Повністю людське моноклональне антитіло проти vap-1

1. Антитіло проти VAP-1 або його фрагмент, що зв'язується з VAP-1, яке відрізняється тим, що є повністю людським і містить три CDR поліпептиду важкого ланцюга, представлені в SEQ ID NOs: 1, 2 і 3, відповідно, й три CDR поліпептиду легкого ланцюга, представлені в SEQ ID NOs: 24, 25 і 26, відповідно. 2 (19) 1 3 ласть легкого ланцюга, представлену в SEQ ID NO: 46. 4. Антитіло або фрагмент антитіла за п. 1 чи 2, що містить поліпептид важкого ланцюга, представлений в SEQ ID NO: 47, і поліпептид легкого ланцюга, представлений в SEQ ID NO: 48. 5. Антитіло за кожним із пп. 1-4, де зазначений фрагмент антитіла являє собою Fab, Fab', F(ab')2, Fv або одноланцюжковий Fv. 6. Антитіло за кожним із пп. 1-5, де зазначене антитіло являє собою рекомбінантне антитіло. 7. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що кодує повністю людське антитіло проти VAP-1 або його фрагмент, що зв'язується з VAP-1, яка містить: і) нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NOs: 49, 54, 59, 69, 74 і 79; іі) нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NOs: 50, 55, 60, 70, 75 і 80; ііі) нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NOs: 51, 56, 61, 71, 76 і 81; іv) нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NOs: 52, 57, 62, 72, 77 і 82; v) нуклеотидні послідовності, представлені в SEQ ID NOs: 53, 58, 63, 73, 78 і 83. 8. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що складається з SEQ ID NOs: з 64 по 68. 9. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 89. 10. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з SEQ ID NOs: з 84 по 88. 11. Молекула нуклеїнової кислоти за п. 7, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в SEQ ID NO: 90. 12. Вектор експресії, що містить послідовність нуклеїнової кислоти за кожним із пп. з 7 по 11. 13. Клітина-хазяїн або організм, що містять вектор експресії за п. 12. 14. Спосіб одержання повністю людського антитіла проти VAP-1, який включає стадії: a) трансформації придатного хазяїна щонайменше одним вектором експресії за п. 12; b) культивування зазначеного хазяїна в умовах, що сприяють експресії; і c) очищення зібраних повністю людських антитіл із культурального середовища. 15. Повністю людське антитіло проти VAP1 за п. 1 для використання як медикаменту. 16. Повністю людське антитіло проти VAP1 за п. 1 для використання як засобу діагностики. 17. Використання повністю людського антитіла проти VAP-1 за п. 1 для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування запального захворювання, опосередковуваного VAP-1. 18. Використання повністю людського антитіла проти VAP-1 за п. 1 для виготовлення фармацевтичної композиції для діагностування запального захворювання, опосередковуваного VAP-1. 97516 4 19. Фармацевтична композиція, що містить повністю людське антитіло проти VAP-1 за будь-яким із пп. з 1 по 6. 20. Фармацевтична композиція за п. 19 для лікування запального захворювання, опосередковуваного VAP-1. 21. Фармацевтична композиція за п. 19 для діагностики запального захворювання, опосередковуваного VAP-1. 22. Фармацевтична композиція за п. 20 чи 21, де зазначене запальне захворювання вибране із групи, що складається з артритів і захворювань сполучної тканини, запальних захворювань кишечнику, дерматозів, розсіяного склерозу, запальної нейропатії, запальної міопатії, гострого розсіяного енцефаломієліту, васкуліту центральної нервової системи, синдрому Шегрена, діабетів, системного червоного вовчака, астми, запального захворювання печінки, хвороби Грейвса й тиреоїдиту. 23. Фармацевтична композиція за п. 22, де зазначені артрити й захворювання сполучної тканини вибрані із групи, що складається з реактивних артропатій, постінфекційних артропатій, запальних поліартропатій, системних порушень сполучної тканини, запальних спондилопатій, міозиту, синовіту, хвороби Рейтера, серопозитивного ревматоїдного артриту, іншого ревматоїдного артриту, позасуглобового ревматоїдного захворювання, псоріазної й ентеропатичної артропатій, юнацького артриту, артриту з невстановленою причиною, нодозного поліартеріїту й близьких станів, інших некротизуючих васкулопатій, дерматополіміозиту, системного склерозу, інших захворювань із системним залученням сполучної тканини, анкілозуючого спондилоартриту й інших запальних спондилопатій. 24. Фармацевтична композиція за п. 22, де зазначене запальне захворювання кишечнику вибране із групи, що складається із хвороби Крона й виразкового коліту. 25. Фармацевтична композиція за п. 22, де зазначені дерматози вибрані із групи, що складається з бульозних порушень, дерматиту, папулосквамозних порушень, еритеми, склеротичного атрофічного ліхену, краурозу вульви, дискоїдного червоного вовчака, кільцеподібної склеродермії, пухирчатки, пемфігоїду, герпетиформного дерматиту, атопічного дерматиту, алергійного контактного дерматиту, подразнюючого контактного дерматиту, контактного дерматиту з невстановленою причиною, псоріазу, поліморфної еритеми. 26. Фармацевтична композиція за п. 21, де зазначене запальне захворювання вибране із групи, що складається з атеросклерозу, запалення ока, включаючи увеїт, ірит, іридоцикліт, алкогольного гепатиту, алотрансплантації, ксенотрансплантації, гломерулонефриту, ушкодження при реперфузії й гострих запальних станів після інфаркту міокарда й інсульту . 5 Даний винахід стосується послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують повністю людські моноклональні антитіла, які розпізнають білок адгезії ендотеліальних клітин, VAP-1, і, зокрема, повністю людського моноклонального антитіла, позначеного ВТТ-1023, яке розпізнає функціональний епітоп VAP-1. Публікації й інший матеріал, використовуваний у даному описі для ілюстрації відомого рівня техніки й, зокрема, фактів, що надають додаткові подробиці відносно практичного використання, включені в дану заявку як посилання. Звичайно повнорозмірні антитіла мають загальну Y-образну структуру, що складається з двох ідентичних легких ланцюгів і двох ідентичних важких ланцюгів. Ці чотири поліпептидні субодиниці складені так, що два важкі ланцюги зв'язані, а легкий ланцюг приєднаний до кожного важкого ланцюга за допомогою дисульфідних зв'язків. Кожний поліпептид, що складає антитіло, складається з варіабельної й константної області. Варіабельна область локалізована в плечах Yобразного антитіла й визначає антигензв'язувальну специфічність антитіла. Ця область містить короткі послідовності амінокислот, які відповідають за зв'язування антитіла з антигеном. Ці області називають областями, що визначають комплементарність (CDR). Інші ділянки варіабельних областей важливі для конформації антигензв'язувального кармана в цілому. Константна область антитіла локалізована в основі важких ланцюгів і визначає здатність антитіла активувати імунні реакції шляхом взаємодій зі специфічними рецепторами. Ці області, звичайно, високо консервативні і їхня варіабельність обмежена п'ятьома основними ізоформами, IgA, IgD, IgE, IgG і ІgМ. Білок-1 адгезії судин (VAP-1) являє собою некласичну молекулу адгезії, що індукується запаленням і експресується на зндотеліальних клітинах судин, де вона опосередковує перекочування лейкоцитів при фізіологічному зрушенні. У цій ролі він вносить вклад у рециркуляцію лімфоцитів через венули з високим ендотелієм (HEV) вторинної лімфоїдної тканини як частина нормального процесу імунологічного нагляду. Однак в умовах запалення VAP-1 сприяє інфільтрації лейкоцитів у збуджену тканину, тим самим сприяючи й підтримуючи запальну відповідь. Ця інфільтрація сама може бути пошкоджувальним фактором при хронічних запальних захворюваннях, таких як ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечника, псоріаз і багато автоімунних і інших запальних захворювань. В інших випадках масивна інфільтрація прозапальних клітин у тканину після важкого тканинного ушкодження в результаті інфаркту міокарда, інсульту й інших захворювань вносить вклад у деструкцію тканини, спостережувану при цих гострих запальних відповідях. Зниження інфільтрації клітин у місця запалення шляхом запобігання функціонування VAP-1 за допомогою блокувальних антитіл, імовірно, дозволить запаленню розв'язатися й приведе 97516 6 до поліпшення клінічних симптомів цих захворювань. У патенті США 5580780 описано моноклональне антитіло (mAb) 1B2, яке розпізнає VAP-1 і яке може блокувати зв'язування лімфоцитів з HEV мигдалин у тесті на заморожених зрізах. MAb 1B2 являє собою антитіло IgM миші й специфічно для VAP-1. Застосування мишачих mAb у якості терапевтичних засобів має обмежений потенціал, тому що імунна система людини розпізнає мишачі антитіла як чужорідну речовину й продукує антимишачі антитіла (НАМА) для видалення їх із організму. Ця імунна реакція є основним обмеженням використання мишачих антитіл при довгостроковій терапії, коли необхідно повторне введення. Використання мишачих антитіл проти VAP-1 у клінічній практиці має бути обмежено хворими, які одержують лікування імуносупресорами, і, отже, менш схильними до реакцій на НАМА, коли припустиме тільки одне введення антитіл, такими як при ушкодженні при ішемії-реперфузії при гострому інфаркті або гострому респіраторному дистрес-синдромі. Ще одним недоліком використання для лікування антитілами IgM миші проти VAP-1 є несприятливий кінетичний профіль таких антитіл, тобто короткий період напівжиття, який робить їх непридатними для використання при хронічних порушеннях, таких як ревматоїдний артрит, запальне захворювання кишечника, псоріаз і багато інших захворювань. У даній області відомо кілька методів створення менш імуногенних моноклональних антитіл. Кращі підходи включають "гуманізацію" антитіл. Часто використовуваними стратегіями є створення химерних mAb, гуманізованих mAb або повністю людських mAb. Химерні антитіла являють собою антитіла, у яких варіабельна область є мишачою, а константна область є людською. У химерних антитілах приблизно 70 % молекули антитіла гризуна, звичайно, заміщено відповідними послідовностями людини, але при цьому зберігаються антиген-зв'язувальні сайти гризуна з їхньою конкретною специфічністю й спорідненістю. Гуманізовані антитіла являють собою антитіла, у яких варіабельна область може бути мишачою, але які піддані мутації так, що більш схожі на антитіло людини й можуть містити людську константну область. Повністю людські антитіла являють собою антитіла, у яких як варіабельна область, так і константна область є людськими. У міжнародній патентній публікації WO03/093319 розкрите химерне моноклональне антитіло ВТТ-1002 проти VAP-1, яке відрізняється тим, що здатне викликати знижену імунну відповідь у порівнянні з відповідними антитілами миші. Однак, будучи химерним антитілом, ВТТ-1002 має білкові послідовності, відповідні варіабельні області антитіла, які безпосередньо й без модифікації є мишачими. Це антитіло зберігає можливість розпізнаватися як чужорідне й бути імуногенним при введенні людині. Його фармакологічні властивості, такі як його півперіод виведення, і функціональні властивості також можуть бути не задовільними 7 через його імуногенність й, отже, продукування антитіл проти нього. Таким чином, у даній області існує потреба в повністю людському антитілі проти VAP-1 зі зниженою імуногенністю й поліпшеними фармакологічними властивостями. Даний винахід у широкому сенсі стосується нових повністю людських антитіл проти VAP-1, способів одержання таких антитіл і застосування антитіл. Даний винахід також стосується полінуклеотидів, що кодують зазначені антитіла проти VAP-1. Даний винахід стосується повністю людського моноклонального антитіла, яке можна використовувати в діагностиці й/або терапії in vivo, у якого знижений потенціал вироблення імунної відповіді у хворих, і яке має ефективні фармакологічні характеристики для терапевтичних цілей. Також даний винахід стосується важкого й легкого ланцюга повністю людських антитіл проти VAP-1 або їхніх фрагментів. Крім того, даний винахід стосується нуклеїнових кислот, що кодують повністю людські антитіла проти VAP-1, або їхніх фрагментів, а також векторів експресії й клітин-хазяїв, що включають ці нуклеїнові кислоти для рекомбінантної експресії антитіл проти VAP-1. В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способів одержання повністю людських антитіл проти VAP-1 за даним винаходом рекомбінантними 5 методами одержання. Описані також фармацевтичні композиції, що містять зазначені антитіла, і їхнє терапевтичне застосування. Нижче винахід описаний більш докладно за допомогою кращих варіантів 10 здійснення з посиланням на додані фігури, у яких На фігурах з 1 по 5 представлені нуклеотидні послідовності й відповідні амінокислотні послідовності варіабельних областей антитіл проти VAP-1 8С10 (фігура 1А-В), 8А4 (фігура 2А-В), 3F10 (Г(фігура 3А-В), 5F12 (фігура 4А-В) і 4В3 (фігура 5А-В). Амінокислотні послідовності варіабельних областей легкого ланцюга (VL) (А) і варіабельних областей важкого ланцюга (VH) (В) були виведені із клонованих кДНК. Три CDR у кожному амінокислотному ланцюзі представлені жирним шрифтом з підкресленням відповідних нуклеотидних послідовностей. На фігурі 6 представлене вирівнювання варіабельних областей білкової послідовності 8С10, 8А4, 3F10, 5F12 і 4ВЗ важкого ланцюга VH, що показує консенсусну послідовність (Фіг. 6А). Вирівнювання CDR з 1 по 3 важкого ланцюга VH з консенсусною послідовністю представлене на фіг. 6В, фіг. 6С і фіг. 6D. На фігурі 6Е представлене вирівнювання варіабельних областей білкової послідовності 8С10, 8А4, 3F10, 5F12 і 4ВЗ легкого ланцюга VL, що показує консенсусну послідовність. Вирівнювання CDR з 1 по 3 легкого ланцюга VL з консенсусною послідовністю представлене на фіг. 6F, фіг. 6G і фіг. 6Н. На фігурі 7 проілюстроване зв'язування VAP-1 рекомбінантньїм повністю людським антитілом r8С10 (ВТТ-1023) на клітинах Ах, що експресують 97516 8 VAP-1 людини на поверхні клітини, продемонстроване за допомогою FACS аналізу (сортування клітин за допомогою активації флуоресценції) пофарбованих на ВТТ-1023 клітин Ах, що експресують VAP-1, у порівнянні з контрольними пофарбованими клітинами. Фігура 8 ілюструє вплив ВТТ-1023 на трансміграцію лейкоцитів in vitro. Представлена кількість мононуклеарних клітин периферичної крові (РВМС), які трансмігрували через моношари ендотеліальних клітин, оброблених ВТТ-1023 або контрольними антитілами. Величини помилки представлені як стандартна помилка середнього, N=6. Даний винахід стосується повністю людських, переважно, отриманих рекомбінантними способами, моноклональних антитіл (mAb), що специфічно розпізнають білок-1 адгезії судин, VAP-1, людини. Повністю людські моноклональні антитіла за даним винаходом мають знижену імуногенність у порівнянні з відповідними гуманізованими антитілами й, отже, є ефективними для лікування ряду аутоімунних захворювань, запальних станів і захворювань сполучної тканини, шкіри й шлунковокишкового тракту, центральної нервової системи й легеневих систем, включаючи такі стани, як хронічний артрит, запальні захворювання кишечника й хронічні дерматити. Повністю людські антитіла проти VAP-1, крім того, ефективні для використання в діагностиці in vitro й in vivo, включаючи імуносцинтіографічну візуалізацію ділянок запалення in vivo. Використовуваний у даному описі термін "варіант консервативної послідовності" включає модифікації нуклеотидної і амінокислотної послідовностей, які суттєво не змінюють зв'язувальних властивостей повністю людських антитіл проти VAP-1 за даним винаходом. Варіанти консервативної нуклеотидної послідовності включають варіанти, що виникають через виродженості генетичного коду й через "мовчазні" мутації. Винахід також охоплює нуклеотидні заміни, делеції й добавки. Варіанти консервативної амінокислотної послідовності включають варіанти, що виникають через амінокислотні заміни подібними амінокислотами, добре відомими в даній області. Також винахід включає делеції й добавки амінокислот. Поліпептиди й полінуклеотиди за даним винаходом включають поліпептиди й полінуклеотиди, які щонайменше на 80 % або щонайменше на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % ідентичні повністю людським антитілам проти VAP-1 або полінуклеотидам, що кодують зазначені антитіла й описані нижче. Даний винахід стосується важкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP-1, що включає щонайменше одну консенсусну послідовність CDR, обрану із групи, що складається з: а) послідовності X1X2X3X4X5 (SEQ ID N0:1), де X1 являє собою невелику полярну або основну амінокислоту, таку як S, N або R, Х2 являє собою ароматичну або невелику полярну амінокислоту, таку як Y або S, X3 являє собою невелику гідрофобну або ароматичну амінокислоту, таку як A, G або W, 9 Х4 являє собою гідрофобну амінокислоту, таку як М або І, і Х5 являє собою невелику полярну або основну амінокислоту, таку як Н або S; b) послідовності X1X2X3X4X5X6X7X7X8X9X10X11X12 (SEQ ID NO:2), де Х1 являє собою невелику амінокислоту, таку як V, А або N, Х2 являє собою невелику аліфатичну амінокислоту, таку як І або L, Х3 являє собою ароматичну, основну або гідрофобну амінокислоту, таку як W, G або К, Х4 являє собою ароматичну або аліфатичну гідрофобну, або полярну амінокислоту, таку як F, Q, V або Y, Х5 являє собою невелику кислу або невелику амінокислоту, таку як D або G, Х6 являє собою невелику або аліфатичну амінокислоту, таку як S, G або І, Х7 являє собою полярну амінокислоту, таку як N, Е або Y, або амінокислота відсутня, Х8 являє собою полярну амінокислоту, таку як Е, К або Т, Х9 являє собою полярну амінокислоту, таку як Y, D або N, Х10 являє собою ароматичну амінокислоту, таку як Y або Н, Х11 являє собою невелику гідрофобну амінокислоту, таку як V або А, і Х12 являє собою заряджену основну амінокислоту, таку як К або R; і с) послідовності X1X2X3X4X5X6X7X7X8X9X10X11X12D Y (SEQ ID N0:3), де Х1 являє собою заряджену кислу амінокислоту, таку як D або Е, Х2 являє собою невелику або гідрофобну амінокислоту, таку як A, G, К, Р або Y, Х3 являє собою ароматичну або невелику амінокислоту, таку як W, F, G або N, Х4 являє собою ароматичну або невелику амінокислоту, таку як F або G, або амінокислота відсутня, Х5 являє собою невелику амінокислоту, таку як G або S, або амінокислота відсутня, Х6 являє собою невелику амінокислоту, таку як G, або амінокислота відсутня, Х7 являє собою невелику полярну амінокислоту, таку як Т, або амінокислота відсутня, Х8 являє собою полярну ароматичну амінокислоту, таку як Y, або амінокислота відсутня, Х9 являє собою заряджену кислу або ароматичну амінокислоту, таку як Е або F, або амінокислота відсутня, X10 являє собою ароматичну або невелику амінокислоту, таку як F, G, S, V або W, Х11 являє собою невелику або полярну ароматичну амінокислоту, таку як Y або G, і Х12 являє собою ароматичну або аліфатичну гідрофобну амінокислоту, таку як F або І. Більш конкретно, даний винахід стосується важкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP-1, що включає амінокислотну послідовність першої CDR, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 4 по 8, і консервативних варіантів 97516 10 їхніх послідовностей, і/або амінокислотну послідовність другої CDR, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 9 по 13 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або амінокислотну послідовність третьої CDR, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: з 14 по 18 і консервативних варіантів їхніх послідовностей. Конкретні важкі ланцюги антитіла за даним винаходом включають варіабельну область, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 19 по 23, і консервативних варіантів їхніх послідовностей. Даний винахід додатково стосується легкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP1, що включає щонайменше консенсусну послідовність однієї CDR, обрану із групи, що складається з: a) послідовності RASQX1X2X3X4X5LA (SEQ ID N0:24), де Х1 являє собою невелику амінокислоту, таку як G або S, Х2 являє собою аліфатичну амінокислоту, таку як І або V, Х3 являє собою невелику полярну або позитивно заряджену амінокислоту, таку як S або R, Х4 являє собою невелику полярну амінокислоту, таку як S, або амінокислота відсутня, і Х5 являє собою невелику гідрофобну або ароматичну гідрофобну амінокислоту, таку як A, F, W або Y; b) послідовності X1X2X3X4X5 (SEQ ID N0:25), де Х1 являє собою невелику кислу або невелику амінокислоту, таку як D або G, Х2 являє собою невелику полярну амінокислоту, таку як S або N, Х3 являє собою аліфатичну або позитивно заряджену амінокислоту, таку як L або R, Х4 являє собою невелику або полярну амінокислоту, таку як А, Е або Q, і Х5 являє собою полярну або позитивно заряджену амінокислоту, таку як S, Т або R;i с) послідовності QQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID N0:26), де Х1 являє собою ароматичну або позитивно заряджену амінокислоту, таку як F, Y aбo R, Х2 являє собою невелику амінокислоту, таку як N, G або S, Х3 являє собою невелику полярну амінокислоту, таку як S або N, Х4 являє собою ароматичну або невелику полярну амінокислоту, таку як Y, F, W або S, і Х5 являє собою аліфатичну або позитивно заряджену амінокислоту, таку як L або R. Більш конкретно, даний винахід стосується легкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP-1, що включає амінокислотну послідовність першої CDR, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 27 по 31, і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або амінокислотну послідовність другої CDR, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 32 по 36 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або амінокислотну послідовність третьої CDR, обрану з групи, що складається з SEQ ID NO: з 37 по 41 і консервативних варіантів їхніх послідовностей. Конкретні важкі ланцюги антитіла за даним винаходом включають варіабе 11 льну область, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 42 по 46, і консервативних варіантів їхніх послідовностей. У додатковому аспекті даний винахід стосується повністю людського антитіла проти VAP-1, що включає важкі й легкі ланцюги за даним винаходом. Молекули антитіла й ланцюги за даним винаходом можуть включати повну природну молекулу антитіла, що має повнорозмірні важкі й легкі ланцюги; їхній фрагмент, такий як Fab, Fab', F(ab')2 або Fv фрагмент; мономер або димер легкого або важкого ланцюга; або одноланцюжкове антитіло, наприклад, один ланцюг Fv, у якому варіабельні області важкого й легкого ланцюгів з'єднані пептидним лінкером; або будь-який інший рекомбінантний продукт, або CDR трансплантована молекула. Подібно, варіабельна область важкого й легкого ланцюгів може придатним чином поєднуватися з іншими доменами антитіла. У даній області добре відомо, що домен CDR3 незалежно від домену (ів) CDR1 і/або CDR2 один може визначати специфічність зв'язування антитіла відносно свого антигену й що множинні антитіла з однаковою специфічністю зв'язування можуть бути прогнозовано створені на основі загальної послідовності CDR3. Відповідно, у даному описі розкриті моноклональні антитіла, що включають один або більш доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгів антитіла людини або тварини, що не є людиною, де моноклональне антитіло здатне специфічно зв'язувати VAP-1. У певних аспектах даний винахід стосується моноклональних антитіл, що включають один або декілька доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгівантитіла тварини, що не є людиною, наприклад, антитіла миші або 5 пацюка, де моноклональне антитіло здатне специфічно зв'язувати VAP-1. У деяких варіантах здійснення такі антитіла за винаходом, що включають один або більш доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгів антитіла тварини, що не є людиною, (а) здатні конкурувати за зв'язування з; (b) зберігають функціональні характеристики; (с) зв'язуються з тим самим епітопом; і/або (d) мають подібну зв'язувальну спорідненість, що й відповідне батьківське антитіло тварини, яка не є людиною. В інших аспектах даний винахід стосується моноклональних антитіл; що містять один або більш доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгів антитіла людини, такого як, наприклад, антитіло людини, отримане від тварини, що не є людиною, де антитіло людини здатне специфічно зв'язувати VAP-1. В інших аспектах даний винахід стосується моноклональних антитіл, що містять один або більш доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгів першого антитіла людини, такого як, наприклад, антитіло людини, отримане від тварини, що не є людиною, де перше антитіло людини здатне специфічно зв'язувати VAP-1 і де домен CDR3 першого антитіла людини заміняє домен CDR3 антитіла людини, яке не має специфічності зв'язування у відношенні VAP-1, з одержанням другого антитіла людини, яке здатне специфічно зв'язувати VAP-1. У деяких варіантах здійснення такі антитіла за 97516 12 винаходом, що включають один або більш доменів CDR3 важкого й/або легкого ланцюгів першого антитіла людини, (а) здатні конкурувати за зв'язування з; (b) зберігають функціональні характеристики; (с) зв'язуються з тим самим епітопом; і/або (d) мають подібну зв'язувальну спорідненість що й відповідне батьківське перше антитіло людини. Антитіла за даним винаходом можуть додатково характеризуватися різними фізичними властивостями антитіл проти VAP-1. Для визначення й/або диференціації різних класів антитіл на основі їхніх фізичних властивостей можуть бути використані різні тести. У деяких варіантах здійснення антитіла за даним винаходом можуть містити один або більш сайтів глікозування у варіабельній області як легкого, так і важкого ланцюга. Присутність одного або більш сайтів глікозування у варіабельній області може приводити до підвищеної імуногенності антитіла або зміни фармакокінетики антитіла, що обумовлено зміненим зв'язуванням антигену, як це добре відомо у даній області. Як відомо, глікозування виникає в мотивах, що містять послідовність N-X-S/T. Глікозування варіабельної області може бути протестоване з використанням тесту Glycoblot, при якому антитіло розщеплюється з одержанням Fab і потім тестується на глікозування з використанням тесту, який вимірює окиснення періодату й утворення основи Шиффа. Альтернативно, глікозування варіабельної області може бути протестоване з використанням хроматографії Dionex light (Dionex-lc), при якій сахариди Fab розщеплюються до моносахаридів, і аналізується індивідуальний вміст сахаридів. У деяких випадках переважно мати антитіло проти VAP-1, варіабельна область якого не глікозована. Це може бути досягнуто або за допомогою відбору антитіл, які не містять мотиву глікозування у варіабельній області, або за допомогою мутації залишків у мотиві глікозування з використанням стандартних способів, що добре відомі у даній області. У кращому варіанті здійснення антитіла за даним винаходом не містять сайтів ізомерії аспарагіну. Деамідування або ефект ізоаспарагінової кислоти може відбуватися на послідовностях N-G або D-G, відповідно. Утворення ізоаспарагінової кислоти можна вимірювати з використанням тесту рівних кількостей, при якому для тестування ізоаспарагінової кислоти використовується ВЕРХ зі зверненою фазою. Кожне антитіло повинно мати однозначну ізоелектричну точку (рl), але звичайно антитіла попадають у діапазон рН між 6 і 9,5. рl для антитіла lgG1 звичайно попадає в діапазон рН 7-9,5 і pl для антитіла lgG4 звичайно попадає в діапазон рН 6-8. Антитіла можуть мати рl, що перебуває поза цим діапазоном. Ізоелектрична точка може бути протестована з використанням тесту капілярного ізоелектричного фокусування, при якому створюється градієнт рН і може використовуватися лазерне фокусування для збільшення точності, як добре відомо в даній області. У деяких випадках переважно мати антитіло проти VAP-1, яке має величину pl, яка попадає в нормальний діапазон. Цього можна досягнути або за допомогою відбору антитіл з 13 pl у нормальному діапазоні, або за допомогою мутації заряджених поверхневих залишків із використанням стандартних способів, добре відомих у даній області. Кожне антитіло повинно мати температуру плавлення, яка є показником теплової стабільності. Більш висока теплова стабільність указує на більш високу стабільність антитіла in vivo у цілому. Точка плавлення антитіла може бути вимірювана з використанням таких способів, як диференціальна сканувальна калориметрія. ТМ1 указує температуру вихідного розгортання антитіла. ТМ2 указує температуру повного розгортання антитіла. Звичайно, переважно, щоб ТМ1 антитіла за даним винаходом становила вище 60 °C, переважно вище 65 °C, навіть більш переважно вище 70 °C. Альтернативно, теплова стабільність антитіла може бути виміряна з використанням кругового дихроїзму, як добре відомо в даній області. У кращому варіанті здійснення антитіла відбирають так, щоб вони швидко не руйнувалися. Фрагментація антитіла проти VAP-1 може бути виміряна з використанням капілярного електрофорезу (СЕ) і мас-спектрометрії з матрична активованою лазерною десорбцією/іонізацією (МАЛДІ-МС), що добре відомо з рівня техніки. У кращому варіанті здійснення антитіла вибирають так, що вони мають мінімальні агрегаціині ефекти. Агрегація може вести до запуску небажаної імунної відповіді й/або зміненим несприятливим фармакокінетичним властивостям. Звичайно прийнятні антитіла з агрегацією 25 % або менше, переважно 20 % або менше, навіть більш переважно 15 % або менше, навіть більш переважно 10 % або менше й навіть більш переважно 5 % або менше. Агрегація може бути виміряна за допомогою декількох методів, добре відомих у даній області, наприклад, витіснювальну за розміром колонкову (SEC) високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) і світлорозсіювання для ідентифікації мономерів, димерів, тримерів або мультимерів. Антитіла за даним винаходом, переважно, є антитілами IgG типу й, більш переважно, lgG4 типу. Винахід також охоплює інші ізотипи антитіл, такі як lgG1, lgG2, lgG3, IgM i IgE. У деяких варіантах здійснення антитіло за даним винаходом містить варіабельні області важкого й легкого ланцюгів, що містять амінокислотні послідовності, які гомологічні амінокислотним послідовностям описаних у даному документі кращих антитіл, і де антитіла зберігають бажані функціональні властивості антитіл проти VAP-1 за винаходом. Наприклад, винахід стосується виділеного моноклонального антитіла або його антигензв'язувальної частини, що включають варіабельну область важкого ланцюга й варіабельну область легкого ланцюга, де: (а) варіабельна область важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на.80 % гомологічна амінокислотній послідовності, яка обрана із групи, що складається з SEQ ID NO: з 19 по 23; (b) варіабельна область легкого ланцюга включає амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 80 % 97516 14 гомологічна амінокислотній послідовності, яка обрана із групи, що складається з SEQ ID NO: з 42 по -7 46; (с) антитіло зв'язує VAP-1 людини з Kd 1 × 10 М або нижче. В інших варіантах здійснення амінокислотні послідовності VH і/або VL на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % або 99 % є гомологічними послідовностям, зазначеним вище. Антитіло, що має області VH і VL, з більш високою гомологією (тобто 80 % або вище) з областями VH і VL зазначених вище послідовностей, може бути одержане за допомогою мутагенезу (наприклад, сайтспрямованого або опосередковуваного ПЦР мутагенезу) молекул нуклеїнової кислоти, що кодують SEQ ID NO: з 19 по 23 і з 42 по 46, з наступним тестуванням кодуємого зміненого антитіла на схоронність функції. При використанні в даному описі відсоток гомології між двома амінокислотними послідовностями еквівалентний відсотку ідентичності між двома послідовностями. Відсоток ідентичності двох послідовностей являє собою функцію кількості ідентичних положень, використовуваних послідовностями (тобто % гомології = (# ідентичних положень / сумарна # положень) x 100) з урахуванням числа пропусків і довжини кожного пропуску, які необхідно ввести для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Порівняння послідовностей і визначення відсотка ідентичності двох послідовностей може бути здійснене з використанням стандартних методів, відомих у даній області. У деяких варіантах здійснення антитіла за винаходом можуть бути сконструйовані із включенням модифікацій в області Fc, звичайно зі зміною однієї або більше функціональних властивостей антитіла, таких як період напівжиття в сироватці, фіксація комплементу, зв'язування з рецептором Fc і/або антигензалежна опосередковувана клітинами цитотоксичність. Більше того, антитіло за винаходом може бути хімічно модифіковане (наприклад, до антитіла можуть бути приєднані одна або більше хімічних частин) або модифіковане для зміни його глікозування знову для зміни одного або більше функціональних властивостей антитіла. Наприклад, область Fc може бути змінена шляхом заміни щонайменше одного амінокислотного залишку, обраного з амінокислотних залишків 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 і 322 (нумерація залишків в області Fc відповідає ЄС індексу Кабата), які можуть бути замінені на відмінний амінокислотний залишок, так що антитіло буде мати змінену спорідненість до ефекторного ліганду, але збереже антиген-зв'язувальну здатність батьківського антитіла. Ефекторний ліганд, спорідненість до якого змінюється, може являти собою, наприклад, рецептор Fc або компонент СІ комплементу. Цей підхід описується більш докладно, наприклад, у патентах США 5624821 і 5648260. Іншою модифікацією антитіл у даному описі, яка розглянута у винаході, є пегіляція. Антитіло може бути пегіловане, наприклад, для підвищення біологічного періоду напівжиття антитіла (наприклад, у сироватці). Для пегіляції антитіла антитіло або його фрагмент звичайно вводять у реакцію з 15 97516 поліетиленгліколем (ПЕГ). таким як реакційноздатне ефірне або альдегідне похідне ПЕГ в умовах, при яких одна або більш груп ПЕГ приєднуються до антитіла або фрагмента антитіла. Переважно, пегіляцію здійснюють шляхом реакції ацилування або реакції алкілування з реакційноздатною молекулою ПЕГ (або аналогічного реакційно-здатного водорозчинного полімеру). Використовуваний у даному описі термін "поліетиленгліколь" призначений для охоплення будь-яких форм ПЕГ, які використовуються для дериватизації інших білків, таких як моно (СІ-СІО) алкокси-або арилоксиполіетиленгліколь або поліетиленглікольмалеімід. У певних варіантах здійснення антитіло, призначене для пегіляції, являє собою антитіло без глікозильних залишків. Методи пегіляції білків відомі в даній області й можуть бути використані до антитіл за винаходом. У кращих варіантах здійснення даний винахід стосується специфічних повністю людських антитіл проти VAP-1 8C10, 8А4, 3F10, 4ВЗ і 5F12. В інших кращих варіантах здійснення даний винахід стосується рекомбінантних повністю людських антитіл проти VAP-1, таких як 8С10, 8А4, 3F10, 4ВЗ і 5F12. У рекомбінантних r8С10 (ВТТ-1023) важкий ланцюг складається з амінокислотної послідовності, яка представлена SEQ ID NO: 47, і легкий ланцюг складається з амінокислотної послідовності, яка представлена SEQ ID NO: 48. Таблиця 1 Амінокислотні послідовності повністю людських антитіл проти VAP-1 SEQ NO: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 ID Опис послідовності Консенсусна послідовність CDR1 важкого ланцюга Консенсусна послідовність CDR2 важкого ланцюга Консенсусна послідовність CDR3 важкого ланцюга CDR1 важкого ланцюга 8С10 CDR1 важкого ланцюга 8А4 CDR1 важкого ланцюга 3F10 CDR1 важкого ланцюга 5F12 CDR1 важкого ланцюга 4ВЗ CDR2 важкого ланцюга 8С10 CDR2 важкого ланцюга 8А4 CDR2 важкого ланцюга 3F10 CDR2 важкого ланцюга 5F12 CDR2 важкого ланцюга 4ВЗ CDR3 важкого ланцюга 8С10 CDR3 важкого ланцюга 8А4 CDR3 важкого ланцюга 3F10 CDR3 важкого ланцюга 5F12 CDR3 важкого ланцюга 4ВЗ Варіабельна область важкого ланцюга 8С10 Варіабельна область важкого ланцюга 8А4 Варіабельна область важкого ланцюга 3F10 16 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Варіабельна область важкого ланцюга 5F12 Варіабельна область важкого ланцюга 4ВЗ Консенсусна послідовність CDR1 легкого ланцюга Консенсусна послідовність CDR2 легкого ланцюга Консенсусна послідовність CDR3 легкого ланцюга CDR1 легкого ланцюга 8С10 CDR1 легкого ланцюга 8А4 CDR1 легкого ланцюга 3F10 CDR1 легкого ланцюга 5F12 CDR1 легкого ланцюга 4ВЗ CDR2 легкого ланцюга 8С10 CDR2 легкого ланцюга 8А4 CDR2 легкого ланцюга 3F10 CDR2 легкого ланцюга 5F12 CDR2 легкого ланцюга 4ВЗ CDR3 легкого ланцюга 8С10 CDR3 легкого ланцюга 8А4 CDR3 легкого ланцюга 3F10 CDR3 легкого ланцюга 5F12 CDR3 легкого ланцюга 4ВЗ Варіабельна область легкого ланцюга 8С10 Варіабельна область легкого ланцюга 8А4 Варіабельна область легкого ланцюга 3F10 Варіабельна область легкого ланцюга 5F12 Варіабельна область легкого ланцюга 4ВЗ Важкий ланцюг рекомбінантного г8С10 Легкий ланцюг рекомбінантного г8С10 Повністю людські антитіла проти VAP-1, переважно, одержують шляхом імунізації мишей, у яких природні гени імуноглобулінів миші інактивовані й функціонально замінені на весь набір генів імуноглобулінів людини або його частину. Таких мишей імунізують антигеном VAP-1 і потім від цих мишей створюють гібридоми, що продукують антитіла людини, з використанням звичайних способів. Потім ідентифікують клоновані клітини гібридом, які продукують моноклональні антитіла, що взаємодіють з антигеном VAP-1, і нарощують їх для одержання очищених повністю людських моноклональних антитіл. Альтернативні способи одержання антитіла людини включають перенос специфічності антитіла тварини на імуноглобулін людини. Наприклад, мишей імунізують антигеном VAP-1, і потім від цих мишей створюють гібридоми, що продукують антитіла, з використанням звичайних способів. Клоновані гібридомні клітини, які продукують моноклональні антитіла, що взаємодіють з антигеном VAP-1, потім ідентифікують і нарощують їх для одержання очищених моноклональних антитіл. Визначають послідовності кДНК варіабельних областей важкого й легкого ланцюгів антитіла й ідентифікують області, що визначають комплементар 17 ність (CDR). Амінокислотні послідовності CDR важкого й легкого ланцюгів використовуються для заміни відповідних CDR антитіла людини, переносячи в такий спосіб специфічність антитіла проти VAP-1 гризуна на антитіло людини. Отримане антитіло проти VAP-1 є повністю людським у тому розумінні, що, хоча вихідні амінокислотні послідовності CDR походять від гризунів, ті самі амінокислотні послідовності здатні генеруватися в людському антитілі, і його не можливо точно визначити як таке, що є специфічним для гризунів. Для створення гібридом, що продукують моноклональні антитіла людини за винаходом, спленоцити й/або клітини лімфатичних вузлів імунізованих мишей можуть бути виділені й злиті з придатною імморталізованою клітинною лінією, такою як клітинна лінія мишачої мієломи. Може бути проведений скринінг отриманих гібридом на продукування антигенспецифічних антитіл. Наприклад, суспензії окремих клітин лімфоцитів селезінки імунізованих мишей можуть бути злиті з однією шостою частиною по кількості РЗХ63-Ад8.653 несекретуючих клітин мієломи миші (АТТСС, CRL 1580) за допомогою 50 % ПЕГ. Клітини висівають у 5 кількості приблизно 2×10 на плоскодонні планшети для мікротитрування з наступною двотижневою інкубацією в селективному середовищі, що містить 20 % фетальну сироватку для клонування, 18 % кондиційоване середовище "653", 5 % ориген (IGEN), 4 мМ L-глутамін, 1 мМ піруват натрію, 5 мМ HEPES, 0,055 мМ 2-меркаптоетанол, 50 одиниць/мл пеніцилін, 50 мг/мл стрептоміцин, 50 мг/мл гентаміцин і IX HAT (Sigma; HAT додають через 24 години після злиття). Через приблизно два тижні клітини можна культивувати в середовищі, у якому HAT заміщений на НТ. Потім за допомогою ELISA може бути проведений скринінг індивідуальних лунок на моноклональні антитіла IgM і IgG людини. Як тільки починається екстенсивний ріст гібридоми, середовище може бути обстежене звичайно через 10-14 днів. Секретуючі антитіла гібридоми можуть бути пересіяні з повторним проведенням скринінгу й, якщо вони усе ще позитивні у відношенні IgG людини, моноклональні антитіла можуть бути субклоновані щонайменше двічі шляхом обмежувального розведення. Стабільні субклони можна потім культивувати in vitro для створення невеликих кількостей антитіла в середовищі тканинної культури для одержання його характеристик. З метою очищення моноклональних антитіл людини відібрані гібридоми можна вирощувати у дволітрових обертових колбах для очищення моноклональних антитіл. Супернатанти можна відфільтрувати й сконцентрувати перед афінною хроматографією на протеїн А-сефарози (Pharmacia, Piscataway, NJ.). Елюйовані IgG можна протестувати за допомогою гель-електрофорезу й високоефективної рідинної хроматографії для забезпечення чистоти. Буферний розчин можна замінити на ЗФР, і концентрацію можна визначити по ОП 280 з використанням коефіцієнта екстинкції 1,43. Моноклональні антитіла можна аліквотувати і зберігати при -80 °C. Повністю людські антитіла можна також отримати з бібліотек фагового дисплея, які використо 97516 18 вують генетично сконструйований фаг для демонстрації й продукції білків-антитіл людини на поверхні рекомбінантного фага. Одноланцюжкові антитіла з високою спорідненістю й специфічністю до будь-якої даної мішені відбирають шляхом скринінгу, і послідовності антитіл можуть бути потім виділені з фага для продукції рекомбінантного повністю людського антитіла. Такі методи фагового дисплея для виділення антитіл людини створені в даній області. Повністю людські антитіла за даним винаходом можуть бути також отримані з використанням мишей SCID, у яких відтворені імунні клітини людини так, що при імунізації може бути відтворена відповідь антитіл людини. Такі миші описані, наприклад, у патентах США 5476996 і 5698767. Коли це бажане, ДНК, що кодує варіабельні області легкого й важкого ланцюгів антитіла, можна виділити й гібридизувати з ДНК, що кодує будьяку бажану людську або модифіковану константну область, для одержання конструкта ДНК, який може бути вставлений в вектор експресії і трансфікований до придатного експресуючого хазяїна для продукції рекомбінантного повністю людського антитіла. Таким чином, антитіла за даним винаходом можуть бути. отримані також у трансфікованій клітині-хазяїні з використанням, наприклад, способів комбінаторики рекомбінантних ДНК і способів трансфекції генів, як це добре відомо в даній області. Наприклад, для експресії антитіл або їхніх фрагментів ДНК, що кодують неповні або повнорозмірні важкі й легкі ланцюги, можна одержати стандартними молекулярно-біологічними способами (наприклад, PCR ампліфікацією або клонуванням "ДНК із використанням гібридоми, яка експресує потрібне антитіло) і ДНК можуть бути вставлені в вектори експресії так, щоб гени були оперативно пов'язані з послідовностями, які контролюють транскрипцію й трансляцію. У даному контексті термін "оперативно зв'язані" призначений для позначення того, що ген антитіла лігований у вектор так, що послідовності, які контролюють транскрипцію й трансляцію у векторі, служать призначеній для них функції регуляції транскрипції й трансляції гена антитіла. Вектор експресії і послідовності, що контролюють експресію, вибирають так, щоб вони були сумісними з використовуваною експресуючою клітиною-хазяїном. Ген легкого ланцюга антитіла й ген важкого ланцюга антитіла можуть бути вставлені в окремий вектор або більш звичайно обидва гена вводять у той самий вектор експресії. Гени антитіла вводять в вектор експресії стандартними методами (наприклад, лігуванням комплементарних сайтів рестрикції у фрагменті гена антитіла й вектора або лігуванням тупих кінців, якщо сайти рестрикції не присутні). Варіабельні області легкого й важкого ланцюгів описаних у даному документі антитіл можуть бути використані для створення повнорозмірних антитільних генів будьякого ізотипу антитіл шляхом їх уведення в вектори експресії, що вже кодують константні області важкого ланцюга й легкого ланцюга бажаного ізотипу, так що сегмент VH оперативно зв'язується із сегментом(тами) константної області важкого лан 19 цюга (СH) у векторі, а сегмент V« оперативно зв'язується із сегментом константної області легкого ланцюга (СL.) у векторі. Додатково або альтернативно, рекомбінантний вектор експресії може кодувати сигнальний пептид, який полегшує секрецію ланцюга антитіла із клітини-хазяїна. Ген ланцюга антитіла може бути клонований у вектор, так що в гені сигнальний пептид зв'язується в рамці зчитування з амінокінцем ланцюга антитіла. Сигнальний пептид може являти собою сигнальний пептид імуноглобуліну або гетерологічний сигнальний пептид (тобто сигнальний пептид білка, що не є імуноглобуліном). На додаток до генів ланцюгів антитіл рекомбінантні вектори експресії за винаходом несуть регуляторні послідовності, які контролюють експресію генів ланцюгів антитіл у клітині-хазяїні. Термін "регуляторна послідовність" призначений для включення промоторів, енхансерів і інших елементів, що контролюють експресію (наприклад, сигналів поліаденілування), які контролюють транскрипцію або трансляцію генів ланцюгів антитіл, як добре відомо в даній області. Фахівцям у даній області має бути зрозуміло, що дизайн вектора експресії, включаючи вибір регуляторних послідовностей, може залежати від таких факторів, як вибір клітини-хазяїна для трансформації, рівень експресії бажаного білка і т.д. Кращі регуляторні послідовності для клітини-хазяїна ссавця включають вірусні елементи, які управляють високими рівнями експресії білків у клітинах ссавців, такі як промотори й/або енхансери, що походять від цитомегаловірусу (CMV), вірусу мавп 40 (SV40), аденовірусу (наприклад, головний пізній промотор аденовірусу (AdMLP) і поліоми. Альтернативно, можуть бути використані невірусні регуляторні послідовності, такі як промотор убіквітину або промотор р-глобіну. Більше того, регуляторні елементи складалися з послідовностей від різних джерел, такі як промоторна система вРальфа, яка містить послідовності від раннього промотору SV40 і довгий кінцевий повтор вірусу типу 1 Тклітинного лейкозу людини. На додаток до генів ланцюгів антитіла й регуляторних послідовностей рекомбінантні вектори експресії за винаходом можуть нести додаткові послідовності, такі як послідовності, які регулюють реплікацію вектора в клітинах-хазяїнах (наприклад, реплікатори) і гени маркерів селекції. Як добре відомо в даній області, ген маркера селекції полегшує селекцію клітин-хазяїнів, у які бувуведений вектор. Наприклад, звичайно ген маркера селекції надає стійкість до ліків, таких як G418, гігроміцин або метотрексат, клітині-хазяїнові, у яку введений вектор. Кращі гени маркерів селекції включають ген дигідрофолатредуктази (DHFR) (для використання в dhfr-клітинах-хазяїнах із селекцією/ампліфікацією метотрексатом) і ген nео (для селекції G418). Для експресії легкого й важкого ланцюгів вектор(и) експресії, що кодує(ють) важкий і легкий ланцюги, трансфікують у клітину-хазяїна стандартними методами. Різні форми терміна "трансфекція" призначені для охоплення широкої різноманітності методів, звичайно застосовуваних для 97516 20 введення екзогенної ДНК у прокаріотну або еукаріотну клітину-хазяїна, наприклад, електропорації, преципітації фосфатом кальцію, трансфекції за допомогою DEAE-декстрану й таке інше. Хоча теоретично можливо експресувати антитіла за винаходом або в прокаріотних, або в еукаріотних клітинах-хазяїнах, експресія антитіл в еукаріотних клітинах і найбільш переважно в клітинах-хазяїнах ссавців є найбільш переважною, тому що такі еукаріотні клітини й, зокрема, клітини ссавців із більшою ймовірністю, ніж прокаріотні клітини, здатні збирати й секретувати відповідним чином укладене й імунологічно активне антитіло. Експресія генів антитіла в прокаріот, як повідомлялося, є неефективною щодо продукування активного антитіла з високим виходом. Кращі клітини-хазяїни ссавців для експресії рекомбінантних антитіл за винаходом включають клітини яєчника китайського хом'ячка (клітини СНО) (включаючи клітини СНО dhfr-, що відомі в даній області), клітини NSO мієломи, клітини COS і клітини SP2. Коли рекомбінантні вектори експресії, що кодують гени антитіл, уводять у клітини-хазяїни ссавців, антитіла продукуються шляхом культивування клітин-хазяїнів протягом періоду часу, достатнього для можливості експресії антитіла в клітинах-хазяїнах, або більш переважно для секреції антитіла в культуральне середовище, в якому вирощують клітини-хазяїни. Антитіла можуть бути виділені з культурального середовища з використанням стандартних методів очищення білків. У додатковому аспекті даний винахід стосується молекули ДНК, що кодує варіабельну область важкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP-1, яка включає першу послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 49 по 53 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або другу послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 54 по 58 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або третю послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 59 по 63 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, причому зазначені послідовності ДНК кодують із 1 по 3 області CDR, відповідно. Відповідно до конкретного аспекту даний винахід стосується молекули ДНК, що кодує варіабельну область важкого ланцюга й включає послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 64 по 68 і консервативних варіантів їхніх послідовностей. У ще одному аспекті даний винахід стосується молекули ДНК, що кодує варіабельну область легкого ланцюга повністю людського антитіла проти VAP-1, яка включає першу послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 69 по 73 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або другу послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 74 по 78 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, і/або третю послідовність ДНК, обрану із гругіи, що складається з SEQ ID NO: з 79 по 83 і консервативних варіантів їхніх послідовностей, причому зазначені послідовності ДНК кодують із 1 по 3 області CDR, відповідно. Відповідно до конкретного аспекту даний винахід стосується молекули ДНК, що кодує 21 97516 варіабельну область важкого ланцюга й включає послідовність ДНК, обрану із групи, що складається з SEQ ID NO: з 84 по 88 і консервативних варіантів їхніх послідовностей. В одному варіанті здійснення даний винахід стосується молекул ДНК, що кодують рекомбінантні повністю людські антитіла проти VAP-1, такі як рекомбінантні 8С10, 8А4, 3F10, 4ВЗ і 5F12. У рекомбінантних r8C10 (BTT-1023) важкий ланцюг кодується ДНК, що включає полінуклеотидну послідовність, представлену SEQ ID N0:89, і легкий ланцюг кодується ДНК, що включає полінуклеотидну послідовність, представлену SEQ ID N0:90. Таблиця 2 Нуклеотидні послідовності повністю людських антитіл проти VAP-1 SEQ ID NO Опис послідовності 49 CDR1 важкого ланцюга 8С10 50 CDR1 важкого ланцюга 8А4 51 CDR1 важкого ланцюга 3F10 52 CDR1 важкого ланцюга 5F12 53 CDR1 важкого ланцюга 4ВЗ 54 CDR2 важкого ланцюга 8С10 55 CDR2 важкого ланцюга 8А4 56 CDR2 важкого ланцюга 3F10 57 CDR2 важкого ланцюга 5F12 58 CDR2 важкого ланцюга 4ВЗ 59 CDR3 важкого ланцюга 8С10 60 CDR3 важкого ланцюга 8А4 61 CDR3 важкого ланцюга 3F10 62 CDR3 важкого ланцюга 5F12 63 CDR3 важкого ланцюга 4ВЗ Варіабельна область важкого ланцю64 га 8С10 Варіабельна область важкого ланцю65 га 8А4 Варіабельна область важкого ланцю66 га 3F10 Варіабельна область важкого ланцю67 га 5F12 Варіабельна область важкого ланцю68 га 4ВЗ 69 CDR1 легкого ланцюга 8С10 70 CDR1 легкого ланцюга 8А4 71 CDR1 легкого ланцюга 3F10 72 CDR1 легкого ланцюга 5F12 73 CDR1 легкого ланцюга 4ВЗ 74 CDR2 легкого ланцюга 8С10 75 CDR2 легкого ланцюга 8А4 76 CDR2 легкого ланцюга 3F10 77 CDR2 легкого ланцюга 5F12 78 CDR2 легкого ланцюга 4ВЗ 79 CDR3 легкого ланцюга 8С10 80 CDR3 легкого ланцюга 8А4 81 CDR3 легкого ланцюга 3F10 82 CDR3 легкого ланцюга 5F12 83 CDR3 легкого ланцюга 4ВЗ Варіабельна область легкого ланцюга 84 8С10 22 85 86 87 88 89 90 Варіабельна область легкого ланцюга 8А4 Варіабельна область легкого ланцюга 3F10 Варіабельна область легкого ланцюга 5F12 Варіабельна область легкого ланцюга 4ВЗ Важкий ланцюг рекомбінантного г8С10 Легкий ланцюг рекомбінантного г8С10 Даний винахід додатково стосується векторів експресії, що включають нуклеотидні послідовності, описані вище. Придатні вектори експресії включають вектори, що містять елементи, важливі для експресії й секреції білків у клітинах-хазяїнах ссавців. Вектор може включати ДНК, що кодує константні області важкого ланцюга людини або константні області легкого ланцюга або обидві. Той самий вектор можна використовувати для експресії і важкого, і легкого ланцюгів або, альтернативно, можна використовувати різні вектори, що містять константні області або важкого, або легкого ланцюга. В одному з варіантів здійснення винаходу вектор експресії включає константну область важкого ланцюга lgG4 людини, модифіковану для зниження зв'язування з FcyRI і залежної від антитіла опосередковуваної клітинами цитотоксичності (ADCC) шляхом заміни амінокислоти лейцину 235 аланіном, як описано в патенті США 5624821. Нумерація залишків в області Fc відповідає нумерації ЄС індексу Кабата. Даний винахід також стосується клітинхазяїнів, трансфікованих векторами експресії за даним винаходом. Для експресії послідовностей ДНК, що кодують важкий й легкий ланцюги антитіла людини, можна використовувати будь-яку придатну систему клітина-хазяїн/вектор. Можна використовувати бактеріальні, наприклад, Escherichia coli, або інші мікробні системи, особливо для експресії фрагментів антитіла, таких як фрагменти Fab і F(ab')2, і особливо фрагментів Fv і фрагментів одноланцюжкового антитіла, наприклад, одноланцюжкових Fv'. Для одержання більш великих продуктів антитіла, включаючи повнорозмірні молекули антитіла й/або, при необхідності, глікозилованих продуктів можна використовувати еукаріотні системи експресії, наприклад, клітини-хазяїни рослин, дріжджів або ссавців або трансгенних рослин і ссавців. Придатні клітини-хазяїни ссавців включають клітини СНО (яєчника китайського хом'ячка) і лінії клітин мієломи або гібридоми, як викладено вище. Кращими клітинами-хазяями є клітини СНО. Ще в одному аспекті даний винахід стосується методу одержання рекомбінантних повністю людських антитіл проти VAP-1 за допомогою процесу, який включає трансфекцію клітини-хазяїна вектором експресії, який включає послідовності ДНК, що кодують важкий і легкий ланцюги повністю людського антитіла за даним винаходом під контролем придатних промоторів і сигналів секреції, і розмноження зазначеної клітини-хазяїна в таких умовах, в яких експресується кожний ланцюг, і виді 23 лення зазначеного й зібраного повністю людського антитіла проти VAP-1 або його біологічно активних похідних з культури. Загальні методи, за допомогою яких можуть бути сконструйовані вектори, методи трансфекції й методи культивування добре відомі в даній області. Даний винахід додатково стосується фармацевтичної композиції, що містить фармацевтично прийнятний носій або розріджувач і, у якості активного інгредієнта, повністю людське антитіло проти VAP-1 за даним винаходом. Композиція даного винаходу містить повністю людські антитіла проти VAP-1 за даним винаходом в кількостях, достатніх для протидії (повної або часткової) зв'язуванню нативного VAP-1 хворих із біологічними лігандами VAP-1 у хворих, яким потрібна така протидія, і особливо з лігандами VAP-1, що знаходяться на лейкоцитах. Кількості й схеми введення повністю людських антитіл проти VAP-1 за даним винаходом можуть бути легко визначені фахівцями в області клінічного лікування порушень, пов'язаних із запаленням. Звичайно лікувальна доза повністю людського антитіла проти VAP-1 повинна варіювати з урахуванням таких факторів, як: вік, стать й загальний стан здоров'я хворого, якого потрібно лікувати; тип паралельного лікування, якщо його здійснюють; частота лікування й характер бажаного ефекту; ступінь ушкодження тканини; тривалість симптомів; і інших змінних із доведенням до необхідного рівня конкретним лікарем. Бажану дозу можна вводити за один раз або за кілька разів для досягнення бажаних результатів. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можуть пропонуватися у вигляді одиниць лікарської форми. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити в будь-якому фармацевтично прийнятному носії для введення. їх можна вводити в будь-якій формі, яка виявляє профілактичну, паліативну, превентивну або лікувальну дію на опосередковувані VAP клінічні стани у хворих людей або тварин. Фармацевтичні композиції повністю людських антитіл проти VAP-1 за даним винаходом для парентерального або місцевого введення включають стерильні водні або неводні розчинники, суспензії й емульсії. Прикладами неводних розчинників є пропіленгліколь, поліетиленгліколь, рослинна олія, риб'ячий жир і органічні складні ефіри для ін'єкцій. Водні носії включають воду, водяні розчини спирту, включаючи носії для парентерального введення на основі фізіологічного розчину й забуференого середовища, включаючи розчин хлориду натрію, розчин Рингера, що містить лактозу, або нелетучі масла. Внутрішньовенні носії включають рідину й живильні добавки, електролітні добавки, такі як добавки декстрози й тому подібного на основі розчину Рінгера. Водні композиції за винаходом можуть містити придатні буферні агенти, такі як фосфати натрію й калію, цитратний, ацетатний, карбонатний або гліциновий буфери залежно від бажаного діапазону рН. Прийнятно також використання хлориду натрію як агента для доведення тонічності. Композиції можуть включати інші наповнювачі, такі як стабілізатори або консерванти. 97516 24 Придатні стабілізуючі наповнювачі включають поверхнево-активні речовини (полісорбат 20 і 80, полоксамер 407), полімери (поліетиленгліколі, повідони), вуглеводи (сахарозу, маніт, глюкозу, лактозу), спирти (сорбіт, гліцерин, пропіленгліколь, етиленгліколь), придатні білки (альбумін), придатні амінокислоти (гліцин, глутамінову кислоту), жирні кислоти (етаноламін), антиоксиданти (аскорбінову кислоту, цистеїн і т.д.), хелатуючи агенти (солі ЕДТА, гістидин, аспарагінову кислоту) або іони металів (Са, Ni, . Mg, Мn). До числа придатних консервантів входять бензиловий спирт, хлорбутанол, бензалконію хлорид і, можливо, парабени. Фармацевтична композиція за даним винаходом може бути запропонована в концентрованій формі або формі порошку для відтворення за потребою. У таких випадках можна використовувати склади порошку для розчину зазначених вище наповнювачів для ін'єкції / інфузії. У випадку ліофілізації кращими є певні кріозахисні речовини, включаючи полімери (повідони, поліетиленгліколь, декстран), цукри (сахарозу, глюкозу, лактозу), амінокислоти (гліцин, аргінін, глутамінову кислоту) і альбумін. Якщо розчин для відтворення додають в упаковку, він може складатися, наприклад, із чистої води для ін'єкцій або розчину хлориду натрію або розчинів декстрози або глюкози. Композиція за винаходом придатна для діагностики або лікування будь-якого стану, в який залучена запальна реакція, при якій в опосередкуванні трансміграції й інфільтрації лейкоцитів із крові в місце запалення відіграє роль адгезія VAP1. Так, композиція придатна для діагностики або лікування запальних поразок шкіри ревматичного або подагричного походження й захворювань сполучної тканини, таких як реактивні артропатії, постінфекційні артропатії, запальні поліартропатії, системні порушення сполучної тканини, запальні спондилопатії, міозит, синовіт, хвороба Рейтера, серопозитивний ревматоїдний артрит, інший ревматоїдний артрит, позасуглобове ревматоїдне захворювання, псоріазна й ентеропатична артропатії, юнацький артрит, артрит з невстановленою причиною, нодозний поліартеріїт і близькі стани, інші некротизуючі васкулопатії, дерматополіміозит, системний склероз, інші захворювання із системним залученням сполучної тканини, анкілозуючий спондилоартрит і інші запальні спондилопатії. Крім того, діагностиці й лікуванню композицією за винаходом можуть підлягати запальні захворювання кишечника, такі як хвороба Крона й виразковий коліт, дерматози, такі як буллезні порушення, дерматит, папулосквамозні порушення, еритема, склеротичний атрофічний лишай, крауроз вульви, дискоїдний червоний вовчок, кільцеподібна склеродермія, пухирчатка, пемфігоїд, герпетиформний дерматит, атопічний дерматит, алергійний контактний дерматит, подразнюючий контактний дерматит, контактний дерматит з невстановленою причиною, псоріаз, поліморфна еритема, інші запальні захворювання, такі як розсіяний склероз, запальна нейропатія, запальна міопатія, гострий розсіяний знцефаломієліт, васкуліт центральної нервової системи, синдром Шегрена, діабет, системний червоний вовчок, астма й запальне захворювання 25 печінки, хвороба Грейвса й тиреоїдит, атеросклероз, запалення ока, включаючи увеїт, ірит, іридоцикліт, алкогольний гепатит, алотрансплантація, ксенотрансплантація, гломерулонефрит, ушкодження при реперфузії й гострі запальні стани після інфаркту міокарда й інсульту. Терапевтично придатні повністю людські антитіла проти VAP-1 за даним винаходом можуть бути кон'юговані або хімічно, або за допомогою генної інженерії з іншими агентами, які забезпечують направлення антитіл до бажаного місця дії. Альтернативно, з антитілами за даним винаходом можуть бути кон'юговані інші сполуки або хімічно, або за допомогою генної інженерії для посилення антитіл або додання їм додаткових властивостей, особливо властивостей, які підвищують здатність антитіл викликати полегшення шкідливих ефектів, опосередковуваних зв'язуванням VAP-1. Повністю людські антитіла проти VAP-1 за даним винаходом можуть бути мічені або хімічно, або за допомогою генної інженерії для одержання антитіл, що виявляються. Такі мічені антитіла повинні бути зручними інструментами для візуалізації місць запалення в людини, особливо для in vivo імуносцинтіографічної візуалізації місць запалення. Цей тип візуалізації може замінити більш громіздкий і дорогий метод візуалізації лейкоцитів, використовуваний у цей час. Для цілей візуалізації використання фрагментів антитіл повинне бути кращим у порівнянні з підходом на основі повнорозмірних антитіл для протизапальної терапії, і фрагменти, отримані з повністю людських антитіл, повинні бути ще й безпечніше в порівнянні з їх химерними або мишачими еквівалентами. В іншому аспекті даний винахід стосується зниження або лікування запалення in vivo в організмі людини шляхом уведення хворій людині, якій потрібне таке лікування, ефективного рівня повністю людського антитіла проти VAP-1 за даним винаходом. Термін "лікування" або "лікувальна обробка" включає введення повністю людських антитіл проти VAP-1 індивідуумові із цілями, які можуть включати профілактику, полегшення, запобігання або лікування порушень, опосередковуваних подіями адгезії VAP-1. Конкретні антитіла проти VAP-1 за винаходом, є очищеними рекомбінантними повністю людськими антитілами проти VAP-1 за даним винаходом. Термін "ефективний рівень" повністю людського антитіла проти VAP-1 означає рівень, при якому шкідливі опосередковувані VAP-1 події, як мінімум, пом'якшуються. Ефективна кількість антитіла за даним винаходом є такою кількістю, яка є достатньою для блокування або часткового блокування зв'язування лейкоцитів ендотелієм для інгібування інфільтрації лейкоцитів у місця запалення, де така інфільтрація шкідлива або небажана. Фахівець в області клінічного лікування пов'язаних із запаленням порушень може легко визначити кількості й схеми введення повністю людських антитіл проти VAP-1. Переважно повністю людські антитіла проти VAP-1 за даним винаходом пропонуються для введення в судинне русло з інтервалами, що варіюють від одного разу на тиждень до одного разу на три місяці, у дозах у діапазоні від 0,01 до 20 97516 26 мг/кг, більш переважно в діапазоні від 0,1 до 10 мг/кг, найбільше переважно - від 0,5 до 5 мг/кг. Альтернативно, повністю людські антитіла проти VAP-1 за даним винаходом пропонуються для введення підшкірно з інтервалами, що варіюють від одного разу на тиждень до одного разу на три місяці, у дозах у діапазоні від 0,1 до 20 мг/кг, більш переважно в діапазоні від 0,2 до 10 мг/кг, найбільш переважно - від 0,5 до 5 мг/кг. Наступні приклади даються для додаткового більш докладного роз'яснення винаходу й не призначені для обмеження обсягу даного винаходу. Фахівцям у даній області, тобто клініцистам, знайомим із запальними порушеннями і їхнім лікуванням, цілком очевидні додаткові варіанти здійснення й застосування. Приклади Приклад 1 Виділення гібридом, що експресують моноклональне антитіло людини проти VAP-1 Для створення гібридомних клітин, що експресують моноклональне антитіло людини проти VAP1, використовували лінію мишей (Humab Mouse®; Medarex Inc.) із трансгеном імуноглобуліну людини. Humab Mouse® містить мінілокуси гена імуноглобуліну людини, які кодують неперегруповані послідовності важкого (μ і у) і легкого (к) ланцюгів імуноглобуліну людини, разом зі спрямованими мутаціями, які інактивують локуси ендогенних u і к ланцюгів (дивися, наприклад, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Відповідно, миші проявляють знижену експресію мишачого IgM або к, і у відповідь на імунізацію введені трансгени важкого й легкого ланцюгів людини зазнають зміну класу й соматичної мутації з виникненням вьюокоафінного моноклонального антитіла людини IgG к. Одержання й використання мишей Humab і геномні модифікації, носіями яких є такі миші, описані, наприклад, у патентах США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 і 5770429, які все належать Lonberg і Кау; патенті США 5545807, що належить Surani et al; публікаціях РСТ WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 і WO 99/45962, які все належать Lonberg і Kay; і публікації РСТ WO 01/14424, що належить Korman et al. При імунізації рекомбінантним VAP-1 людини (rhVAP-1) трансгенна миша продукує IgG антитіла людини, специфічні до VAP-1 людини. Схема імунізації була наступною: мишей імунізували множинними внутрішньочеревинними й підшкірними ін'єкціями rhVAP-1, очищеного із клітин СНО, стабільно трансфікованих експресійною плазмідою, що містить кДНК VAP-1 людини й експресує VAP-1 людини (Smith et al., J. Exp. Med. (1998) 188:17-27), змішаного з повним ад'ювантом Фрейнда, і потім rhVAP-1, змішаного з неповним ад'ювантом Фрейнда, або rhVAP-1, змішаного з ад'ювантом Рібі. Зразки сироватки імунізованих мишей аналізували для моніторингу імунного статусу за допомогою ELISA із захопленням антитіла при використанні іммобілізованого rhVAP-1 і технології флуорометричного аналізу для мікрооб'ємів (FMAT) із застосуванням клітин СНО, стабіль 27 97516 но трансфікованих експресійною плазмідою, що містить кДНК VAP-1 людини й експресує VAP-1 людини. Фінальні бустерні ін'єкції rhVAP-1 уводили внутрівенно й внутрішньочеревинно перед спленектомією. Гібридоми, що експресують моноклональне антитіло людини проти VAP-1, одержували злиттям клітин мієломи P3×63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) і спленоцитів мишей, імунізованих як описано вище, з використанням поліетиленгліколю (ПЕГ) у якості агента злиття. Супернатанти гібридом спочатку піддавали скринінгу за допомогою ELISA на наявність антитіл IgG людини з легким ланцюгом каппа. Позитивні на IgG людини клітини потім піддавали скринінгу за допомогою ELISA на наявність rhVAP-1 і за допомогою FMAT на зв'язування з VAP-1, що експресований на поверхні клітин СНО, стабільно трансфікованих експресійною плазмідою, що містить кДНК VAP-1 людини. Були відібрані п'ять гібридомних клонів з IgG-i людини проти VAP-1, а саме 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10. Приклад 2 Зв'язувальні VAP-1 властивості повністю людських антитіл 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 Для дослідження зв'язування 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 з rhVAP-1 використовували кількісний імунофлуорометричний аналіз із розділенням за часом. Планшет для мікротитрування покривали rhVAP-1 і потім блокували розчином бичачого сироваткового альбуміну. Потім для зв'язування rhVAP-1 додавали антитіло в кількості від 2 до 4320 нг/мл, і зв'язане антитіло виявляли за допомогою кон'югованого з європієм антитіла миші проти людини (Perkinelmer Inc.). Мітку визначали вимірюванням флуоресценції з розділенням за 3 часом (лічильник Victor для множинних міток, Perkinelmer Inc.) при 615 нм. Показники флуоресценції прямо корелюють із кількістю антитіла, пов'язаного з його мішенню. Дані для зразка потім аналізували в порівнянні зі стандартною кривою репера. Дані показують, що 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 зв'язуються з rhVAP-1, і спорідненість (Kd) представлена в таблиці 3. Таблиця 3 Зв'язування mAb 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 з rhVAP-1 mAb 8С10 3F10 4ВЗ 8А4 5F12 Kd (нМ) 0,21 0,25 0,31 0,28 0,65 Приклад З Одержання, клонування й секвенування кДНК варіабельних областей повністю людських антитіл 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 Для конструювання рекомбінантних антитіл кДНК, що кодують варіабельні області важкого й легкого ланцюгів людини з антитіл, отриманих у прикладі 1, виділяли й клонували в плазмідні вектори для аналізу секвенуванням. 28 Клони кДНК варіабельних областей важкого ланцюга (VH) і легкого ланцюга (VL) імуноглобуліну (Ід) людини були отримані з гібридомних клітин 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10, що експресують антитіло проти VAP-1, у такий спосіб. Сумарну РНК 6 одержували з 510 гібридомних клітин за допомогою набору Rneasy від Qiagen. кДНК VL і VH одержували зворотною транскрипцією РНК із наступною процедурою "швидкої ампліфікації кінців кДНК (RACE)» з використанням "набору для ампліфікації кДНК SMART RACE" і високоточного "набору ПЦР Advantage-HF 2" від BD Biosciences Clontech. Ампліфіковані ПЦР продукти потім очищали, клонували у вектор pCR4-TOPO ТА (Invitrogen) і трансформували їм штам Е. соli, ТОР10 (Invitrogen). Мініпрепарати ДНК плазмідних клонів VL і VH кожного з 5F12, 4ВЗ, 3F10, 8А4 і 8С10 секвенували. Нуклеотидні й виведені відповідні білкові послідовності представлені на фігурах з 1 по 6. Приклад 4 Конструювання вектора експресії для ссавців для експресії рекомбінантного mAbr8С10 Варіабельні області 8С10 вставляли в придатний вектор експресії для ссавців, що містить придатні константні області важкого й легкого ланцюгів, як описано нижче, для одержання функціонального рекомбінантного антитіла r8С10 (названого ВТТ-1023) у клітинах СНО. Відомо, що область Fc антитіла визначає здатність комплексів антитіло/ антиген направляти імунні відповіді. Ціль полягала в одержанні терапевтичних антитіл, які блокували б зв'язування лейкоцитів з ендотелієм судин і не проявляли б ефекторних функцій. Тому в векторі експресії використовували константну область важкого ланцюга lgG4 людини, модифіковану для зниження зв'язування з FcyRI і залежної від антитіла опосередковуваної клітинами цитотоксичності (ADCC) шляхом заміни амінокислоти лейцину 235 аланіном, як описано в патенті США 5624821. Ампліфікували кДНК VL і VH 8C10 з придатними сайтами клонування й оптимальною консенсусною послідовністю Козака на 5'-кінці з використанням PCR Supermix (Invitrogen). Для створення придатних сайтів рестрикції для клонування були сконструйовані прямий і зворотний праймери для ПЦР. Продукти ПЦР, які включають природні сигнальні послідовності VL і VH, відповідно, очищали й клонували в плазмідний вектор, що несе константну область легкого ланцюга каппа людини й важкий ланцюг гама 4 людини, що містить мутації із замінами серину 228 проліном і лейцину 235 аланіном, і названий plCO-g4PA(VAP1.8C10) з одержанням плазмід, якими потім трансформували клітини ТОР10 Е. соli. Області VL і VH плазміди секвенували для підтвердження цілісності клонованих продуктів ПЦР. Легкий ланцюг 8С10, що містить сайт клонування Hindlll, оптимальну консенсусну послідовність Козака на 5'-кінці й сайт клонування EcoRI на 3'-кінці, ампліфікували за допомогою ПЦР із використанням плазміди рІСО-g4PA(VAP1.8C10) у якості матриці й PCR Supermix. Продукт ПЦР, який включає нативну сигнальну послідовність легкого ланцюга 8С10, гідролізували Hindlll і EcoRI, очи 29 щали й клонували у вектор експресії рЕЕ12.4, який був отриманий від Lonza Biologies, по сайтах Hindlll і EcoRI з одержанням плазміди 2116. Плазмідою 2116 трансформували компетентні клітини E.coli DH5a Max Efficiency (Invitrogen Inc.). Важкий ланцюг 8С10, що містить сайт клонування Hindlll, оптимальну консенсусну послідовність Козака на 5'-кінці й сайт клонування EcoRI на 3'-кінці, ампліфікували за допомогою ПЦР із використанням плазміди рІСО-g4PA(VAP1.8C10) у якості матриці й PCR Supermix. Продукт ПЦР, який включає нативну сигнальну послідовність важкого ланцюга 8С10, гідролізували Hindlll і EcoRI. Фрагмент, що містить важкий ланцюг 8С10, очищали й клонували в вектор експресії рЕЕ6.4, який був отриманий від Lonza Biologies, по сайтах Hindlll і EcoRI з одержанням плазміди 2117. Плазмідою 2117 трансформували компетентні клітини DH5 Max efficiency. Плазміди 2116 і 2117 гідролізували Sali і Noti, і найбільш великий фрагмент кожного гідролізату лігували за допомогою Т4 ДНК-лігази з одержанням плазміди 2118 [2118-pEE12.4VAP1(8C10)]. Плазмідою 2118 трансформували компетентні клітини DH5 Max efficiency. Усю ДНК, що кодує важкий і легкий ланцюги, секвенували для підтвердження точності й цілісності послідовності. Приклад 5 Експресія рекомбінантного повністю людського антитіла ВТТ-1023 у клітинах СНО Повністю людське антитіло ВТТ-1023 одержували із клітин СНО у такий спосіб. Плазміду 2118pEE12.4-VAP1(8C10) лінеаризували за допомогою Pvul. ДНК трансфікували електропорацією у клітини CHOK1SV, отримані від Lonza Biologies. Клітини потім поміщали в об'ємі 50 мкл/лунку в 96-ямкові 3 планшети (2,510 клітин/лунку) у хімічно визначеному (CD) середовищі для СНО (Каталожний номер #04-0119, Gibco Invitrogen Inc.) після трансфекції (CD СНО без L-глутаміну + добавка 1Х GS (глутамінсинтази) + 2,16 мг/л тимідину). Через 24 години після цього в планшети додавали 150 мкл/лунку селективного середовища CD СНО (CD СНО без L-глутаміну + добавка 1Х GS+2,16 мг/л тимідину + 66,6 мкм MSX (метіонінсульфоксиміну) або 133,3 мкм MSX) з одержанням кінцевої загальної концентрації MSX 50 мкм або 100 мкм. Рівні продукції антитіла резистентними до MSX колоніями вимірювали за допомогою сендвічного ELISA для IgG людини. Колонії, що продукують антитіло на високому рівні, були відібрані. для розмноження в середовищі розмноження CD СНО (CD СНО без L-глутаміну + добавка 1Х GS+2,16 мг/л тимідину + 50 мкм MSX або 100 мкм MSX) спочатку в 24ямкових планшетах, потім в Т-колбах. Клітини розмножували в колбах, що струшуються, до одержання банку клітин трансфектоми (ТСВ) з 5 посудин. Клітинну лінію 15В7 відібрали із планшет з 50 мкм MSX і підтримували в середовищі розмноження CD СНО, що містить 50 мкм MSX. Антитіло одержували культивуванням трансфікованих клітин СНО, як описано вище, з одержанням кондиційного середовища, з якого можна було очистити ВТТ-1023 за допомогою стандартних методів очи 97516 30 щення моноклональних антитіл з культурального супернатанту. Приклад 6 Зв'язувальні властивості рекомбінантного повністю людського антитіла ВТТ-1023 Для кількісної оцінки зв'язування ВТТ-1023 з rhVAP-1 використовували імунофлуорометричний аналіз із розділенням за часом. Планшет для мікротитрування покривали rhVAP-1 і потім блокували розчином бичачого сироваткового альбуміну. Потім для зв'язування VAP-1 додавали ВТТ-1023 у кількості від 2 до 4320 нг/мл, і зв'язане ВТТ-1023 виявляли за допомогою кон'югованого з європієм антитіла миші проти людини (Perkinelmer Inc.). Мітку визначали виміром флуоресценції з розді3 ленням за часом (лічильник Victor для множинних міток, Perkinelmer Inc.) при 615 нм. Показники флуоресценції прямо корелюють із кількістю ВТТ1023, пов'язаного з його мішенню. Дані для зразка потім аналізували в порівнянні зі стандартною кривою репера. Дані показують, що ВТТ-1023 зв'язується з рекомбінантним VAP-1 людини зі спорідненістю (Kd) 0,38 нм. Для аналізу кінетики зв'язування rhVAP-1 з ВТТ-1023 використовували прямий аналіз зв'язування за допомогою тесту плазмонного резонансу поверхні Віасоге. Для захоплення ВТТ-1023 з рухливої фази використовували біотинілований білок G' (Sigma), іммобілізований на покритій стрептавідином матриці (Віасоге АВ). Кожний цикл складався із двох послідовних фаз: ін'єкції mAb ВТТ-1023 і ін'єкції лігандзв'язувального агента (rhVAP-1). У якості агента використовували постійну кількість rhVAP-1 при концентрації насичення mAb (лігандів). Експерименти проводили з використанням устаткування Bialite (Віасоге АВ), і дані аналізували за допомогою програми Віасоге. Дані показують, що рекомбінантний VAP-1 людини зв'язується з ВТТ-1023 зі спорідненістю (Kd) 0,13 нм. Зв'язування повністю людського ВТТ-1023 з VAP-1 людини аналізували за допомогою імунофлуоресцентного фарбування й проточної цитометрії. Для проточної цитометрії використовували трансфіковані клітини з лінії ендотеліальних клітин пацюка (клітини Ах), що експресують кДНК VAP-1 людини (Smith et al., J. Ех. Med. (1998) 188:17-27). 3 Ці клітини вирощували в 175 см колбах у середовищі RPMI 1640 (Sigma) з додаванням 20 % FCS (сироватки плодів телят), 2 мМ L-глутаміну, 1 мМ Na-пірувату, 10 мкМ Р-МЕ (бетамеркаптоетанолу), 1 % незамінних амінокислот, 100 Е/мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину й 0,75 мг/мл Генетицину™. Для відділення клітин їх двічі промивали ЗФР (забуференим фосфатом фізіологічним розчином) і інкубували в 10 мл буфера для дисоціації клітин (Gibcobrl) протягом 3 хв. при 37 °C. Після додавання 10 мл середовища клітини осаджували (5 хв, 1000 г, при кімнатній температурі), ресуспендували в буфері для промивання [ЗФР, 0,1 % (мас. / об.) БСА (бичачий сироватковий альбумін), 0,1 % (об. / об.) №N3] до концентрації 106 клітин/мл і зберігали на льоді. Клітинну суспензію (100 мкл/лунку) переносили в 96-ямкові планшети, клітини осаджували (4 хв, 1000 г, 10 °C), і в кожну лунку додавали 100 31 мкл аліквоти розчину антитіла. Після 30-хв. інкубації на льоді клітини промивали 150 мкл промивного буфера/лунку й потім інкубували з 100 мкл кон'югованого з FITC (флуоресцеїну ізотіоцианатом) IgG проти людини (специфічним у відношенні Fc, Sigma) протягом 30 хв. на льоді. Нарешті, клітини промивали, як описано вище, і фіксували додаванням 100 мкл буфера для промивання з 1 % (об. / об.) формальдегіду й залишали при 4 °C до аналізу на проточному цитометрі. Контрольні зразки офарблювали тільки кон'югованьїм з FITC вторинним антитілом проти IgG людини. Усі зразки для проточної цитометрії аналізували за допомогою FACScan™ (Becton Dickinson). Для кожного зразка одержували дані щонайменше для 10000 стробованих подій, і за допомогою програми Lysis II розраховували геометрично середній канал флуоресценції. Як показано фарбуванням трансфікованих клітин Ах, які експресуют VAP-1 на своїй поверхні, ВТТ-1023 специфічно зв'язується з VAP-1 людини (фіг. 7). Приклад 7 Функціональні властивості ВТТ-1023 Для тестування функціональної здатності ВТТ1023 інгібувати трансміграцію лейкоцитів через моношар ендотелію використовували тест трансміграції in vitro. Моношар ендотеліальних клітин Ах пацюка, трансфікованих для експресії рекомбінантного VAP-1 на своїй поверхні, вирощували у верхній камері апарата Transwell (Becton Dickinson). Свіжовиділені мононуклеарні клітини периферичної крові людини поміщали у верхні камери й давали їм рухатися в напрямку хемоатрактантного пептиду моноцитів fMLP (N-форміл-метіоніллейцил-фенілаланіну, 100 нМ) у нижніх камерах протягом 2 годин. Моношари обробляли або ВТТ1023, або ВТТ-1008, незв'язувальним антителом негативного контролю з константною областью людини (Kirton et al, Eur. J. Immunol. (2005) 35:3119-30), або з ВТТ-1002, химерним mAb проти VAP-1 позитивного контролю, про який відомо, що він блокує опосередковувану VAP-1 адгезію й трансміграцию. Клітини, що мігрували через моношар, збирали із дна камери й підраховували мікроскопічно. ВТТ-1023 значно знижувало міграцію клітин через моношар ендотеліальних клітин у концент-1 -1 рації 10 нг мл і блокувало міграцію при 1 мкг мл . Антитіло негативного контролю ВТТ-1008 не впли-1 вало на події в концентрації 1 мкг мл , а позитивний контроль ВТТ-1002 також повністю блокував -1 трансміграцію при 1 мкг мл , як видно на фігурі 8. Приклад 8 Поліпшені фармакокінетичні властивості рекомбінантного повністю людського антитіла ВТТ1023 у порівнянні з химерним антитілом ВТТ-1002 Двом мавпам-самкам (нелюдиноподібним приматам) уводили по 25 мг/кг ВТТ-1023 шляхом болюсної внутрішньовенної ін'єкції. Зразки крові для аналізу концентрації ВТТ-1023 збирали через 10 хвилин, 1, 3, 6, 24, 48, 72 і 144 години після введення дози. В імунофлуорометричному аналізі з розділенням за часом для кількісного визначення концентрації аналізованого агента (ВТТ-1002 або ВТТ 97516 32 1023) у сироватці мавпи використовується кон'юговане з біотином специфічне відносно аналізованого агента поліклональне антитіло кролика як агента захоплення на покритий стрептавідином планшет для мікротитрування. Такі поліклональні антитіла одержували повторними імунізаціями кроликів або ВТТ-1002, або ВТТ-1023, збором сироватки й афінним очищенням отриманих поліклональних антитіл проти ВТТ-1002 або ВТТ-1023. Визначення зв'язаного аналізованого агента проводили за допомогою кон'югованого з європієм вторинного антитіла. Мітку визначали виміром флуоресценції з розділенням за часом (лічильник 3 Victor для множинних міток, Perkinelmer Inc.) при 615 нм. Показники флуоресценції прямо корелюють із кількістю аналізованого агента в зразку. Дані для зразка потім аналізували в порівнянні зі стандартною кривою репера. Фармакокінетичні параметри визначали за допомогою аналізу без компартменталізації. При порівнянні з даними, отриманими в подібному дослідженні, виконаному з ВТТ-1002, у якому по 40 мкг/кг уводили внутрівенно двом мавпам-самкам, повністю людське антитіло проти VAP-1 проявляє поліпшені фармакокінетичні властивості з поліпшеним профілем концентрації в сироватці за часом (AUC) і збільшеним періодом напівжиття елімінації (таблиця 4). Таблиця 4 Фармакокінетичні властивості ВТТ-1023 у порівнянні з ВТТ-1002 Доза (мг/кг) 25 ВТТ1023 25 ВТТ1023 40 ВТТ1002 АUС(0-остання) (мкг*година/ мл) AUC (о--) (мкг*годи на/мл) t1/2 (година) Vd (мл/к г) 33200 55100 120 71 20600 23900 53 69 19100* 19100* 25* 75* *середнє для n=2 Приклад 9 Фармацевтичні композиції повністю людських антитіл Приклади фармацевтичної композиції, що містить повністю людське антитіло проти VAP-1 за даним винаходом, придатної для парентерального введення, представлені у вигляді розчину для ін'єкції або інфузії або у вигляді концентрату для такого розчину. Процентний уміст інгредієнта на 1 мл Антитіло проти VAP-1 Хлорид натрію або хлорид калію Динатрійгідрофосфату дигідрат Натрію або калію дигідрофосфат Сахароза 0,1-10 % 0,5-1,5 % 0,1-2 % 0,1-2 % 0,5-10 % 33 Полісорбат 20 або 80 Вода для ін'єкцій Процентний уміст інгредієнта на 1 мл Антитіло проти VAP-1 Хлорид натрію ЕДТА/DTPA Маніт Полісорбат 20 або 80 Цитрат натрію у вигляді дигідрату Вода для ін'єкцій 97516 0,01-1 % до 1 мл 0,1-10 % 0,5-1,5 % 0,01-1,5 % 0,1-5 % 0,01-1 % 0,5-5 % до 1 мл Приклад 10 Ефективність повністю людських антитіл у моделях запалення in vivo Ефективність лікування повністю людським антитілом проти VAP-1 індукованого колагеном артриту у макаки резус Дію повністю людських антитіл оцінюють на моделі індукованого колагеном артриту (СІА) у макак резус із метою збору даних про придатність антитіла ВТТ-1023 при показаннях на артрит. Для дослідження відбирають дорослих макак резус, негативних у відношенні МНС А26, із частотою СІА 99 %, імунізованих бичачим колагеном типу II. Тварин ділять на дві групи по п'ять особин. Артрит індукують ін'єкцією 3-5 мг бичачого колагену в повному ад'юванті Фрейнда в 10 точок на спині тварини. При використанні цього підходу артрит клінічно проявляється через 3-5 тижнів після імунізації й звичайно триває 7-9 тижнів. Внутрішньовенне лікування протягом чотирьох тижнів повністю людськими антитілами в дозах від 1 до 50 мг/кг двічі на тиждень починають при виявленні рівня CRP20 мг/л у двох послідовних записах. Контрольним тваринам уводять розчинносій. Стан тварин оцінюють за допомогою загальноклінічної шкали (0 = відсутність клінічних ознак артриту, 0,5 = жар (>0,5 °C), 1 = апатія, знижена рухливість і втрата апетиту, 2 = втрата маси, гарячі кінцівки й/або суглоби, біль без набряку м'яких тканин (STS), 3 = помірне почервоніння й STS суглобів, нормальна гнучкість кінцівок, 4 = сильне почервоніння й STS кінцівок з нерухомістю суглобів, 5 = важкий артрит, при якому показана евтаназія) і шкали тяжкості СІА (ступінь набряку м'якої тканини, гнучкості й потріскування, оцінюваних по шкалі від - до +++: - немає, ± сумнівна, + помірна, ++ важка, +++ гранична). Усі ці параметри дають загальноклінічний показник тяжкості СІА, який являє собою напівкількісний показник. Ефективність повністю людських антитіл проти VAP-1 у лікуванні індукованого антитілом проти колагену артриту у гуманізованих VAP-1 мишей Можна оцінити ефективність повністю людських антитіл по відношенню до індукованого антитілом проти колагену артриту у трансгенних мишей, що експресують VAP-1 на ендотелії. Артрит, що швидко розвивається, індукують ін'єкцією суміші антитіл із наступним через три дні внутрішньочеревинним уведенням ліпополісахариду. Мишам уводять повністю людське антитіло в дозах 3, 10 -1 або 30 мг кг на 1, 3 і 7 дні. Контрольним тваринам уводять носій. Можна показати зниження захворю 34 вання артритом за результатами статистично значимого зниження показника артриту в порівнянні з контролем. Ефективність лікування антитілом проти VAP1 на моделі псоріазу у гуманізованих мишей Недавнє створення й підтвердження моделі гуманізованої ксенотрансплантації дало корисний інструмент для поліпшення розуміння цього захворювання й тестування нових лікарських препаратів (Nickoloff BJ. Expert Opin. Investig. Drugs. (1999) 8:393-401). У цій моделі, нешкідливі біоптати всієї товщини шкіри хворих на псоріаз трансплантують анестезованим мишам із тяжким сполучним імунодефіцитом (SCID) тривалістю приблизно 7-9 тижнів, як описано раніше (Wrone-Smith et al. J. Clin. Invest. (1996) 98:1878-1887). Тваринам дають відновитися після хірургічної операції протягом щонайменше 23 тижнів перед індукцією захворювання. Мононуклеарні клітини периферичної крові людини (РВМС) виділяють зі зразка крові, одержуваного при біопсії, і активують суперантигеном SEB (ентеротоксином В стафілокока). Захворювання індукують внутрішньовенною або внутрішкірною ін'єкцією активованих РВМС у ксенотрансплантат. Повністю людське антитіло проти VAP-1 або носій уводять внутрівенно або підшкірно. Можливі як профілактичний, так і лікувальний режими доз різної тривалості. Крім того, після лікування повністю людським антитілом проти VAP-1 можна ввести внутрівенно мічені Т-клітини людини для більш детального дослідження дії на інфільтрацію клітин. Наприкінці періоду лікування мишей забивають, і трансплантати вирізують разом з навколишньою шкірою миші й фіксують у формаліні або моментально заморожують в азоті. Для оцінки патологічних змін, таких як зміни товщини епідермісу, інфільтрації клітин і експресії молекул адгезії, роблять гістологічний і імуногістохімічний аналіз. Можна показати ослаблення захворювання псоріазом, про що свідчить статистично значиме зниження показника в порівнянні з контролем. Ефективність повністю людського антитіла проти VAP-1 у лікуванні запалення печінки, викликаного введенням ССЦ гуманізованим VAP-1 мишам Вплив повністю людського антитіла проти VAP-1 на запалення печінки й фіброз оцінюють на мишачій моделі фіброзу печінки, викликаного введенням ССЦ. Трансгенним мишам, що експресують VAP-1 людини на ендотелії, роблять ін'єкцію 0,25 мкг/г ССl4 в/бр двічі на тиждень протягом 12 тижнів. Протягом 12 тижнів розвиваються інтенсивне запалення й рубцювання печінки, але після припинення ін'єкцій ССl4 рубці повністю розсмоктуються. Ефективність повністю людського антитіла, що вводиться в/в або в/бр у дозах від 1 до 25 мг/кг двічі на тиждень, для профілактики ушкодження й розсмоктування наявного фіброзу при використанні цієї моделі досліджують шляхом оцінки патологічних і гістологічних змін у печінці. Можна показати ослаблення захворювання, про що свідчить статистично значиме зниження показника в порівнянні з контролем. 35 Ефективність лікування антитілом проти VAP1 у моделі гострого інфаркту міокарда у анестезованого кролика В анестезованих білих новозеландських кроликів з механічною вентиляцією роблять ліву торакотомію. Серце експонують, і ліву коронарну артерію (LCA) віджимають. Повністю людське антитіло проти VAP-1 уводять внутрівенно через 25 хвилин після початку оклюзії. Через 5 хвилин після введення антитіла затиск видаляють і область потім реперфузують до 6 годин. Тварину умертвляють передозуванням використовуваного анестетика і серце видаляють і промивають фізіологічним розчином. LCA знову віджимають і через серце перфузують синій барвник Монастраля або Еванса з фарбуванням міокарда при збереженні області ризику незабарвленою. Серце заморожують і лівий шлуночок ріжуть на тонкі зрізи. Зрізи загальної частини й області ризику визначають за допомогою системи аналізу зображення. Зрізи потім інкубують з 1 % розчином хлориду трифенілтетразолію (ТТС) у забуференому фосфатом фізіологічному розчині з наступною інкубацією в 10 % забуференому до нейтральної реакції формаліні. Життєздатний міокард офарблюється в червоний колір інкубацією з ТТС, і в такий спосіб визначають область інфаркту шляхом виміру області незабарвленої тканини з поданням у вигляді відсотка виявленої області ризику. Можна показати зниження ушкодження тканини, про що свідчить статистично значиме зменшення відсотка області ризику в порівнянні з контролем. Ефективність лікування антитілом проти VAP1 індукованого mBSA артриту у кроликів Метилований бичачий сироватковий альбумін (mBSA), розчинений у фізіологічному розчині, змішують із рівним об'ємом повного ад'юванту Фрейнда і одержують емульсію. Новозеландських білих кроликів імунізують двічі інтрадермальною ін'єкцією емульсії із проміжком у чотирнадцять днів. Приблизно через 10 днів після другої імунізації від тварин одержують сироватку й роблять інтрадермальну ін'єкцію розчину mBSA. Відбирають тварин, що проявляють позитивні шкірні реакції, і розділяють їх випадковим чином на групи лікування на основі сироваткових титрів IgG проти mBSA. Через 14 днів після другої імунізації внутрівенно або підшкірно вводять антитіло проти VAP-1 або носій безпосередньо перед ін'єкцією розчину mBSA у порожнину суглоба правого коліна. У ліве 97516 36 коліно кожної тварини вводять фізіологічний розчин. Антитіло проти VAP-1 або ін'єкції негативного контролю вводять один або два рази на тиждень протягом усього дослідження. Починаючи від дня індукції (день 0), за кроликами спостерігають на предмет поведінки й зовнішнього вигляду шляхом щоденного обстеження й пальпації, і масу тіла реєструють через певні інтервали протягом усього дослідження. Набрякання колінного суглоба оцінюють у заздалегідь визначені моменти часу шляхом порівняння діаметрів збудженого (правого) і незапаленого (лівого) колін. Наприкінці експериментальної частини дослідження (день 21) тварин забивають. Збирають синовіальну рідину для визначення загальної кількості клітин білої крові й вмісту білка. З колінних суглобів кожної тварини вирізують синовіальну мембрану й розділяють подовжньо на два зразки в області колінної чашечки. Один із них піддають глибокому заморожуванню в рідкому азоті для визначення антитіла проти VAP-1 і експресії VAP1, а інші зразки синовіальної мембрани й інші тканини колінного суглоба фіксують в 10 % забуференому до нейтральної реакції формаліні для фарбування гематоксиліном і еозином (НЕ) і фосфовольфрамовою кислотою-гематоксиліном (РТАН). Пофарбовані НЕ зрізи оцінюють на предмет запальних реакцій, а пофарбовані РТАН зрізи оцінюють на предмет ступеня відкладення фібрину на поверхні синовіальної мембрани. Можна показати ослаблення захворювання артритом, про що свідчить статистично значиме зниження показника в порівнянні з контролем. На закінчення, ці приклади показують, що повністю людські антитіла проти VAP-1 зберігають властивості антитіл проти VAP-1 специфічного розпізнавання VAP-1 (приклади 2 і 6), блокують залежну від VAP-1 трансміграцію лейкоцитів через ендотелій (приклад 7) і мають поліпшені фармакокінетичні властивості в порівнянні з попередніми моноклональними антитілами проти VAP-1 (приклад 8). Для фахівця в даній області має бути очевидно, що відповідно до розвитку технології концепція за винаходом може бути реалізована різними шляхами. Винахід і варіанти його здійснення не обмежуються описаними вище прикладами й можуть варіювати в межах обсягу формули винаходу. 37 97516 38 39 97516 40 41 97516 42 43 97516 44 45 97516 46 47 97516 48 49 97516 50 51 97516 52 53 97516 54 55 97516 56 57 97516 58 59 97516 60