і попередньо нагрівали при 37 °C. Розведений буфер Lyse/Fix, що залишився, викидали. 10 мкг rhIL-6 (R&D Systems, номер за каталогом 206-IL) розчиняли в 1 мл PBS+0,1 % BSA, щоб одержувати основний розчин 10 мкг/мл. Основний розчин розділяли на аліквоти і зберігали при -80 °C. 10 мкг rhIL-2 (R&D Systems, номер за каталогом 202-IL) розчиняли в 1 мл PBS+0,1 % BSA, щоб одержувати основний розчин 10 мкг/мл. Основний розчин розділяли на аліквоти і зберігали при -80 °C. 28