Виділене повністю людське моноклональне cd3 антитіло

1. Виділене повністю людське моноклональне CD3 антитіло або його імунологічно активний фрагмент, яке включає комбінацію важкого і легкого ланцюгів, вибрану із групи, яку складають: (i) важкий ланцюг, який включає гіперваріабельну ділянку 1 важкого ланцюга (VH CDR1), яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 27, гіпер 2 (19) 1 3 амінокислотну послідовність RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30); VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність DASNRAT (SEQ ID NO: 31), та VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32), і тим, що згадане антитіло також включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 4. 4. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що має мутацію у важкому ланцюзі на амінокислотному залишку у положенні 234, 235, 265 або 297, або у декількох з цих положень, і тим, що вивільнення цитокінів із Т-клітини у присутності згаданого антитіла зменшується порівняно з вивільненням цитокінів із Т-клітини у присутності такого антитіла, яке не має такої мутації. 5. Антитіло за п. 4, яке відрізняється тим, що наслідком згаданої мутації є залишок аланіну або глутамінової кислоти у згаданому положенні. 6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що належить до ізотипу IgG1 і має принаймні першу мутацію у положенні 234 і другу мутацію у положенні 235, причому наслідком згаданої першої мутації є залишок аланіну у положенні 234 і наслідком згаданої другої мутації є залишок глутамінової кислоти у положенні 235. 7. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що має важкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VH CDR1, яка має амінокислотну послідовність GYGMH (SEQ ID NO: 27); VH CDR2, яка має амінокислотну послідовність VIWYDGSKKYYVDSVKG (SEQ ID NO: 28); VH CDR3, яка має амінокислотну послідовність QMGYWHFDL (SEQ ID NO: 29), і легкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30); VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність DASNRAT (SEQ ID NO: 31); та VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 32), і тим, що згадане антитіло також включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 6, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 8. 8. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що має важкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VH CDR1, яка має амінокислотну послідовність SYGMH (SEQ ID NO: 33); VH CDR2, яка має амінокислотну послідовність IIWYDGSKKNYADSVKG (SEQ ID NO: 34); VH CDR3, яка має амінокислотну послідовність GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35); і легкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO: 36), RASQGISSALA (SEQ ID NO: 39) або WASQGISSYLA (SEQ ID NO: 43); VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність GASSRAT 94211 4 (SEQ ID NO: 37), YASSLQS (SEQ ID NO: 40) або DASSLGS (SEQ ID NO: 42); та VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 38) або QQYYSTLT (SEQ ID NO: 41), і тим, що згадане антитіло також включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 10, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 або SEQ ID NO: 20. 9. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що має важкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VH CDR1, яка має амінокислотну послідовність SYGMH (SEQ ID NO: 33); VH CDR2, яка має амінокислотну послідовність AIWYNGRKQDYADSVKG (SEQ ID NO: 44); VH CDR3, яка має амінокислотну послідовність GTGYNWFDP (SEQ ID NO: 35); і легкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, які являють собою VL CDR1, яка має амінокислотну послідовність RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 30) або RASQGISSALA (SEQ ID NO: 39); VL CDR2, яка має амінокислотну послідовність DASNRAT (SEQ ID NO: 31) або DASSLES (SEQ ID NO: 46); та VL CDR3, яка має амінокислотну послідовність QQRSNWPWT (SEQ ID NO: 45) або QQFNSYPIT (SEQ ID NO: 47), і тим, що згадане антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 22, та варіабельну ділянку легкого ланцюга, яка має амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 25 або SEQ ID NO: 26. 10. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що також містить каркасну ділянку 2 (FRW 2), яка має амінокислотну послідовність WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO: 73). 11. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що також містить каркасну ділянку 3 (FRW 3), яка має амінокислотну послідовність RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO: 74). 12. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що також містить варіабельну ділянку у положенні, що є С-кінцевим відносно CDR 3, причому згадана варіабельна ділянка має амінокислотну послідовність VTVSS (SEQ ID NO: 64) у положенні, що є Скінцевим відносно CDR 3. 13. Антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що також містить варіабельну ділянку у положенні, що є С-кінцевим відносно CDR 3, причому згадана варіабельна ділянка має амінокислотну послідовність GTLVTVSS (SEQ ID NO: 65) у положенні, що є С-кінцевим відносно CDR 3. 14. Антитіло за п. 12, яке відрізняється тим, що також містить варіабельну ділянку у положенні, що є С-кінцевим відносно CDR 3, причому згадана варіабельна ділянка має амінокислотну послідовність WGRGTLVTVSS (SEQ ID NO: 66) у положенні, що є С-кінцевим відносно CDR 3. 15. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що належить до ізотипу IgG1. 5 Цей винахід, взагалі, стосується до повністю людських анти-СD3 антитіл, а також до способів їх застосування. Імунна система організму відіграє роль захисту проти різноманітних умов, у тому числі, наприклад, пошкоджень, інфекції і неоплазії, і опосередковується двома окремими, але взаємозв'язаними системами, а саме клітинною і гуморальною імунною системами. Загалом кажучи, гуморальна система опосередковується розчинними продуктами, які називають антитілами або імуноглобулінами, які мають здатність до об'єднання з і нейтралізації продуктів, які розпізнаються згаданою системою як чужорідні для згаданого організму. У протилежність до цього, клітинна імунна система залучає мобілізацію певних клітин, які називають Тклітинами, і які призначені для виконання цілого ряду терапевтичних функцій. Імунна система як людей, так і тварин включає два головні класи лімфоцитів: клітини, що продукуються тимусом (Т-клітини), і клітини, що продукуються кістковим мозком (В-клітини). Зрілі Тклітини залишають тимус і циркулюють між тканинами, лімфатичними судинами і системою кровообігу. Т-клітини демонструють імунологічну специфічність і є безпосередньо залученими до клітинноопосередкованих імунних реакцій (наприклад, відторгнення трансплантату). Т-клітини діють проти або у відповідь на різноманітні чужорідні структури (антигени). У багатьох випадках ці чужорідні антигени експресуються на клітинах-хазяях як результат інфекції. Чужорідні антигени, однак, можуть також походити від хазяїна, який зазнав зміни під впливом неоплазії або інфекції. Незважаючи на те, що Т-клітини самі по собі антитіл не секретують, вони, як правило, є необхідними для секреції антитіл лімфоцитами другого класу, Вклітинами. Існують різноманітні субпопуляції Т-клітин, які, у цілому, визначаються антигенними детермінантами, які знаходяться на їхній поверхні, а також функціональною активністю і розпізнаванням чужорідних антигенів. Деякі субпопуляції Т-клітин, наприклад, клітини CD8+, є клітинамикілерами/клітинами-супресорами, які відіграють регуляційну функцію у імунній системі, у той час як інші, наприклад, клітини CD4+, призначені для стимулювання запальних і гуморальних реакцій. Людські периферичні Т-лімфоцити можуть бути стимульовані для переходу до мітозу різноманітними агентами, у тому числі чужорідними антигенами, моноклональними антитілами і лектинами, наприклад, фітогемаглютиніном і конканаваліном А. Незважаючи на те, що активація, як вважають, відбувається шляхом зв'язування мітогенів зі специфічними сайтами на клітинних мембранах, природа цих рецепторів і механізм їх активації повністю не з'ясовані. Індукція проліферації є лише одним із показників активації Т-клітин. До інших показників активації, які визначаються як зміни у основній фазі або фазі спокою згаданої клітини, належить підвищене продукування лімфокінів і посилена цитотоксична активність клітини. Активація Т-клітини є складним явищем, яке залежить від участі різноманітних молекул клітин 94211 6 ної поверхні, які експресуються популяцією Тклітин, що реагує. Наприклад, антигенспецифічний Т-клітинний рецептор (TcR) являє собою гетеродимер із дисульфідними зв'язками, який складається з двох клонально розподілених, інтегральних мембранних глікопротеїнових ланцюгів, альфа і бета (α і β) або гамма і дельта ( і ), нековалентно зв'язаних із комплексом інваріантних білків низької молекулярної маси, який, як правило, позначають як CD3 (раніше позначали як Т3). Альфа і бета ланцюги TcR визначають антигенні специфічності. Структури CD3 представляють допоміжні молекули, які є трансдукцій ними елементами сигналів активації, що ініціюються у разі зв'язування TcR альфа бета (TcR αβ) зі своїм лігандом. Існують як константні, так і варіабельні ділянки глікопротеїнових ланцюгів TcR (поліморфізми). Варіабельні ділянки поліморфних TcR визначають субпопуляції Т-клітин із різними специфічностями. На відміну від антитіл, які розпізнають цілі або менші фрагменти чужорідних білків як антигени, комплекс TcR взаємодіє лише з невеликими пептидами антигену, які повинні бути представлені у контексті молекул головного комплексу гістосумісності (МНС). Ці білки МНС представляють інший високополіморфний набір молекул, довільно розподілений серед видів. Таким чином, активація, як правило, потребує тристоронньої взаємодії TcR і чужорідного пептидного антигену, зв'язаного з білками головного комплексу гістосумісності (МНС). Цей винахід пропонує повністю людські моноклональні антитіла, специфічно спрямовані проти CD3. Типовими моноклональними антитілами є 28F11, 27Н5, 23F10 та 15С3, опис яких наводиться. Відповідно до альтернативного варіанта, моноклональним антитілом є антитіло, яке зв'язується з тією самою антигенною детермінантою, що й 28F11, 27Н5, 23F10 або 15С3. Згадані антитіла, відповідно, позначаються у цьому описі як huCD3 антитіла. huCD3 антитіло має одну або декілька з наведених нижче характеристик: згадане антитіло зв'язується з СD3-позитивними (CD3+) клітинами, але не з СD3-негативними (СD3") клітинами; huCD3 антитіло індукує антигенну модуляцію, яка включає зміну (наприклад, зниження) рівня поверхневоклітинної експресії або активності CD3 чи Тклітинного рецептора (TcR); huCD3 антитіло пригнічує зв'язування мишачого анти-людського ОKТ3 моноклонального антитіла з Т-лімфоцитами; або huCD3 антитіло зв'язує антигенну детермінанту CD3, яка повністю або частково включає амінокислотну послідовність EMGGITQTPYKVSISGT (Послідовність №21). huCD3 антитіла відповідно до цього винаходу конкурують із мишачим анти-CD3 антитілом ОKТ3 за зв'язування з CD3, і піддання впливу huCD3 антитіла видаляє або маскує CD3 та/або TcR без негативного впливу на поверхневоклітинну експресію CD2, CD4 або CD8. Наслідком маскування CD3 та/або TcR є втрата або зниження активації Т-клітин, що є бажаним у разі автоімунних захворювань, при яких відбувається неконтрольована активація Т-клітин. Наслідком регуляції CD3 за типом зворотного зв'язку є тривалий ефект зниження активації Т-клітин, наприклад, впродовж 7 щонайменше декількох місяців, порівняно з тимчасовою супресією, яка спостерігається у разі застосування традиційного імуносупресивного агента, наприклад, циклоспорину. Антигенна модуляція означає перерозподіл та видалення СD3-Т-клітинного рецепторного комплексу на поверхні клітини, наприклад, лімфоцита. Зниження рівня поверхневоклітинної експресії або активності TcR на клітині означає зниження кількості або функції TcR. Модуляція рівня поверхневоклітинної експресії або активності CD3 означає зміну кількості CD3 на поверхні клітини або функції CD3, наприклад, зниження. Кількість CD3 або TcR, експресована на плазматичній мембрані клітини, зменшується, наприклад, шляхом інтерналізації CD3 або TcR у разі контакту клітини з huCD3 антитілом. Відповідно до альтернативного варіанта, у разі контакту клітини з huCD3 антитілом, CD3 або TcR маскується. Пригнічення зв'язування мишачого антилюдського моноклонального антитіла ОKТ3 з Тлімфоцитом визначається як зменшення здатності мишачого антитіла ОKТ3 до утворення комплексу з CD3 на клітинній поверхні Т-лімфоцита. huCD3 антитіло включає варіабельну ділянку важкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовностями №2, №6, №10 або №22, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, що має амінокислотну послідовність, представлену Послідовностями №4, №8, №16-20 або №25-26. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, три гіперваріабельні ділянки (CDR) важкого ланцюга включають амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичною послідовності, вибраної з групи, яку складають GYGMH (Послідовність №27); VIWYDGSKKYYVDSVKG (Послідовність №28); QMGYWHFDL (Послідовність №29); SYGMH (Послідовність №33); IIWYDGSKKNYADSVKG (Послідовність №34); GTGYNWFDP (Послідовність №35) та AIWYNGRKQDYADSVKG (Послідовність №44), і легкий ланцюг із трьома гіперваріабельними ділянками, що включають амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичною послідовності, вибраної з групи, яку складають амінокислотна послідовність RASQSVSSYLA (Послідовність №30); DASNRAT (Послідовність №31); QQRSNWPPLT (Послідовність №32); RASQSVSSSYLA (Послідовність №36); GASSRAT (Послідовність №37); QQYGSSPIT (Послідовність №38); RASQGISSALA (Послідовність №39); YASSLQS (Послідовність №40); QQYYSTLT (Послідовність №41); DASSLGS (Послідовність №42); WASQGISSYLA (Послідовність №43); QQRSNWPWT (Послідовність №45); DASSLES (Послідовність №46) та QQFNSYPIT (Послідовність №47). Згадане антитіло зв'язує CD3. huCD3 антитіло за цим винаходом демонструє щонайменше дві або більше (тобто дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше, вісім або більше, дев'ять або більше, десять або більше, одинадцять або більше) з наведених нижче харак 94211 8 теристик: згадане антитіло містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), що кодується послідовністю гена VH людської зародкової лінії DP50 або нуклеїновокислотною послідовністю, яка є гомологічною до послідовності гена VH людської зародкової лінії DP50; згадане антитіло містить варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що кодується послідовність гена VL людської зародкової лінії L6 або нуклеїновокислотною послідовністю, яка є гомологічною до послідовності гена VL людської зародкової лінії L6; згадане антитіло містить VL, що кодується послідовністю гена VL людської зародкової лінії L4/18a або нуклеїновокислотною послідовністю, яка є гомологічною до послідовності гена VL людської зародкової лінії L4/18a; згадане антитіло включає гіперваріабельну ділянку 1 (CDR 1) VH, що містить амінокислотну послідовність YGMH (Послідовність №58); згадане антитіло включає гіперваріабельну ділянку 2 (CDR 2) VH, що містить амінокислотну послідовність DSVKG (Послідовність №59); згадане антитіло включає гіперваріабельну ділянку 2 (CDR 2) VH, що містить амінокислотну послідовність IWYX1GX2X3X4X5YX6DSVKG (Послідовність №60); згадане антитіло включає гіперваріабельну ділянку З (CDR 3) VH, що містить амінокислотну послідовність XAXBGYXCXDFDXE (Послідовність №61); згадане антитіло включає гіперваріабельну ділянку 3 (CDR 3) VH, що містить амінокислотну послідовність GTGYNWFDP (Послідовність №62) або амінокислотну послідовність QMGYWHFDL (Послідовність №63); згадане антитіло включає амінокислотну послідовність VTVSS (Послідовність №64) у положенні, яке є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3), де згадане положення знаходиться у межах варіабельної ділянки, що є С-кінцевою відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3); згадане антитіло включає амінокислотну послідовність GTLVTVSS (Послідовність №65) у положенні, яке є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3), де згадане положення знаходиться у межах варіабельної ділянки, що є С-кінцевою відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3); згадане антитіло включає амінокислотну послідовність WGRGTLVTVSS (Послідовність №66) у положенні, яке є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3), де згадане положення знаходиться у межах варіабельної ділянки, що є С-кінцевою відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3); згадане антитіло зв'язується з антигенною детермінантою, яка повністю або частково включає амінокислотну послідовність EMGGITQTPYKVSISGT (Послідовність №67); і згадане антитіло включає мутацію у важкому ланцюзі на залишку амінокислоти у положенні 234, 235, 265 або 297 або їх комбінаціях і де вивільнення цитокінів із Т-клітини у присутності згаданого антитіла зменшується, порівняно з вивільненням цитокінів із Т-клітини у присутності антитіла, яке не включає мутації у важкому ланцюзі у положенні 234, 235, 265 або 297 або їх комбінаціях. Номенклатура залишків важкого ланцюга, наведена у цьому описі, відповідає номенклатурі Індексу Європейського Союзу (дивись Кебот (Kabat) та інші, "Proteins of Immunological Interest", US Dept. of 9 Health & Human Services (1983)), як показано, наприклад, у патентах США №5,624,821 та №5,648,260, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За деякими аспектами, huCD3 антитіло містить амінокислотну мутацію. Згадана мутація знаходиться у межах константної ділянки. Наслідком мутації є антитіло, яке має змінену ефекторну функцію. Ефекторна функція антитіла змінюється шляхом зміни, тобто збільшення або зменшення, спорідненості згаданого антитіла до ефекторної молекули, наприклад, рецептора Fc-фрагмента або складової комплементу. Шляхом зміни ефекторної функції антитіла можна контролювати різні аспекти імунної реакції, наприклад, посилення або пригнічення різних реакцій імунної системи. Наслідком згаданої мутації є, наприклад, антитіло, що є здатним до зменшення вивільнення цитокінів із Т-клітини. Згадана мутація знаходиться, наприклад, у межах важкого ланцюга на залишку амінокислоти 234, 235, 265 або 297 чи їх комбінаціях. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, наслідком згаданої мутації є залишок аланіну у положенні 234, 235, 265 чи 297 або залишок глутамату у положенні 235 чи їх комбінація. Термін "цигокін" означає усі людські цитокіни, відомі у цій галузі, які зв'язують позаклітинні рецептори, експресовані на поверхні клітини, і тим самим модулюють функцію клітини, у тому числі (але без обмеження) IL-2 (інтерлейкін-2), -IFN (гаммаінтерферон), TNF-α (фактор некрозу пухлин), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 та IL-13. Наслідком вивільнення цитокінів є токсикоз, відомий як синдром вивільнення цитокінів (CRS), що є поширеним клінічним ускладненням, яке спостерігається, наприклад, у разі застосування антиТ-клітинного антитіла, такого як ATG (антитимоцитарного глобуліну) та ОKТ3 (мишачого антилюдського CD3 антитіла). Цей синдром характеризується надмірним вивільненням таких цитокінів, як TNF, IFN та IL-2, до кровообігу. CRS виникає як результат одночасного зв'язування антитіл з CD3 (через варіабельну ділянку антитіла) та рецепторами Fcфрагмента та/або рецепторами комплементу (через константну ділянку антитіла) на інших клітинах, з активацією тим самим Т-клітин до вивільнення цитокінів, що викликає системну запальну реакцію, яка характеризується гіпотензією, гіпертермією та ригідністю. Симптоми CRS включають пропасницю, озноб, нудоту, блювання, гіпотензію та задишку. Таким чином, huCD3 антитіло за цим винаходом включає одну або декілька мутацій, які запобігають опосередкованому константною ділянкою важкого ланцюга вивільненню одного або декількох цитокінів in vivo. Повністю людські CD3 антитіла за цим винаходом включають, наприклад, мутацію L234L235A234E235 на Fc-фрагменті, завдяки чому вивільнення цитокінів, у разі піддання впливу 94211 10 huCD3 антитіла, значно зменшується або припиняється (дивись, наприклад, Фіг.11А, Фіг.11В). Як описано нижче у Прикладі 4, мутація L234L235A234E235 на Fc-фрагменті huCD3 антитіл за цим винаходом зменшує або припиняє вивільнення цитокінів у разі піддання huCD3 антитіл впливу людських лейкоцитів, у той час як описані нижче мутації підтримують здатність до значного вивільнення цитокінів. Наприклад, значне зменшення вивільнення цитокінів виявляється при порівнянні вивільнення цитокінів у разі підцання впливу huCD3 антитіла, що має мутацію L234L235A234E235 на Fc-фрагменті, з рівнем вивільнення цитокінів у разі підцання впливу іншого анти-СD3 антитіла, що має одну або декілька мутацій, опис яких наведено нижче. До числа інших мутацій на Fc-фрагменті належать, наприклад, L234L235A234A235, L235E235, N297A297 та 265 265 D A . За альтернативним варіантом, huCD3 антитіло кодується нуклеїновою кислотою, що включає одну або більше мутацій, які замінюють залишок нуклеїнової кислоти на залишок нуклеїнової кислоти зародкової лінії. Словосполучення "залишок нуклеїнової кислоти зародкової лінії" означає залишок нуклеїнової кислоти, який є природно присутнім у гені зародкової лінії, що кодує константну або варіабельну ділянку. "Геном зародкової лінії" є ДНК, яка знаходиться у зародковій клітині (тобто клітині, якій призначено стати яйцеклітиною або сперматозоїдом). "Мутація зародкової лінії" означає спадкову зміну конкретної ДНК, яка відбулась у зародковій клітини або зиготі на стадії першого поділу клітин, і така мутація, у разі передачі нащадку, включається до кожної клітини тіла. Мутація зародкової лінії є протилежністю соматичної мутації, яка залишається у одній клітині організму. У деяких випадках, нуклеотиди послідовності ДНК зародкової лінії, що кодують варіабельну ділянку, зазнають мутації (тобто соматичної мутації) і замінюються на інший нуклеотид. Таким чином, антитіла за цим винаходом включають одну або декілька мутацій, яка замінює нуклеїнову кислоту на залишок нуклеїнової кислоти зародкової лінії. Гени антитіла зародкової лінії включають, наприклад, DP50 (Номер депонування: IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ:L066l8), L6 (Номер депонування: IMGT/EMBL/GenBank/DDBJ:X01668) та L4/18A (Номер депонування: EMBL/GenBank/DDBJ:Z00006). Важкий ланцюг huCD3 антитіла є похідним Vгена (ген варіабельної ділянки імуноглобуліну) зародкової лінії, наприклад гена зародкової лінії DP50. Нуклеїновокислотні і амінокислотні послідовності гена зародкової лінії DP50 включають, наприклад, нуклеїновокислотні і амінокислотні послідовності, наведені нижче: 11 huCD3 антитіла за цим винаходом включають варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), що кодується послідовністю гена VH людської зародкової лінії DP50. Послідовність гена VH людської зародкової лінії DP50 представлена, наприклад, Послідовністю №48 на Фіг.5. huCD3 антитіла за цим винаходом включають варіабельну ділянку важкого ланцюга (VH), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка є щонайменше на 80% гомологічною до послідовності гена VH людської зародкової лінії DP50. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згадана нуклеїновокислотна послідовність є щонайменше на 90%, 95%, 96%, 97% гомологічною до послідовності гена VH людської зародкової лінії DP50, а відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше на 98%, 99% гомологічною до послідовності гена VH людської зародкової лінії DP50. VH huCD3 антитіла є щонайменше на 80% гомологічною до амінокислотної послідовності VH, що кодується послідовністю гена VH людської зародкової лінії DP50. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згадана амінокислотна послідовність VH huCD3 антитіла є щонайменше на 90%, 95%, 96%, 97% гомологічною до амінокислотної послідовності, що кодується послідовністю гена VH людської зародкової лінії DP50, а відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше на 98%, 99% гомологічною до послідовності, що кодується послідовністю гена VH людської зародкової лінії DP50. huCD3 антитіла за цим винаходом включають також варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що кодується послідовністю гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a. Послідовність гена VL людської зародкової лінії L6 представлена, наприклад, Послідовністю №74 на Фіг.6, а послідовність гена VL людської зародкової лінії L4/18a представлена, наприклад, Послідовністю №53 на Фіг.7. За альтернативним варіантом, huCD3 антитіла включають варіабельну ділянку легкого ланцюга (VL), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка є щонайменше на 80% гомологічною до послідовності гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згадана нуклеїновокислотна послідовність є щонайменше на 90%, 95%, 96%, 97% гомологічною до послідовності гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a, а відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше 94211 12 на 98%, 99% гомологічною до послідовності гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a. VL huCD3 антитіла є щонайменше на 80% гомологічною до амінокислотної послідовності VL, що кодується послідовністю гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, згадана амінокислотна послідовність VL huCD3 антитіла є щонайменше на 90%, 95%, 96%, 97% гомологічною до амінокислотної послідовності, що кодується послідовністю гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a, а відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше на 98%, 99% гомологічною до послідовності, що кодується послідовністю гена VL людської зародкової лінії L6 або L4/18a. huCD3 антитіла за цим винаходом мають, наприклад, частково консервативні амінокислотні послідовності, що є похідними зародкової лінії DP50. Наприклад, гіперваріабельна ділянка 1 (CDR 1) huCD3 антитіл за цим винаходом має щонайменше суміжну амінокислотну послідовність YGMH (Послідовність №58). Гіперваріабельна ділянка 2 (CDR 2) huCD3 антитіл включає, наприклад, щонайменше суміжну амінокислотну послідовність DSVKG (Послідовність №59). Наприклад, гіперваріабельна ділянка 2 (CDR 2) включає суміжну амінокислотну послідовність IWYX1GX2X3X4X5YX6DSVKG (Послідовність №60), де Х1, Х2, Х3, Х4, Х5 та Х6 представляють будь-яку амінокислоту. Наприклад, Х1, Х2, Х3 та Х4 є гідрофільними амінокислотами. У деяких huCD3 антитіл за цим винаходом Х1 є аспарагіном або аспартатом, Х2 є аргініном або серином, Хз є лізином або аспарагіном, Х4 є лізином або глутаміном, Х5 є аспартатом, аспарагіном або тирозином і/або X6 є валіном або аланіном. Наприклад, ділянка VH CDR 2 містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка включає AIWYNGRKQDYADSVKG (Послідовність №69), IIWYDGSKKNYADSVKG (Послідовність №70), VIWYDGSKKYYVDSVKG (Послідовність №71) та VIWYDGSNKYYADSVKG (Послідовність №72). Гіперваріабельна ділянка 3 (CDR 3) huCD3 антитіл містить, наприклад, щонайменше суміжну амінокислотну послідовність XAXBGYXCXDFDXE (Послідовність №61), де ХА, ХВ, ХС, XD та ХЕ представляють будь-яку амінокислоту. У деяких huCD3 антитіл за цим винаходом ХА та ХB є нейтральними амінокислотами, XD є ароматичною амінокислотою і/або Хе є гідрофобною амінокислотою. На 13 приклад, ХА є гліцином або глутаміном, ХВ є треоніном або метіоніном, ХС є аспарагіном або триптофаном, ХD є триптофаном або гістидином і/або ХE є проліном або лейцином. Наприклад, CDR 3 містить суміжну амінокислотну послідовність GTGYNWFDP (Послідовність №62) або суміжну амінокислотну послідовність QMGYWHFDL (Послідовність №63). huCD3 антитіла включають каркасну ділянку 2 (FRW 2), що містить амінокислотну послідовність WVRQAPGKGLEWV (Послідовність №73). huCD3 антитіла включають каркасну ділянку З (FRW 3), що містить амінокислотну послідовність RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (Послідовність №74). Деякі huCD3 антитіла містять суміжну амінокислотну послідовність VTVSS (Послідовність №64) у положенні, що є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3). Наприклад, антитіло містить суміжну амінокислотну послідовність GTLVTVSS (Послідовність №65) у положенні, що є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3). Інші huCD3 антитіла містять суміжну амінокислотну послідовність WGRGTLVTVSS (Послідовність №66) у положенні, що є С-кінцевим відносно гіперваріабельної ділянки 3 (CDR 3). Залишок аргініну у Послідовності №66 є показаним, наприклад, у VH послідовностях huCD3 антитіла 28F11 (Послідовність №2) і huCD3 антитіла 23F10 (Послідовність №6). За іншим аспектом, винахід пропонує способи лікування, запобігання або полегшення симптому імунопатології шляхом введення суб'єкту huCD3 антитіла. За факультативним варіантом, суб'єкту додатково вводять другий препарат, наприклад (але без обмеження), протизапальні сполуки або імуносупресивні сполуки. Наприклад, суб'єктам, хворим на діабет типу І або латентний автоімунний діабет дорослих (LADA), також вводять другий препарат, наприклад, GLP-1 (глюкагоноподібний пептид) або сполуку, яка переводить бета-клітини у стан спокою (тобто сполуку, яка знижує або іншим чином пригнічує вивільнення інсуліну, наприклад, відкривачі калієвих каналів). До числа придатних сполук належить (але без обмеження) метотрексат, циклоспорин А (з включенням, наприклад, мікроемульсії циклоспорину), такролімус (tacrolimus), кортикостероїдні препарати, статини, бета-інтерферон, ремікад (Remicade (інфліксімаб (Infliximab)), енбрел (Enbrel (етанерцепт (Etanercept)) та гуміра (Humira (адалімумаб (Adalimumab)). Суб'єкт страждає на або є схильним до розвитку імунопатології, наприклад, автоімунного захворювання або запального захворювання. За іншим аспектом, цей винахід пропонує способи введення huCD3 антитіла за цим винаходом суб'єкту перед, під час та/або після трансплантації органа або тканини. Наприклад, huCD3 антитіло за цим винаходом застосовують для лікування або запобігання відторгнення органа або тканини після трансплантації. На Фіг.1 представлено ряд зображень нуклеотидної послідовності і амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок легких ланцюгів і варіа 94211 14 бельних ділянок важких ланцюгів huCD3 антитіла 28F11. На Фіг.1А представлена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга; на Фіг.ЇВ представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.1А, де гіперваріабельні ділянки виділені рамками. На Фіг.1С зображена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга; на Фіг.1D представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.1А, де гіперваріабельні ділянки виділені рамками. На Фіг.2 представлено ряд зображень нуклеотидної послідовності і амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок легких ланцюгів і варіабельних ділянок важких ланцюгів huCD3 антитіла 23F10. На Фіг.2А представлена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга; на Фіг.2В представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.2А. На Фіг.2С зображена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку легкого ланцюга; на Фіг.2D представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.2С. На Фіг.3 представлено ряд зображень нуклеотидної послідовності і амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок легких ланцюгів і варіабельних ділянок важких ланцюгів huCD3 антитіла 27Н5. На Фіг.3А представлена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга; на Фіг.3В представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.3А; на Фіг.3С зображені п'ять нуклеотидних послідовностей, які кодують варіабельну ділянку легкого ланцюга клону 27Н5; на Фіг.3D представлено п'ять амінокислотних послідовностей, закодованих нуклеотидними послідовностями, які показані на Фіг.3С; на Фіг.3Е представлено впорядковане розміщення п'яти легких ланцюгів клону 27Н5, де зірочка (*) у останньому рядку (поміченому KEY (ключ)) представляє консервативну амінокислоту у цьому стовпчику; двокрапка (:) у рядку KEY означає консервативну мутацію; типографський значок (.) у рядку KEY означає напівконсервативну мутацію. На Фіг.4 представлено ряд зображень нуклеотидної послідовності і амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок легких ланцюгів і варіабельних ділянок важких ланцюгів huCD3 антитіла 15С3, де на Фіг.4А представлена нуклеотидна послідовність, що кодує варіабельну ділянку важкого ланцюга; на Фіг.4В представлена амінокислотна послідовність, закодована нуклеотидною послідовністю, яка показана на Фіг.4А. На Фіг.4С представлені дві нуклеотидні послідовності, що кодують варіабельну ділянку легкого ланцюга клону 15С3; на Фіг.4D представлені дві амінокислотні послідовності, закодовані нуклеотидними послідовностями, які показані на Фіг.4С. Впорядковане розміщення, представлене на Фіг.5, відображає варіабельні ділянки важких ланцюгів huCD3 антитіл 15С3, 27Н5 та 28F11, а також послідовність зародкової лінії DP50, послідовність 15 людського J-фрагмента 5-02 важкого ланцюга і послідовність людського J-фрагмента 2 важкого ланцюга. Для кожної послідовності вказані гіперваріабельні ділянки. Впорядковане розміщення, представлене на Фіг.6, відображає варіабельні ділянки VIII huCD3 антитіл 15С3 (варіабельна ділянка 1 легкого ланцюга, тобто "VL1") та 28F11, а також послідовність зародкової лінії L6, послідовність людського Jфрагмента каппа 4 і послідовність людського Jфрагмента каппа 1. Для кожної послідовності вказані гіперваріабельні ділянки. Впорядковане розміщення, представлене на Фіг.7, відображає варіабельні ділянки VI VL2 huCD3 антитіл 15С3 (варіабельна ділянка 2 легкого ланцюга, тобто "VL2") та 27Н5, а також послідовність зародкової лінії L4/18a, послідовність людського J-фрагмента каппа 4 і послідовність людського J-фрагмента каппа 5. Для кожної послідовності вказані гіперваріабельні ділянки. Впорядковане розміщення, представлене на Фіг.8, відображає варіабельні ділянки VII VL1 huCD3 антитіла 27Н5 та DPK22, а також послідовність людського J-фрагмента каппа 5. Для кожної послідовності вказані гіперваріабельні ділянки. Графік, представлений на Фіг.9А, відображає зв'язування антитіл із молекулами CD3 на поверхні клітин лінії Jurkat із застосуванням різноманітних анти-СD3 антитіл, у тому числі huCD3 антитіл 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 та 15C3VL2 за цим винаходом. Графік, представлений на Фіг.9В, відображає здатність різноманітних антиСD3 антитіл, у тому числі huCD3 антитіл 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 та 15C3VL2 за цим винаходом, до пригнічення зв'язування мишачого анти-СD3 антитіла ОKТ3 з CD3-позитивними клітинами. Графік, представлений на Фіг.9С, відображає антигенну модуляцію CD3 та TcR з поверхні Т-клітин людської системи периферичного кровообігу різноманітними анти-СD3 антитілами, у тому числі huCD3 антитілами 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 та 15C3VL2 за цим винаходом. Графік, представлений на Фіг.9D, відображає ефект різноманітних анти-СD3 антитіл, у тому числі huCD3 антитіл 28F11, 27H5VL1, 27H5VL2, 15C3VL1 та 15C3VL2 за цим винаходом, на проліферацію Т-клітин. Ілюстрація на Фіг.10 представляє картину зв'язування повністю людського моноклонального антитіла 28F11 із набором пептидів, які одержали з амінокислотної послідовності ланцюга епсилон CD3. На Фіг.11 представлено ряд графіків, які відображають рівень вивільнення цитокінів у разі піддання впливу huCD3 антитіла дикого типу 28F11 (28F11WT), мутованого huCD3 антитіла 28F11, що має мутацію L234l235A234A235 (28F11AA) і мутованого huCD3 антитіла 28F11, що має мутацію 234 235 234 235 L L A E (28F11AE). Фіг.11А відображає рівень вивільнення альфа-TNF у разі піддання впливу цих антитіл; Фіг.11В відображає рівень вивільнення гамма-інтерферону. Цей винахід пропонує повністю людські моноклональні антитіла, специфічні проти ланцюга еп 94211 16 силон CD3 (CD3). Антитілами, які відповідно згадуються у цьому описі, є huCD3 антитіла. CD3 являє собою комплекс щонайменше п'яти мембранних поліпептидів зрілих Т-лімфоцитів, нековалентно зв'язаних між собою та з Тклітинним рецептором. CD3 комплекс включає гамма, дельта, епсилон, зета і ета ланцюги (які називають також субодиницями). Проти деяких із цих ланцюгів були одержані нелюдські моноклональні антитіла, прикладами яких є мишачі антитіла ОKТ3, SP34, UCHT1 або 64.1 (Дивись, наприклад, Джун (June) та інші, J. Immunol. 136:39453952 (1986); Янг (Yang) та інші, J. Immunol. 137:1097-1100 (1986); і Хейворд (Hayward) та інші, Immunol. 64:87-92 (1988)). huCD3 антитіла за цим винаходом одержали шляхом імунізації трансгенних мишей двох ліній, мишей лінії HuMab™ і мишей лінії KM™ (фірма Medarex, Princeton, штат Нью-Джерсі). huCD3 антитіла за цим винаходом мають одну або декілька з наведених нижче характеристик: згадане huCD3 антитіло зв'язується з СD3позитивними (CD3+) клітинами, але не з СD3негативними (CD3-) клітинами; huCD3 антитіло індукує антигенну модуляцію, яка включає зміни рівнів поверхневоклітинної експресії CD3 і Тклітинного рецептора (TcR); huCD3 антитіло пригнічує зв'язування мишачого анти-людського ОKТ3 моноклонального антитіла з Т-лімфоцитами. huCD3 антитіла за цим винаходом конкурують із мишачим анти-СD3 антитілом ОKТ3 за зв'язування з CD3, а піддання впливу huCD3 антитіла видаляє або маскує CD3 та/або TcR без негативного впливання на поверхневоклітинну експресію CD2, CD4 або CD8. Наслідком маскування CD3 та/або TcR є втрата або зниження активації Т-клітин. huCD3 антитіла за цим винаходом зв'язуються з CD3, який повністю або частково містить амінокислотні залишки від положення 27 до положення 43 епсилон-субодиниці процесованого людського CD3 (тобто без лідерної послідовності). Амінокислотна послідовність епсилон-субодиниці людського CD3 представлена номерами депонування GenBank NP 000724; ААА52295; Р07766; А32069; САА27516; та ААН49847. Наприклад, huCD3 антитіло зв'язує антигенну детермінанту CD3, яка повністю або частково містить амінокислотну послідовність EMGGITQTPYKVSISGT (Послідовність №67). Зразковим huCD3 моноклональним антитілом, що зв'язується з цією антигенною детермінантою, є антитіло 28F11, опис якого наведено. Антитіло 28F11 включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Послідовність №2), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №1, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (Послідовність №4), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №3 (Фігури 1А-1D). Амінокислоти, які входять до складу гіперваріабельних ділянок, як визначено Чотья (Chothia) та іншими, 1989, Е.А. Кебот (Е.А. Kabat) та іншими, 1991, нижче виділені рамками (дивись також Фіг.1В та Фіг.1D і Фіг.5 та Фіг.6). (Дивись Чотья К. (Chothia С.) та інші, Nature 342:877-883 (1989); Кебот Е.А. (Kabat Е.А.) та інші, Sequences of 17 94211 18 Proteins of Immunological Interest, 5-е видання, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Office (1991)). Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла 28F11 мають наведені нижче послідовності: GYGMH (Послідовність №27), VIWYDGSKKYYVDSVKG (Послідов ність №28) та QMGYWHFDL (Послідовність №29). Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла 28F11 мають наведені нижче послідовності: RASQSVSSYLA (Послідовність №30), DASNRAT (Послідовність №31) та QQRSNWPPLT (Послідовність №32). Антитіло 23F10 включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Послідовність №6), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №5, і варіабельну ділянку легкого ланцюга (Послідовність №8), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №7. Амінокислоти, які входять до складу гіперваріабельних ділянок, як визначено Чотья (Chothia) та іншими, 1989, Е.А. Кебот (Е.А. Kabat) та іншими, 1991, нижче виділені рамками (дивись також Фіг.2В, Фіг.2D). Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла 23F10 мають наведені нижче послідовності: GYGMH (Послідовність №27), VIWYDGSKKYYVDSVKG (Послідовність №28) та QMGYWHFDL (Послідовність №29). Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла 23F10 мають наведені нижче послідовності: RASQSVSSYLA (Послідовність №30), DASNRAT (Послідовність №31) та QQRSNWPPLT (Послідовність №32). 19 Антитіло 27Н5 включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Послідовність №10), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №9, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з-посеред амінокислотних послідовностей, представлених нижче Послідовностями №16-20, що кодуються нуклеїновокислотними послідовностями, які представлені Послідовностями №11-15. Як описано нижче у Прикладі 2, одна клональна гібридома, ® одержана від трансгенних мишей HuMAb , може продукувати численні легкі ланцюги для одного важкого ланцюга. Кожну комбінацію одержаних важких і легких ланцюгів випробують на оптимальне функціонування, як описано нижче у Прикладі 2. 94211 20 Амінокислоти, які входять до складу гіперваріабельних ділянок, як визначено Чотья (Chothia) та іншими, 1989, Е.А. Кебот (Е.А. Kabat) та іншими, 1991, нижче виділені рамками (дивись також Фіг.3В, Фіг.3D, Фіг.5 та Фіг.7-8). Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла 27Н5 мають наведені нижче послідовності: SYGMH (Послідовність №33), IIWYDGSKKNYADSVKG (Послідовність №34) та GTGYNWFDP (Послідовність №35). Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла 27Н5 мають наведені нижче послідовності: RASQSVSSSYLA (Послідовність №36); GASSRAT (Послідовність №37); QQYGSSPIT (Послідовність №38); RASQGISSALA (Послідовність №39); YASSLQS (Послідовність №40); QQYYSTLT (Послідовність №41); DASSLGS (Послідовність №42); та WASQGISSYLA (Послідовність №43). 21 Антитіло 15С3 включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (Послідовність №22), що кодується нуклеїновокислотною послідовністю, яка представлена нижче Послідовністю №21, і варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану зпосеред амінокислотних послідовностей, представлених нижче Послідовностями №25-26, що кодуються нуклеїновокислотними послідовностями, які представлені Послідовностями №23-24. Як описано нижче у Прикладі 2, одна клональна гібридома, одержана від трансгенних мишей HuMAb®, може продукувати численні легкі ланцюги для одного важкого ланцюга. Кожну комбінацію одержаних важких і легких ланцюгів випробують на оптимальне функціонування, як описано нижче у Прикладі 2. 94211 22 Амінокислоти, які входять до складу гіперваріабельної ділянки, як визначено Чотья (Chothia) та іншими, 1989, Е.А. Кебот (Е.А. Kabat) та іншими, 1991, нижче виділені рамками (дивись також Фіг.4В, Фіг.4D і Фіг.5-7). Гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга антитіла 15С3 мають наведені нижче послідовності: SYGMH (Послідовність №33), AIWYNGRKQDYADSVKG (Послідовність №44) та GTGYNWFDP (Послідовність №35). Гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга антитіла 15С3 мають наведені нижче послідовності: RASQSVSSYIA (Послідовність №30); DASNRAT (Послідовність №31); QQRSNWPWT (Послідовність №45); RASQGISSALA (Послідовність №39); DASSLES (Послідовність №46); QQFNSYPIT (Послідовність №47). 23 huCD3 антитіла за цим винаходом включають також антитіла, що містять амінокислотну послідовність варіабельної ділянки важкого ланцюга, яка є щонайменше на 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичною до амінокислотної послідовності, представленої Послідовністю №2, №6, №10 або №22 і/або амінокислотну послідовність варіабельної ділянки легкого ланцюга, яка є щонайменше на 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% або більше ідентичною до амінокислотної послідовності, представленої Послідовністю №4, №8, №16-20 або №25-26. За альтернативним варіантом, моноклональним антитілом є антитіло, що зв'язується з тією самою антигенною детермінантою, що і 28F11, 27Н5, 23F10 або 15С3. У разі відсутності іншого визначення, наукові і технічні терміни, застосовані у зв'язку з цим винаходом, будуть мати значення, які традиційно розуміються пересічними фахівцями у цій галузі. На додаток до цього, якщо іншого не потребує контекст, терміни у однині будуть включати множину, а терміни у множині будуть включати однину. Взагалі, термінологія, застосована у зв'язку з культурою клітин та тканин, молекулярною біологією і хімією білків та оліго- чи полінуклеотидів та гібридизацією і методами, опис яких наведено, являє собою термінологію, добре відому і широко засто 94211 24 совувану у цій галузі. Для одержання рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культивування і трансформації тканин застосовують стандартні методи (наприклад, електропорацію, ліпофекцію). Ферментативні реакції і методи очищення здійснюють за специфікаціями виробників або за традиційними методами, прийнятими у цій галузі чи описаними у цьому описі. Вищезгадані методи і процедури, як правило, здійснюють за традиційними методиками, добре відомими у цій галузі, опис яких наведено у численних загальних та більш специфічних матеріалах, на які посилаються і які обговорюються у цьому описі. Дивись, наприклад, Сембрук (Sambrook) та інші, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2-е видання, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Термінологія, вживана у зв'язку з аналітичною хімією, хімією органічного синтезу, медичною і фармацевтичною хімією та процедурами і методами, опис яких наведено, являє собою термінологію, добре відому і широко застосовувану у цій галузі. Для проведення хімічного синтезу, здійснення хімічних аналізів, виготовлення фармацевтичних препаратів, лікарських форм, їх доставки та лікування хворих застосовують стандартні методи. 25 Наведені нижче терміни, вживані у описі, якщо не вказано інше, повинні розумітися як такі, що мають наведені нижче значення. Термін "антитіло", що вживається у цьому описі, означає імуноглобулінові молекули та імунологічно активні частини імуноглобулінових (Ig) молекул, тобто молекул, що містять антигензв'язувальний центр, який специфічно зв'язує антиген (вступає у імунну реакцію з антигеном). Такі антитіла включають (але не обмежуються) поліклональні, моноклональні, химерні, одноланцюгові антитіла, Fab, Fab' та F(ab')2 фрагменти і бібліотеку експресованих послідовностей Fab. Словосполучення "специфічно зв'язує" або "вступає у імунну реакцію з" означає, що згадане антитіло реагує з однією або більше антигенними детермінантами бажаного антигену і не реагує (тобто не зв'язується) з іншими поліпептидами або зв'язується з іншими поліпептидами з набагато нижчою спорідненістю (Kd>10-6). Відомо, що основна структурна одиниця антитіла включає тетрамер. Кожен тетрамер складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, де кожна пара має один "легкий" ланцюг (приблизно 25кДа) і один "важкий" ланцюг (приблизно 50-70кДа). Амінокінцева частина кожного ланцюга включає варіабельну ділянку, що складається приблизно з 100-110 або більше амінокислот і яка є, головним чином, відповідальною за розпізнавання антигену. Карбоксикінцева частина кожного ланцюга має константну ділянку, яка, головним чином, відповідальна за ефекторну функцію. Людські легкі ланцюги класифікуються як каппа і ламбда легкі ланцюги. Важкі ланцюги класифікуються як мю, дельта, гамма, альфа або епсилон, і визначають ізотип антитіла як IgM, IgD, IgA та IgE, відповідно. У межах легких і важких ланцюгів варіабельні і константні ділянки сполучаються "J"фрагментом, що містить приблизно 12 або більше амінокислот, причому важкий ланцюг включає також "D''-ділянку, яка складається приблизно з 10 або більше амінокислот. Дивись, взагалі, Fundamental Immunology, розділ 7 (Пол В. (Paul W.) та інші, 2-е видання, Raven Press, N.Y. (1989)). Варіабельні ділянки кожної пари легкий/важкий ланцюг утворюють антигензв'язувальний центр антитіла. Термін "моноклональне антитіло" (Mab) або словосполучення "композиція, що містить моноклональне антитіло", які вживається у цьому описі, означає популяцію молекул антитіл, яка включає молекули антитіл лише одного різновиду, що являють собою специфічний продукт гена легкого ланцюга і специфічний продукт гена важкого ланцюга. Зокрема, гіперваріабельні ділянки (CDR) моноклонального антитіла є ідентичними в усіх молекул згаданої популяції. Моноклональні антитіла містять антигензв'язувальний центр, здатний до вступу у імунну реакцію з конкретною антигенною детермінантою антигену, який характеризується специфічною зв'язувальною спорідненістю до неї. Взагалі, молекули антитіл, одержані від людей, належать до будь-якого з класів IgG, IgM, IgA, IgE та IgD, які відрізняються один від одного при 94211 26 родою важкого ланцюга, присутнього у молекулі. Певні класи мають також підкласи, наприклад, IgG1, IgG2 тощо. На додаток до цього, легкий ланцюг у людей може бути каппа-ланцюгом або ламбда-ланцюгом. Термін "антигензв'язувальний центр" або "зв'язувальна ділянка" означає частину молекули імуноглобуліну, яка приймає участь у зв'язуванні антигену. Антигензв'язувальний центр утворюється амінокислотними залишками N-кінцевих варіабельних ("V") ділянок важких ("Н") і легких ("L") ланцюгів. Три надзвичайно дивергентні фрагменти у межах V ділянок важких і легких ланцюгів, які називають "гіперваріабельними ділянками", знаходяться між більш консервативними фланкуючими фрагментами, відомими як "каркасні ділянки" або "FRs". Так, термін "каркасна ділянка" означає амінокислотні послідовності, які, за природних умов, знаходяться у імуноглобулінів між гіперваріабельними ділянками і є прилеглими до них. У молекулі антитіла три гіперваріабельні ділянки легкого ланцюга і три гіперваріабельні ділянки важкого ланцюга позиціонуються одна відносно іншої у тривимірному просторі з утворенням антигензв'язувальної поверхні. Згадана антигензв'язувальна поверхня є комплементарною до тривимірної поверхні зв'язаного антигену, і згадані три гіперваріабельні ділянки кожного з важких і легких ланцюгів називають "гіперваріабельними ділянками" або "hv-ділянками". Розподіл амінокислот до кожного домену відповідає визначенням, наведеним у роботі Кебот (Kabat), Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, штат Меріленд (1987 та 1991) або Чотья (Chothia), Леек (Lesk), J. МоI. Вiol. 196:901-917 (1987), Чотья (Chothia) та інші, Nature 342:878-883 (1989). Термін "антигенна детермінанта", що вживається у цьому описі, включає будь-яку білкову детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном, scFv або Т-клітинним рецептором. Термін "антигенна детермінанта" включає будь-яку білкову детермінанту, здатну до специфічного зв'язування з імуноглобуліном або Тклітинним рецептором. Антигенні детермінанти, як правило, включають хімічно активні поверхневі групування молекул, наприклад, бічних ланцюгів амінокислот або цукрів, і, як правило, мають специфічні об'ємні структурні характеристики, а також специфічні зарядні характеристики. Кажуть, що антитіло специфічно зв'язує антиген, коли константа дисоціації ≤1мкМ; відповідно до варіанта, якому віддається перевага, ≤100нМ і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, ≤10нМ. Словосполучення "імунологічне зв'язування" та "властивості імунологічного зв'язування", які вживається у цьому описі, означає нековалентні взаємодії того типу, що відбуваються між молекулою імуноглобуліну і антигеном, відносно якого згаданий імуноглобулін є специфічним. Сила або афінність взаємодій імунологічного зв'язування може виражатись через константу дисоціації (Kd) взаємодії, де менше значення Kd представляє більшу афінність. Кількісне визначення властивос 27 тей імунологічного зв'язування вибраних поліпептидів здійснюють за методами, добре відомими у цій галузі. Один із таких методів включає визначення швидкості утворення і дисоціації комплексу антигензв'язувального центра/антигену, де згадана швидкість залежить від концентрації партнерів комплексу, афінності взаємодії та геометричних параметрів, які рівною мірою впливають на згадану швидкість у обох напрямках. Таким чином, як "константа асоціації" (Kon), так і "константа дисоціації" (Κoff) може бути визначена шляхом обчислення концентрацій і фактичної швидкості асоціації і дисоціації (Дивись Nature 361:186-87 (1993)). Відношення (Koff)/(Kon) надає можливість скорочення усіх параметрів, не пов'язаних з афінністю, і дорівнює константі дисоціації (Kd). (Дивись, взагалі, Дейвіс (Davies) та інші, (1990), Annual Rev. Biochem., 59:439-473). Кажуть, що антитіло за цим винаходом специфічно зв'язується з антигенною детермінантою CD3, коли константа зв'язування у стані рівноваги (Kd) доршнює ≤1мкМ, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, ≤100нМ, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, ≤10нМ і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, від ≤100пМ до приблизно 1пМ, за визначенням за допомогою таких аналізів, як аналіз зв'язування лігандів, мічених радіоактивним ізотопом, або подібних аналізів, відомих фахівцям у цій галузі. Фахівці у цій галузі визнають можливість визначення, без зайвого експериментування, того, чи має людське моноклональне антитіло таку саму специфічність, що і людське моноклональне антитіло за цим винаходом (наприклад, моноклональне антитіло 28F11, 27Н5, 23F10 або 15С3) шляхом встановлення, чи перешкоджає перше згадане зв'язуванню другого з антигенним поліпептидом CD3. Якщо людське моноклональне антитіло, яке піддають перевірці, конкурує з людським моноклональним антитілом за цим винаходом, як показано зменшенням зв'язування людським моноклональним антитілом за цим винаходом, у такому разі два моноклональні антитіла зв'язуються з однією і тією самою або тісно спорідненою антигенною детермінантою. Інший спосіб визначення, чи має людське моноклональне антитіло специфічність людського моноклонального антитіла за цим винаходом, полягає у попередньому інкубуванні людського моноклонального антитіла за цим винаходом з антигенним поліпептидом CD3, з яким воно, за нормальних умов, вступає у реакцію, з подальшим доданням людського моноклонального антитіла, яке піддають перевірці, для визначення того, чи пригнічується здатність людського моноклонального антитіла, яке піддають перевірці, до зв'язування антигенного поліпептиду CD3. У разі, якщо людське моноклональне антитіло, яке піддають перевірці, пригнічується, тоді, з усією ймовірністю, воно має таку саму або функціонально еквівалентну специфічність антигенної детермінанти, що і моноклональне антитіло за цим винаходом. Різні методи, відомі у цій галузі, застосовують для продукування моноклональних антитіл, спрямованих проти білка, наприклад, білка CD3, або проти його похідних, фрагментів, аналогів, гомоло 94211 28 гів або ортологів. (Дивись, наприклад, довідник Antibodies: A Laboratory Manual, Харлоу Ε. (Harlow E.), Лейн Д. (Lane D.), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, який включено до цього опису шляхом посилання). Повністю людськими антитілами є молекули антитіл, у яких повна послідовність як легкого, так і важкого ланцюгів, з включенням гіперваріабельних ділянок, походить від людських генів. Такі антитіла у цьому описі називають "людськими антитілами" або "повністю людськими антитілами". Людські моноклональні антитіла одержують, наприклад, за допомогою методів, опис яких наведено нижче у Прикладі 1. Людські моноклональні антитіла можна також одержати за допомогою методу тріом; методу одержання гібридом людських В-клітин (дивись, Козбор (Kozbor) та інші, 1983, Immunol. Today, 4:72) та методу одержання гібридом EBV (вірус Епштейн-Барра) для продукування людських моноклональних антитіл (дивись Коул (Cole) та інші, 1985; У: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., cтop.77-96). Людські моноклональні антитіла можуть застосовуватись і можуть продукуватись за допомогою людських гібридом (дивись, Коут (Cote) та інші, 1983, Рrос. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026-2030) або шляхом трансформування людських В-клітин вірусом Епштейн-Барра in vitro (дивись Коул (Cole) та інші, 1985; У: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., стор.77-96). Антитіла очищають за допомогою добре відомих методів, наприклад, афінної хроматографії, із застосуванням білка А або білка G, яка забезпечує одержання, головним чином, фракції IgG імунної сироватки. У подальшому, або за альтернативним варіантом, специфічний антиген, який є метою пошуку імуноглобулінів, або його антигенна детермінанта, можуть іммобілізуватись на колонці для очищення імуноспецифічного антитіла засобами імуноафінної хроматографії. Очищення імуноглобулінів обговорюється, наприклад, Д. Уілкінсоном (D. Wilkinson) (The Scientist, опубліковано фірмою The Scientist, Inc., Philadelphia, штат Пенсільванія, том 14, №8 (17 квітня 2000 року), стор.25-28). Бажано модифікувати антитіло за цим винаходом щодо ефекторної функції для підсилення, наприклад, ефективності згаданого антитіла при лікування імунопатологій. Наприклад, залишок(-ки) цистеїну можуть вводитись до Fc-ділянки, із забезпеченням, тим самим, утворення міжланцюгових дисульфідних зв'язків на цій ділянці. Гомодимерне антитіло, яке одержують таким чином, може мати поліпшену здатність до інтерналізації та/або підвищену комплементопосередковану лізисну і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). (Дивись, Карон (Сагоп) та інші, J. Exp. Med., 176:1191-1195 (1992) та Шопс (Shopes), J. Immunol, 148: 2918-2922 (1992)). За альтернативним варіантом, можна створити антитіло, яке має дві Fc-ділянки і може, завдяки цьому, мати посилену комплементопосередковану лізисну і антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC). (Дивись, Стівенсон (Stevenson) та інші, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)). 29 Цей винахід включає також Fv, Fab Fab' та F(ab')2 фрагменти huCD3, одноланцюгові huCD3 антитіла, біспецифічні huCD3 антитіла і гетерокон'юговані huCD3 антитіла. Біспецифічними антитілами є антитіла, які мають зв'язувальні специфічності щонайменше до двох різних антигенів. У цьому разі, однією зі зв'язувальних специфічностей є зв'язувальна специфічність до CD3. Другою зв'язувальною мішенню є будь-який другий антиген і, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, поверхневий мембранний білок або рецептор чи субодиниця рецептора. Способи одержання біспецифічних антитіл є відомими у цій галузі. Традиційно, основу рекомбінантного продукування біспецифічних антитіл становить коекспресія двох пар імуноглобулінових (важкого/легкого) ланцюгів, де два важкі ланцюги мають різні специфічності (Мільштейн (Milstein), Куельо (Cuello), Nature, 305:537-539 (1983)). Завдяки довільному аранжуванню важких і легких імуноглобулінових ланцюгів, ці гібридоми (квадроми) продукують потенційну суміш десяти різних молекул антитіл, лише одна з яких має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильної молекули здійснюють, як правило, засобами афінної хроматографії. Подібні методи розкривають у WO 93/08829, опублікованій 13 травня 1993 року, та у роботі Траунекер (Traunecker) та інших, ЕМВО J., 10:3655-3659 (1991). Варіабельні домени антитіла з бажаними специфічностями зв'язування (антигензв'язувальні центри антитіла) можуть лігуватись з послідовностями константних доменів імуноглобуліну. Літування, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, відбувається з константним доменом важкого ланцюга v імуноглобуліну, що містить щонайменше частину шарнірних ділянок СН2 і СН3. Перевага віддається тому, щоб під час щонайменше одного лігування мати першу константу ділянку (СН1) важкого ланцюга, що містить сайт, необхідний для зв'язування легкого ланцюга. ДНК, що кодують лігування важкого ланцюга імуноглобуліну і, у разі необхідності, легкого ланцюга імуноглобуліну, вводять до окремих векторів експресії і котрансфікують до відповідного організму-хазяїна. Додаткові подробиці одержання біспецифічних антитіл дивись, наприклад, у роботі Суреш (Suresh) та інші, Methods in Enzymology, 121:210 (1986). За іншим варіантом підходу, опис якого наведено у WO 96/27011, поверхня розділу між парою молекул антитіл може розроблятись таким чином, щоб збільшити до максимального рівня відсоток гетеродимерів, які одержують з культури рекомбінантних клітин. Поверхня розділу, якій віддають перевагу, містить щонайменше частину ділянки СН3 константного домену антитіла. Подібним чином, один або декілька невеликих бічних ланцюгів амінокислот із поверхні розділу молекули першого антитіла замінюють на більші бічні ланцюги (наприклад, тирозин або триптофан). Компенсаторні "порожнини" ідентичного розміру або за розміром подібні великому(-им) бічному(-им) ланцюга(-ам) утворюють на поверхні розділу молекули другого 94211 30 антитіла шляхом заміни великих бічних ланцюгів амінокислоти на менші (наприклад, аланін або треонін). Цим забезпечується механізм підвищення виходу гетеродимеру, порівняно з іншими небажаними кінцевими продуктами, наприклад, гомодимерами. Біспецифічні антитіла можуть одержуватись як непроцесовані антитіла або фрагменти антитіл (наприклад, F(ab')2 біспецифічні антитіла). Способи одержання біспецифічних антитіл із фрагментів антитіл були описані у літературі. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть бути одержані за допомогою хімічного зв'язування. Бреннан (Brennan) та інші, Science, 229:81 (1985), описує метод, за яким інтактні антитіла піддають протеолітичному розщепленню з одержанням F(аb')2-фрагментів. Ці фрагменти відновлюють у присутності дитіолового комплексоутворювального агента, арсеніту натрію, для стабілізації сусідніх дитіолів і запобігання утворенню міжмолекулярних дисульфідних зв'язків. Після цього одержані Fab'-фрагменти перетворюють на похідні тіонітробензоату (TNB). Після цього одну з похідних Fab'-TNB повторно перетворюють на Fab'-тіол шляхом відновлення за допомогою меркаптоетиламіну і змішують з еквімолярною кількістю іншої похідної Fab'-TNB з одержанням біспецифічного антитіла. Одержані біспецифічні антитіла можуть застосовуватись як агенти для вибіркової іммобілізації ферментів. На додаток до цього, Fab'-фрагменти можуть безпосередньо виділятись з Е. соlі і хімічним шляхом сполучатись з одержанням біспецифічних антитіл. Шалабі (Shalaby) та інші, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992), описує продукування молекули F(ab')2 повністю гуманізованого біспецифічного антитіла. Кожен Fab'-фрагмент нарізно секретувався з Е. соlі, і його піддавали безпосередньому хімічному сполученню in vitro з одержанням біспецифічного антитіла. Одержане таким чином біспецифічне антитіло було здатним до зв'язування з клітинами, що надекспресували рецептор ЕrbВ2, і нормальними людськими Т-клітинами, а також до ініціювання літичної активності людських цитотоксичних лімфоцитів проти мішеней, роль яких відігравали пухлини молочної залози людей. Були описані також різні способи одержання і виділення фрагментів біспецифічних антитіл безпосередньо з культури рекомбінантних клітин, наприклад, біспецифічні антитіла продукують із застосуванням лейцинових лінкерів (Костельні (Kostelny) та інші, J. Immunol, 148 (5):1547-1553 (1992)). Лейцинові лінкерні пептиди з білків Fos і Jun літували до Fab'-частин двох різних антитіл шляхом злиття генів. Гомодимери антитіл відновлювали на шарнірній ділянці до мономерів з подальшим поновним окисненням з одержанням гетеродимерів антитіл. Цей спосіб може також застосовуватись для продукування гомодимерів антитіл. Метод "половинчастого антитіла", описаний Холлінгер (Hollinger) та іншими, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), надає альтернативний механізм одержання фрагментів біспецифічних антитіл. Фрагменти містять варіабельний домен важкого ланцюга (VH), сполучений з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) лінкером, 31 який є занадто коротким для того, щоб уможливити утворення пар між двома доменами на одному й тому самому ланцюзі. Відповідно, домени VH і VL одного фрагмента примушені утворювати пари з комплементарними доменами VL і VH іншого фрагмента, з одержанням завдяки цьому двох антигензв'язувальних центрів. Повідомляли також про іншу стратегію одержання фрагментів біспецифічних антитіл шляхом застосування одноланцюгових Fv (sFv) димерів. Дивись Грубер (Gruber) та інші, J. Immunol, 152:5368 (1994). Передбачаються антитіла більше ніж із двома валентностями. Наприклад, можуть бути одержані триспецифічні антитіла. Тутт (Tutt) та інші, J. Immunol, 147:60 (1991). Типові біспецифічні антитіла можуть зв'язуватись із двома різними антигенними детермінантами, щонайменше одна з яких походить із білкового антигену за цими винаходом. За альтернативним варіантом, антиантигенне плече молекули імуноглобуліну може комбінуватись із плечем, яке зв'язується з ініціювальною молекулою на лейкоциті, наприклад, молекулою Т-клітинного рецептора (наприклад, CD2, CD3, CD28 або В7) або Fcрецепторами IgG (FcR), наприклад, FcRl (CD64), FcRII (CD32) та FcRIII (CD 16), таким чином, щоб зосередити клітинні захисні механізми на клітині, що експресує конкретний антиген. Біспецифічні антитіла можуть також застосовуватись для спрямування цитотоксичних агентів на клітини, що експресують конкретний антиген. Ці антитіла мають антигензв'язувальне плече і плече, яке зв'язує цитотоксичний агент або радіонуклідний хелатор, наприклад, EOTUBE, DPTA, DOTA або ТЕТА. Інше біспецифічне антитіло, яке становить інтерес, зв'язує білковий антиген, опис якого наведено, і додатково зв'язує тканинну тромбокіназу (TF). Гетерокон'юговані антитіла також входять до обсягу цього винаходу. Гетерокон'юговані антитіла складаються з двох ковалентно сполучених антитіл. Такі антитіла були, наприклад, запропоновані для спрямовування клітин імунної системи проти небажаних клітин (патент США №4,676,980) та для лікування ВІЛ-інфекції (WO 91/00360; WO 92/200373; ЕР 03089). Передбачається, що згадані антитіла можуть бути одержані in vitro за допомогою відомих способів хімії синтезу білків, у тому числі способів, що залучають агенти зшивання. Наприклад, імунотоксини можуть конструюватись із застосуванням реакції обміну дисульфідних зв'язків або шляхом утворення тіоефірного зв'язку. Прикладами придатних для цієї мети реактивів є імінотіолат і метил-4-меркаптобутирімідат, а також реактиви, розкриті, наприклад, у патенті США №4,676,980. Цей винахід має також відношення до імунокон'югатів, які являють собою антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом, наприклад, токсином (наприклад, ферментативно активним токсином бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження чи їх фрагментами) або радіоактивним ізотопом (тобто радіокон'югат). Ферментативно активні токсини і їхні фрагменти, які можуть застосовуватись, включають А ланцюг дифтерійного токсину, незв'язувальні активні 94211 32 фрагменти дифтерійного токсину, А ланцюг екзотоксину (з Pseudomonas aeruginosa), А ланцюг рицину, А ланцюг абрину, А ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, білки діантину, білки Phytolaca атегісапа (РАРІ, РАРll та PAP-S), інгібітор Momordica charantia, курцин, кротин, інгібітор Sapaonaria qfficinalis, гелонін, мітогеллін, рестриктоцин, феноміцин, еноміцин та трикотецени. Для продукування радіокон'югованих антитіл доступними є різноманітні радіонукліди. Прикладами є 212 Ві, 131І, 131In, 90Y та 186Re. Кон'югати антитіла і цитотоксичного агента одержують за допомогою різноманітних біфункціональних білоксполучних агентів, наприклад, Nсукцинімідил-3-(2-піридилдитіол)пропіонату (SPDP), імінотіолану (IT), біфункціональних похідних складних імідоефірів (наприклад, моногідрохлориду диметиладипімідату), активних складних ефірів (наприклад, дисукцинімідилсуберату), альдегідів (наприклад, глутаральдегіду), бісазидосполук (наприклад, біс-(nазидобензоїл)гександіаміну), похідних біс-діазонію (наприклад, біс-(n-діазонійбензоїл)етилендіаміну), діізоціанатів (наприклад, толуол-2,6-діізоціанату) та біс-активних сполук фтору (наприклад, 1,5дифтор-2,4-динітробензолу). Наприклад, рициновий імунотоксин можна одержати, як описано у Вітетта (Vitetta) та інші, Science, 238:1098 (1987) Мічена вуглецем-14 1-ізотіоціанатобензил-3метилдіетилентриамінпентаоцтова кислота (MXDTPA) є зразковим хелатоутворювачем для кон'югування радіонуклеотиду з антитілом. (Дивись WO 94/11026). Пересічним фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що велика кількість можливих складових може сполучатись з одержаними антитілами або з іншими молекулами за цим винаходом. (Дивись, наприклад, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, Дж.М. Круз (J.M. Cruse) та Р.Е.Льюїс-молодший (R.E. Lewis, Jr.) (редактори), Carger Press, New York (1989), яку у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання). Сполучення здійснюють за допомогою будьякої хімічної реакції, яка буде з'єднувати дві молекули доти, доки антитіло і інша складова зберігають свої відповідні активності. Цей зв'язок може включати багато хімічних механізмів, наприклад, ковалентне зв'язування, афінне зв'язування, інтеркаляцію, ковалентне зв'язування і комплексоутворювання. Переважним видом зв'язку є, однак, ковалентне зв'язування. Ковалентне зв'язування забезпечується або безпосереднім конденсуванням існуючих бічних ланцюгів, або включенням зовнішніх місткових молекул. Багато бівалентних або полівалентних зв'язувальних агентів є придатними для сполучення білкових молекул, наприклад, антитіл за цим винаходом, з іншими молекулами. Наприклад, репрезентативними сполучними агентами можуть бути такі органічні сполуки, як тіоефіри, карбодііміди, складні сукцинімідні ефіри, діізоціанати, глутаральдегід, діазобензоли і гексаметилендіаміни. Цей перелік не вважається вичерпним для сполучних агентів різних класів, відомих у цій галузі, а, скоріше, являє собою приклад 33 більш поширених сполучних агентів. (Дивись Кіллен (Killen) та Ліндстром (Lindstrom), Jour. Immun., 133:1335-2549 (1984); Янсен (Jansen) та інші, Immunological Reviews 62:185-216 (1982); Вітетта (Vitetta) та інші, Science 238:1098 (1987)). Лінкери, яким віддається перевага, описані у літературі. (Дивись, наприклад, Рамакрішнан С (Ramakrishnan S.) та інші, Cancer Res., 44:201-208 (1984), який описує застосування MBS (М-малеімідобензоїл-Nгідроксисукцинімідного ефіру). Дивись також патент США №5,030,719, який описує застосування галогенізованої похідної ацетилгідразиду, сполученої з антитілом за допомогою олігопептидного лінкера). До числа лінкерів, яким віддається особлива перевага, належать: (і) EDC (1-етил-3-(3диметиламінопропіл)карбодііміду гідрохлорид; (іі) SMPT (4-сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метилальфа-(2-піридиддитіо)толуол) (фірма Pierce Chem. Co., номер за каталогом (21558G); (ііі) SPDP (сукцинімідил-6-[3-(2піридиддитю)пропіонамідо]гексаноат (фірма Pierce Chem. Co., номер за каталогом 21651G); (iv) сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинімідил-6[3-(2піридиддитіо)пропіонамідо]гексаноат] (фірма Pierce Chem. Co., номер за каталогом 2165-G); та (ν) сульфо-NHS (N-гідроксисульфосукцинімід; фірма Pierce Chem. Co., номер за каталогом 24510), кон'югований з EDC. Лінкери, опис яких наведено вище, містять складові, що мають різні невід'ємні властивості, наслідком чого є одержання кон'югатів із різними фізико-хімічними властивостями. Наприклад, складні ефіри сульфо-NHS алкілкарбоксилатів є більш стійкими, аніж складні ефіри сульфо-NHS ароматичних карбоксилатів. Складні ефіри NHS, що містять лінкери, є менш розчинними, аніж складні ефіри сульфо-NHS. На додаток до цього, лінкер SMPT містить стерично утруднений дисульфідний зв'язок і може утворювати кон'югати з підвищеною стабільністю. Дисульфідні зв'язки, у цілому, є менш стабільними, аніж інші зв'язки, оскільки дисульфідний зв'язок розщеплюється in vitro, унаслідок чого він є менш доступним для кон'югування. Сульфо-NHS, зокрема, може підвищувати стабільність карбодіімідних зв'язків. Карбодіімідні зв'язки (наприклад, EDC), у разі застосування у сполученні із сульфо-NHS, утворюють складні ефіри, які є більш стійкими до гідролізу, аніж сама реакція карбодіімідного сполучення. Термін "виділений полінуклеотид", що вживається у цьому описі, означає полінуклеотид геномного, кДНК або синтетичного походження чи деякі його комбінації, де згаданий "виділений полінуклеотид", унаслідок свого походження, (1) не асоціюється з цілим або частиною полінуклеотиду, у якому "виділений полінуклеотид" знаходиться за природних умов, (2) є функціонально зв'язаним із полінуклеотидом, з яким він не є зв'язаним за природних умов, або (3) не зустрічається у природі, як частина більшої послідовності. Термін "виділений білок", який згадується у цьому описі, означає білок кДНК, рекомбінантної РНК або синтетичного походження чи деякі його комбінації, де згаданий "виділений білок", унаслідок свого походження або джерела одержання, (1) 94211 34 не асоціюється з природними білками, (2) є вільним від інших білків з того самого джерела, наприклад, є вільним від мишачих білків, (3) експресується клітиною іншого виду, або (4) не зустрічається у природі. Термін "поліпептид" застосовується у цьому описі як узагальнюючий термін для означення нативного білка, фрагменгів або аналогів послідовності поліпептиду. Так, фрагменти нативного білка і аналоги є видами роду поліпептидів. Поліпептиди, яким віддається перевага за цим винаходом, включають важкі ланцюги молекул людського імуноглобуліну, представлені на Фіг.1В, Фіг.2В, Фіг.3В і Фіг.4В та легкі ланцюги молекул людського імуноглобуліну, представлені на Фіг.1D, Фіг.2D, Фіг.3D і Фіг.4D, а також молекули антитіл, які одержали шляхом комбінацій, що містять важкі ланцюги молекул імуноглобуліну з легкими ланцюгами молекул імуноглобуліну, наприклад, каппа легкі ланцюги молекул імуноглобуліну і навпаки, а також їхні фрагменти і аналоги. Термін "природний", що вживається у цьому описі у разі посилання на об'єкт, означає, що цей об'єкт може бути знайденим у природі. Наприклад, поліпептидна або полінуклеотидна послідовність, присутня у організмі (у тому числі віруси), що може бути виділена з джерела у природі і не була умисно модифікована людиною у лабораторії або якимсь іншим чином, є природною. Термін "функціонально зв'язаний", що вживається у цьому описі, означає положення подібним чином описаних компонентів, що знаходяться у взаємозв'язку, який надає їм можливість функціонування призначеним їм способом. Регулярна послідовність, "функціонально зв'язана" з кодувальною послідовністю, є лігованою таким чином, що експресія кодувальної послідовності забезпечується за умов, сумісних зі згаданою регулярною послідовністю. Термін "регулярна послідовність", що вживається у цьому описі, означає полінуклеотидні послідовності, які є необхідними для здійснення експресії та процесування кодувальних послідовностей, з якими вони є лігованими. Природа таких регулярних послідовностей різниться у залежності від організму-хазяїна. У прокаріотів такі регулярні послідовності, як правило, включають промотор, центр зв'язування рибосом і термінатор транскрипції; у еукаріотів, як правило, такі регулярні послідовності включать промотори і термінатор транскрипції. Термін "регулярні послідовності" включає, як мінімум, усі складові, присутність яких є обов'язковою для експресії і процесування і може також включати додаткові складові, присутність яких є бажаною, наприклад, лідерні послідовності і послідовності партнера гібридизації. Термін "полінуклеотид", що вживається у цьому описі, означає полімерну сполуку, утворену залишками монокуклеотидів, довжиною щонайменше 10 основ, які є рибонуклеотидами або дезоксинуклеотидами чи модифікованою формою нуклеотиду будь-якого типу. Згаданий термін включає однониткові і двониткові форми ДНК. Термін "олігонуклеотид", що вживається у цьому описі, включає природні і модифіковані нук 35 леотиди, зв'язані разом природними і штучними олігонуклеотидними зв'язками. Олігонуклеотиди являють собою підгрупу полінуклеотидІв, довжина яких, як правило, становить 200 основ або менше. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, довжина олігонуклеотидів становить від 10 основ до 60 основ, а відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, вони мають у довжину 12 основ, 13 основ, 14 основ, 15 основ, 16 основ, 17 основ, 18 основ, 19 основ або від 20 основ до 40 основ. Олігонуклеотиди є, як правило, одноланцюговими, наприклад, для зондів, хоча олігонуклеотиди можуть бути і дволанцюговими, наприклад, для застосування при конструюванні гена-мутанту. Олігонуклеотиди за цим винаходом є смисловими або антисмисловими олігонуклеотидами. Термін "природні нуклеотиди", що вживається у цьому описі, включає дезоксирибонуклеотиди і рибонуклеотиди. Термін "модифіковані нуклеотиди", що вживається у цьому описі, включає нуклеотиди з модифікованими або заміненими цукровими групами тощо. Термін "олігонуклеотидні зв'язки", що вживається у цьому описі, включає олігонуклеотидні зв'язки, наприклад, фосфоротіоат, фосфородитіоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанілотіоат, фосфораніладат, фосфороімідат тощо. Дивись, наприклад, Лапланш (LaPlanche) та інші, Nucl. Acids Res., 14:9081 (1986); Стек (Stec) та інші, J. Am. Chem. Soc, 106:6077 (1984), Стейн (Stein) та інші, Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988), Зон (Zon) та інші, Anti Cancer Drug Design, 6:539 (1991); Зон (Zon) та інші, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, стор.87-108-(під редакцією Ф. Екстейн (F. Eckstein), Oxford University Press, Oxford England (1991); Стек (Stec) та інші, патент США №5,151,510; Ульман (Uhlmann), Пейман (Peyman), Chemical Reviews, 90:543 (1990). Олігонуклеотид може включати мітку для виявлення, у разі необхідності. Термін "вибірково гібридизуватись", що вживається у цьому описі, означає "з можливістю виявлення" і "специфічно зв'язуватись". Полінуклеотиди, олігонуклеотиди і їхні фрагменти, за цим винаходом, вибірково гібридизуються з нуклеїновокислотними ланцюгами за умов гібридизації і промивання, які зводять до мінімуму суттєву кількість зв'язування, що піддається виявленню, з неспецифічними нуклеїновими кислотами. Суворі умови можуть застосовуватись для забезпечення умов вибіркової гібридизації, які є відомими у цій галузі і обговорюються у цьому описі. Взагалі, гомологія нуклеїновокислотних послідовностей між полінуклеотидами, олігонуклеотидами та фрагментами за цим винаходом і нуклеїновокислотною послідовністю, яка становить інтерес, буде досягати щонайменше 80%, а за більш типовим варіантом, якому віддають перевагу, ступінь гомології буде підвищуватись щонайменше до рівня 85%, 90%, 95%, 99% і 100%. Дві амінокислотні послідовності є гомологічними, якщо між цими послідовностями існує часткова або повна ідентичність. Наприклад, 85% гомологія означає, що 85% амінокислот є ідентичними, коли дві послідовності впо 94211 36 рядковано розміщують для максимальної сумісності. Двониткові розриви (у будь-якій з двох послідовностей, які суміщують) є припустимими, причому перевага віддається максимальній кількості довжин розривів для суміщення, яка дорівнює 5 або менше, і більша перевага віддається 2 або менше. За альтернативним варіантом, якому віддається перевага, дві білкові послідовності (або поліпептидні послідовності, одержані з них, довжиною щонайменше у 30 амінокислот) є гомологічними, у тому значенні, у якому цей термін вживається у цьому описі, якщо їх оцінка вирівнювання у балах перевищує 5 (у стандартних одиницях відхилення), у разі застосування програми ALIGN із картою мутаційних даних і штрафними балами за двонитковий розрив 6 або більше. Дивись Дейхоф М.О. (Dayhoff M.O.) у Atlas of Protein Sequence and Structure, стор.101-110 (том 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) і Додаток 2 до цього тому, стор.1-10. Дві послідовності або їхні частини, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, є гомологічними, якщо ідентичність їхніх амінокислот, у разі оптимального вирівнювання із застосуванням програми ALIGN, перевищує або дорівнює 50%. Термін "відповідає", що вживається у цьому описі, означає, що полінуклеотидна послідовність є гомологічною (тобто є ідентичною, не суворо еволюційно спорідненою) усій або частині еталонної полінуклеотидної послідовності, або що поліпептидна послідовність є ідентичною еталонній поліпептидній послідовності. У протилежність до цього, термін "комплементарний", що вживається у цьому описі, означає, що комплементарна послідовність є гомологічною цілій або частині еталонної полінуклеотидної послідовності. Для ілюстрації, нуклеотидна послідовність "ТАТАС" відповідає еталонній послідовності "ТАТАС" і є комплементарною еталонній послідовності "GTATA". Наведені нижче терміни вживають для опису взаємозв'язків послідовностей між двома або декількома полінуклеотидними або амінокислотними послідовностями: "еталонна послідовність", "порівняльне вікно", "ідентичність послідовностей", "відсоток ідентичності послідовностей" та "суттєва ідентичність". "Еталонною послідовністю" є визначена послідовність, що вживається як основа для порівняння послідовностей. Еталонна послідовність може бути підгрупою більшої послідовності, наприклад, як сегмент непроцесованої кДНК або послідовності гена, наведеної у лістингу послідовностей, або може являти собою повну кДНК чи послідовність гена. Взагалі, еталонна послідовність має щонайменше 18 нуклеотидів або 6 амінокислот у довжину, часто щонайменше 24 нуклеотиди або 8 амінокислот і часто щонайменше 48 нуклеотидів або 16 амінокислот у довжину. Оскільки з двох полінуклеотидів або амінокислотних послідовностей кожен(-на) може (1) включати послідовність (тобто частину повного полінуклеотиду або повної амінокислотної послідовності), що є подібною між двома молекулами і (2) може додатково включати послідовність, яка різниться між двома полінуклеотидами або амінокислотними послідовностями, порівняння послідовностей між 37 двома (або декількома) молекулами здійснюють, як правило, шляхом порівняння послідовностей двох молекул у "порівняльному вікні" для ідентифікації і порівняння місцевих ділянок подібності послідовностей. Термін "порівняльне вікно", що вживається у цьому описі, означає абстрактний сегмент, що складається із щонайменше 18 суміжних нуклеотидних положень або 6 амінокислот, де полінуклеотидна послідовність або амінокислотна послідовність може порівнюватись з еталонною послідовністю, що складається із щонайменше 18 суміжних нуклеотидів або 6 амінокислотних послідовностей і де частина полінуклеотидної послідовності у порівняльному вікні може включати додання, делеції, заміни тощо (тобто двониткові розриви) (20% або менше), порівняно з еталонною послідовністю (яка не містить додань або делецій), для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Оптимальне впорядковане розміщення послідовностей для вирівнювання порівняльного вікна може здійснюватися за допомогою алгоритму локальної гомології Сміт (Smith) і Уотермен (Waterman), Adv. Appl. Math., 2:482 (1981), за допомогою алгоритму порівняльного аналізу гомології Нідлмен (Needleman) і Вунш (Wunsch), J. Моl. Вiol., 48:443 (1970), за допомогою методу дослідження для встановлення подібності Пірсон (Pearson) і Ліпмен (Lipman), Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:2444 (1988), за допомогою комп'ютеризованого застосування цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у пакеті програм Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, штат Вісконсін), пакет програм Geneworks або MacVector) або шляхом огляду і вибирають найкраще впорядковане розміщення (тобто наслідком якого є найвищий відсоток гомології у порівняльному вікні), що забезпечується різними методами. Термін "ідентичність послідовностей" означає, що дві полінуклеотидні або амінокислотні послідовності є ідентичними (тобто на основі порівняння нуклеотидів або залишків) у порівняльному вікні. "Відсоток ідентичності послідовностей" обчислюють шляхом порівняння двох оптимально впорядковано розмішених послідовностей у порівняльному вікні, з визначенням кількості положень, у яких у обох послідовностях знаходяться ідентичні нуклеїновокислотні основи (наприклад, А, Т, С, G, U або І) або залишки, з одержанням кількості суміщених положень, поділом кількості суміщених положень на загальну кількість положень у порівняльному вікні (тобто розмір вікна) і множенням результату на 100 для одержання відсотка ідентичності послідовностей. Термін "суттєва ідентичність", що вживається у цьому описі, означає характеристику полінуклеотидної або амінокислотної послідовності, де згаданий полінуклеотид або амінокислота містить послідовність, що має щонайменше 85 відсоткову ідентичність послідовностей, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, щонайменше 90-95 відсоткову ідентичність послідовностей, звичайніше щонайменше 99 відсоткову ідентичність послідовностей, порівняно з еталонною послідовністю у порівняльному вікні із щонай 94211 38 менше 18 нуклеотидних (6 амінокислотних) положень, часто у вікні із щонайменше 24-48 нуклеотидних (8-16 амінокислотних) положень, де відсоток ідентичності послідовностей обчислюють шляхом порівняння еталонної послідовності з послідовністю, яка може включати делецїї або додання, які у цілому становлять 20% або менше від еталонної послідовності у порівняльному вікні. Згадана еталонна послідовність може бути підгрупою більшої послідовності. Як вживається у цьому описі, двадцять традиційних амінокислот і їх скорочення відповідають традиційному застосуванню. Дивись Immunology А Synthesis (Е.С. Голуб (E.S. Golub) та Д.Р. Грен (D.R. Gren) (редактори), Sinauer Associates, Simderland 7, штат Массачусетс (1991)). Стереоізомери (наприклад, D-амінокислоти) двадцяти традиційних амінокислот, штучні амінокислоти, наприклад, α-, α-двозаміщені амінокислоти, Nалкільні амінокислоти, молочна кислота та інші нетрадиційні амінокислоти, можуть також бути придатними складовими для поліпептидів за цим винаходом. Приклади нетрадиційних амінокислот включають: 4-гідроксипролін, -карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметиллізин, ε-Ν-ацетиллізин, Офосфосерин, N-ацетилсерин, N-формілметіонін, 3метилгістидин, 5-гідроксилізин, -Ν-метиларгінін та інші подібні амінокислоти та імінокислоти (наприклад, 4-гідроксипролін). У позначенні поліпептидів, що вживається у цьому описі, лівостороннім напрямком є амінокінцевий напрямок, а правостороннім напрямком є карбоксикінцевий напрямок, відповідно до стандартного вживання і звичаю. Подібним чином, якщо не вказано інше, лівостороннім кінцем однониткових полінуклеотидних послідовностей є 5'-кінець; лівосторонній напрямок двониткових полінуклеотидних послідовностей називають 5'-напрямком. Напрямок 5'3' додання транскриптів РНК, що виникають, називають напрямком транскрипції. Ділянки послідовності нитки ДНК, що мають таку саму послідовність, що і РНК, і які знаходяться у 5' положенні відносно 5'-кінця транскрипту РНК, називають "послідовностями 3'5'-дирекційного типу", ділянки послідовності нитки ДНК, що мають таку саму послідовність, що і РНК, і які знаходяться у 3' положенні відносно 3'-кінця транскрипту РНК, називають "послідовностями 5'3'-дирекційного типу". Щодо поліпептидів, термін "суттєва ідентичність" означає, що дві пептидні послідовності, у разі оптимального впорядкованого розміщення, наприклад, за допомогою програм GAP або BESTFIT із застосуванням мас відсутніх двониткових розривів, мають щонайменше 80 відсоткову ідентичність послідовностей, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, щонайменше 90 відсоткову ідентичність послідовностей, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, щонайменше 95 відсоткову ідентичність послідовностей, і відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, щонайменше 99 відсоткову ідентичність послідовностей. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, положення залишків, які не є ідентичними, 39 різняться консервативними амінокислотними замінами. Консервативні амінокислотні заміни означають взаємозамінність залишків, що мають однакові бічні ланцюги. Наприклад, групою амінокислот, що мають аліфатичні бічні ланцюги, є гліцин, аланін, валін, лейцин та ізолейцин; групою амінокислот, що мають аліфатично-гідроксильні бічні ланцюги, є серин і треонін; групою амінокислот, що мають амідовмісні бічні ланцюги, є аспарагін і глутамін; групою амінокислот, що мають ароматичні бічні ланцюги, є фенілаланін, тирозин і триптофан; групою амінокислот, що мають основні бічні ланцюги, є лізин, аргінін і гістидин; і групою амінокислот, що мають сірковмісні бічні ланцюги, є цистеїн та метіонін. Замісними консервативними амінокислотними групами, яким віддається перевага, є: валінлейцин-ізолейцин, фенілаланін-тирозин, лізинаргінін, аланін-валін, глутамінова кислотааспарагінова кислота і аспарагін-глутамін. Як обговорюється у цьому описі, незначні зміни амінокислотних послідовностей антитіл або молекул імуноглобулінів передбачаються як такі, що охоплюються цим винаходом, за умови, що у разі змін амінокислотна послідовність зберігається щонайменше на 75%, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, щонайменше на 80%, 90%, 95%, а відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, на 99%. Передбачаються, зокрема, консервативні амінокислотні заміни. Консервативними замінами є заміни, які відбуваються у сімействі амінокислот, які є спорідненими за своїми бічними ланцюгами. Генетично закодовані амінокислоти, у цілому, підрозділяються на сімейства: (1) кислими амінокислотами є аспартат, глутамат; (2) основними амінокислотами є лізин, аргінін, гістидин; (3) неполярними амінокислотами є аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан і (4) незарядженими полярними амінокислотами є гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин. До гідрофільних амінокислот належать аргінін, аспарагін, аспартат, глутамін, глутамат, гістидин, лізин, серин і треонін. До гідрофобних амінокислот належать аланін, цистеїн, ізолейцин, лейцин, метіонін, фенілаланін, пролін, триптофан, тирозин і валін. Іншими сімействами амінокислот є (і) серин і треонін, які являють собою аліфатичногідроксильне сімейство; (іі) аспарагін і глутамін, які являють собою амідовмісне сімейство; (ііі) аланін, валін, лейцин і ізолейцин, які являють собою аліфатичне сімейство; та (iv) фенілаланін, триптофан і тирозин, які являють собою ароматичне сімейство. Наприклад, виправданим є очікування того, що окрема заміна лейцину на ізолейцин або валін, аспартату на глутамат, треоніну на серин або подібна заміна амінокислоти на структурно споріднену амінокислоту не буде мати суттєвого впливу на зв'язування або властивості одержаної у результаті молекули, зокрема, якщо заміна не включає амінокислоти, яка знаходиться у межах каркасної ділянки. Чи забезпечить амінокислотна заміна одержання функціонального пептиду, може легко бути визначено шляхом випробування специфічної активності поліпептидної похідної. Докладний 94211 40 опис аналізів наводиться. Фрагменти або аналоги антитіл або молекул імуноглобулінів можуть бути легко одержані пересічними фахівцями у цій галузі. Аміно- і карбоксикінці фрагментів або аналогів, яким віддається перевага, знаходяться поблизу меж функціональних доменів. Структурні і функціональні домени можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння даних щодо нуклеотидних та/або амінокислотних послідовностей із суспільними або приватними базами даних із послідовностями. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, методи комп'ютеризованого порівняння застосовуються для ідентифікації ділянок послідовностей або запрогнозованих конформаційних доменів білків, які зустрічаються у інших білків відомої структури та/або функції. Відомими є методи ідентифікації білкових послідовностей, які укладаються у відому тривимірну структуру. Боуі (Bowie) та інші, Science 253:164 (1991). Так, вищенаведені приклади демонструють, що фахівці у цій галузі можуть розпізнати ділянки послідовностей і структурні конформації, які можуть застосовуватись для визначення структурних і функціональних доменів за цим винаходом. Амінокислотними замінами, яким віддається перевага, є заміни, які: (1) знижують ступінь сприйнятливості до протеолізу, (2) знижують ступінь сприйнятливості до окиснення, (3) знижують ступінь зв'язувальної спорідненості до утворення білкових комплексів, (4) знижують ступінь зв'язувальних спорідненостей і (5) надають або модифікують інші фізико-хімічні або функціональні властивості таких аналогів. Аналоги можуть включати різноманітні мутеїни послідовності, за виключенням природної пептидної послідовності. Наприклад, одноразова амінокислотна заміна або численні амінокислотні заміни (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, консервативні амінокислотні заміни) можуть здійснюватись у природній послідовності (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, на ділянці поліпептиду за межами домену(-ів), що утворює міжмолекулярні контакти). Консервативна амінокислотна заміна не повинна суттєво змінювати структурних характеристик вихідної послідовності (наприклад, замінна амінокислота не повинна мати схильності до руйнування спіралі, яка існує у вихідній послідовності, або до руйнування вторинної структури інших типів, яка характеризує вихідну послідовність). Приклади визнаних у цій галузі вторинних і третинних структур поліпептидів описані у Proteins, Structures and Molecular Principles (під редакцією Крайтон (Creighton), W.H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure (під редакцією К. Бранден (С. Branden) і Дж. Туз (J. Tooze), Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); Торнтон (Thornton) та інші, Nature, 354:105 (1991). Термін "поліпептидний фрагмент", який вживається у цьому описі, означає поліпептид, що має амінокінцеву та/або карбоксикінцеву делецію, але де залишкова амінокислотна послідовність є ідентичною відповідним положенням природної послідовності, як визначають, наприклад, за непроцесованою послідовністю кДНК. Фрагменти, як 41 правило, мають у довжину щонайменше 5, 6, 8 або 10 амінокислот, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, їхня довжина становить щонайменше 14 амінокислот, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, їхня довжина становить щонайменше 20 амінокислот, як правило, їхня довжина становить щонайменше 50 амінокислот, а відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, їхня довжина становить навіть щонайменше 70 амінокислот. Термін "аналог", який вживається у цьому описі, означає поліпептиди, які містять сегмент щонайменше з 25 амінокислот, що є по суті ідентичним частині визначеної амінокислотної послідовності і який має щонайменше одну з наведених нижче властивостей: (1) специфічне зв'язування з CD3 за відповідних умов зв'язування, (2) здатність до блокування зв'язування відповідного CD3 або (3) здатність до пригнічення росту клітин, що експресують CD3, in vitro або in vivo. За типовим варіантом, аналоги поліпептидів містять консервативну амінокислотну заміну (або додання чи делецію), порівняно з природною послідовністю. Аналоги, як правило, мають у довжину щонайменше 20 амінокислот, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, мають у довжину 50 амінокислот або більше і часто їхня довжина може дорівнювати довжині непроцесованого природного поліпептиду. Аналоги пептидів широко застосовують у фармацевтичній промисловості як непептидні лікарські засоби з властивостями, аналогічними властивостям матричного пептиду. Непептидні сполуки подібних типів називають "пептидними міметиками" або "пептидоміметиками". Фушер Дж. (Fauchere J.), Adv. Drug Res., 15:29 (1986), Вебер (Veber), Фрейдінгер (Freidinger), TINS, crop. 392 (1985); Еванс (Evans) та інші, J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Такі сполуки часто розробляють за допомогою комп'ютеризованого молекулярного моделювання. Пептидні міметики, що є структурно подібними до терапевтично придатних пептидів, можуть застосовуватись для здійснення еквівалентного терапевтичного або профілактичного ефекту. Взагалі, пептидоміметики є структурно подібними до типового поліпептиду (тобто поліпептиду, що має біохімічну властивість або фармакологічну активність), наприклад, людського антитіла, але має один або декілька пептидних зв'язків, за факультативним варіантом, які є замінені на зв'язок, вибраний з групи, що включає: ---CH2NH--, --CH2S-, --СН2-СН2--, --СН=СН-- (цис і транс), --СОСН2--, СН(ОН)СН2-- та -CH2SO--, способами, добре відомими у цій галузі. Систематична заміна однієї або декількох амінокислот консенсусної послідовності на D-амінокислоту того самого типу (наприклад, Dлізин замість L-лізину) може застосовуватись для одержання більш стійких пептидів. На додаток до цього, конформаційно обмежені пептиди, що містять консенсусну послідовність або по суті варіацію ідентичної консенсусної послідовності, можуть бути одержані за допомогою способів, відомих у цій галузі (Різо (Rizo), Гіраш (Gierasch), Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); наприклад, шляхом додання внутрішніх залишків цистеїну, здатних до 94211 42 утворення внутрішньомолекулярних дисульфідних місткових зв'язків, які циклізують пептид. Термін "агент" вживається у цьому описі для позначення хімічної сполуки, суміші хімічних сполук, біологічної макромолекули або екстракту, одержаного з біологічних матеріалів. Терміни "мітка" або "мічений", які вживається у цьому описі, означають включення маркера, що піддається виявленню, наприклад, шляхом включення амінокислоти, міченої радіоактивним ізотопом, або приєднання до поліпептиду біотинілованої складової, яка може бути виявлена міченим авідином (наприклад, стрептавідин, що містить флуоресцентний маркер або має ферментативну активність, яка може бути виявлена оптичними або калориметричними методами). За певних ситуацій, мітка або маркер можуть також бути терапевтичним препаратом. У цій галузі відомими є різноманітні способи мічення поліпептидів і глікопротеїнів, які можуть застосовуватись. Прикладами міток для поліпептидів є (але без обмеження) наведені нижче: радіоізотопи або радіонукліди (наприклад, 3Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 90Тс, 111Іn, 125І, 131І), флуоресцентні мітки (наприклад, FITC (флуоресцинізотіоціанат), родамін, лантанідні люмінофори), ферментативні мітки (наприклад, пероксидаза з хрону, nгалактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемілюмінесцентні сполуки, біотиніловані групи, попередньо визначені поліпептидні антигенні детермінанти, які розпізнаються вторинною репортеркою групою (наприклад, послідовності лейцинових лінкерних пар, центри зв'язування "вторинних" антитіл, домени зв'язування металу, мітки антигенних детермінант). За деякими варіантами здійснення, мітки приєднуються за допомогою спейсерних груп різної довжини для зменшення потенційної стеричної невідповідності. Термін "фармацевтичний засіб або лікарський засіб", який вживається у цьому описі, означає хімічну сполуку або композицію, здатну до індукування бажаного терапевтичного ефекту у разі відповідного введення хворому. Інші хімічні терміни у цьому описі застосовують відповідно до традиційного застосування у цій галузі, приклади якого наводяться у словнику хімічних термінів The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (під редакцією Паркер С. (Parker S.), McGraw-Hill, San Francisco (1985)). Термін "протипухлинний засіб" вживається у цьому описі для означення засобів, функціональна властивість яких полягає у пригнічення розвитку або прогресування пухлини у людини, зокрема, злоякісного (ракового) ураження, наприклад, карциноми, саркоми, лімфоми або лейкозу. Властивістю протипухлинних засобів часто є пригнічення метастазів. Словосполучення "по суті чистий", яке вживається у цьому описі, означає цільовий різновид у переважному присутньому різновиді (тобто на молярній основі, кількість цього різновиду є більшою за кількість будь-якого іншого окремо взятого різновиду у цій композиції), а відповідно до варіанта, якому віддається перевага, по суті очищеною фракцією є композиція, де цільовий різновид становить щонайменше приблизно 50% (на молярній 43 основі) від усіх присутніх макромолекулярних різновидів. Взагалі, по суті чиста композиція буде містити більше за приблизно 80% від усіх макромолекулярних різновидів, присутніх у згаданій композиції, відповідно до варіанта, якому віддається більша перевага, більше за приблизно 85%, 90%, 95% та 99%. Відповідно до варіанта, якому віддається найбільша перевага, цільовий різновид очищають до суттєвої однорідності (забруднювальні різновиди не можуть бути виявлені у згаданій композиції за допомогою традиційних способів виявлення), де згадана композиція складається по суті з одного макромолекулярного різновиду. Термін "хворий" включає людину і ветеринарні суб'єкти. Людські антитіла і гуманізація антитіл huCD3 антитіло одержують, наприклад, шляхом імунізації ксеногенних мишей, здатних до розвитку повністю людських антитіл (дивись Приклад 1). IgG huCD3 антитіло одержують, наприклад, шляхом перетворення IgM анти-CD3 антитіла, продукованого трансгенними мишами (дивись Приклад 2). За альтернативним варіантом, таке huCD3 антитіло одержують, наприклад, за допомогою методів проявлення фаз із застосуванням антитіл, що містять лише людські послідовності. Такі варіанти підходу є добре відомими у цій галузі, наприклад, у WO 92/01047 та патенті США №6,521,404, які включено до цього опису шляхом посилання. За цим варіантом підходу, комбінаторну бібліотеку фага, що несе довільні пари легких і важких ланцюгів, перевіряють за допомогою природного або рекомбінантного джерела CD3 або його фрагментів. Цей винахід включає способи продукування huCD3 антитіла за допомогою способу, де щонайменше одна стадія згаданого способу включає імунізацію трансгенної тварини (окрім людини) людським CD3 білком. Деякі з ендогенних локусів важких та/або каппа легких ланцюгів цієї ксеногенної тварини (окрім людини) були блоковані і є нездатними до реаранжування, необхідного для продукування генів, що кодують імуноглобуліни у відповідь на антиген. На додаток до цього, щонайменше один людський локус важкого ланцюга і щонайменше один людський локус легкого ланцюга були стабільно трансфіковані до згаданої тварини. Таким чином, у відповідь на введення антигену, людські локуси реаранжуються для продукування генів, що кодують людські варіабельні ділянки, імуноспецифічні відносно згаданого антигену. Завдяки цьому, у разі імунізації, ксеногенна миша продукує В-клітини, які секретують повністю людські імуноглобуліни. У цій галузі добре відомі різноманітні способи одержання ксеногенних тварин (окрім людини). Дивись, наприклад, патенти США №6,075,181 та №6,150,584. За однією зі стратегій, ксеногенні (людські) гени важких і легких ланцюгів імуноглобулінів вводять до зародкової лінії-хазяїна (наприклад, сперматозоїдів або овоцитів) і, на окремих стадіях, функціональність відповідних генів-хазяїв блокують шляхом інактивації із застосуванням гомологічної рекомбінації. Людські гени важких і 94211 44 легких ланцюгів імуноглобулінів реконструюють у відповідному еукаріотному або прокаріотному мікроорганізмі, і одержані фрагменти ДНК вводять до відповідного хазяїна, наприклад, до пронуклеусів запліднених мишачих овоцитів або ембріональних стовбурових клітин. Інактивація ендогенних імуноглобулінових локусів хазяїна забезпечується цілеспрямованим руйнуванням відповідних локусів шляхом гомологічної рекомбінації у клітинаххазяях, зокрема, ембріональних стовбурових клітинах або пронуклеусах запліднених мишачих овоцитів. Цілеспрямоване руйнування може включати спричинення пошкодження або введення делеції до локусу-мішені або делеції у межах локусумішені, що супроводжується інсерцією до згаданого локусу, наприклад, інсерцією селективного маркера. У разі ембріональних стовбурових клітин, одержують химерних тварин, які частково походять від модифікованих ембріональних стовбурових клітин і є здатними до передачі генетичних модифікацій через зародкову лінію. Парування хазяїв із введеними людськими імуноглобуліновими локусами з лініями з інактивованими ендогенними локусами забезпечить одержання тварин, які будуть продукувати виключно ксеногенні, наприклад, людські антитіла. За альтернативною стратегією, щонайменше частини людських локусів важких і легких ланцюгів імуноглобулінів застосовують для безпосередньої заміни відповідних ендогенних локусів імуноглобулінів шляхом гомологічної рекомбінації в ембріональних стовбурових клітинах. Наслідком цього є одночасна інактивація і заміна ендогенного імуноглобуліну. Після цього одержують химерних тварин, у яких клітини, одержані з ембріональних стовбурових клітин, можуть додавати свій внесок до зародкових ліній. Наприклад, клон В-клітин, що експресує людське анти-СD3 антитіло, видаляють із ксеногенної тварини (окрім людини) та імморталізують за допомогою різних способів, відомих у цій галузі. Такі В-клітини можуть бути одержані безпосередньо з крові згаданої тварини або з лімфоїдних тканин, з включенням (але без обмеження) селезінки, мигдалин, лімфатичних вузлів і кісткового мозку. Одержані подібним чином імморталізовані В-клітини можуть розмножуватись і культивуватись in vitro з одержанням великих, клінічно застосовних кількостей huCD3 антитіла. За альтернативним варіантом, гени, що кодують імуноглобуліни з однією або декількома людськими варіабельними ділянками, можуть виділятись і експресуватись у клітинах іншого типу, у тому числі (але без обмеження), у системі культивування клітин ссавців, для безпосереднього одержання антитіл або їхніх окремих ланцюгів, що складаються з одноланцюгових Fvмолекул. На додаток до цього, уся популяція повністю людських анти-СD3 антитіл, продукованих ксеногенною твариною (окрім людини), може перевірятись для ідентифікації одного такого клону з оптимальними характеристиками. Такі характеристики включають, наприклад, зв'язувальну спорідненість до людського CD3 білка, стабільність взаємодії, а також ізотип повністю людського анти-СD3 антиті 45 ла. Клони усієї популяції, які мають бажані характеристики, у подальшому застосовують як джерело нуклеотидних послідовностей, що кодують бажані варіабельні ділянки, для подальшого маніпулювання з метою продукування антитіл з такими характеристиками у інших системах клітин із застосуванням традиційних рекомбінантних або трансгенних методів. Подібна загальна стратегія була продемонстрована у зв'язку з одержанням перших ліній XenoMouse™ (ксеногенних мишей), як було опубліковано у 1994 році. Дивись Грін (Green) та інші, Nature Genetics, 7:13-21 (1994). Цей підхід додатково обговорюють і описують у заявках на патент США №07/466,008 (яка була подана 12 січня 1990 року), №07/610,515 (яка була подана 8 листопада 1990 року), 07/919,297 (яка була подана 24 червня 1992 року), 07/922,649 (яка була подана 30 червня 1992 року), 08/031,801 (яка була подана 15 березня 1993 року), 08/112,848 (яка була подана 27 серпня 1993 року), 08/234,145 (яка була подана 28 квітня 1994 року), 08/376,279 (яка була подана 20 січня 1995 року), 08/430,938 (яка була подана 27 квітня 1995 року), 08/464,584 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/464,582 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/463,191 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/462,837 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/486,583 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/486,587 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/486,859 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/462,513 (яка була подана 5 липня 1995 року), 08/724,752 (яка була подана 2 жовтня 1996 року) та 08/759,620 (яка була подана 3 грудня 1996 року) та патентах США №6,162,963, №6,150,584, №6,144,598, №6,075,181 та №5,939,598 і патентах Японії №3 068 180 В2, №3 068 506 В2 та №3 068 507 В2. Дивись також Мендес (Mendez) та інші, Nature Genetics, 15:146-156 (1997) та Грін (Green) і Якобовіц (Jakobovits), J. Exp. Med., 188:483-495 (1998). Дивись також європейський патент ЕР 0 463 151 В1, опублікований 12 липня 1996 року, заявку на міжнародний патент WO 94/02602, опубліковану 3 лютого 1994 року, заявку на міжнародний патент WO 96/34096, опубліковану 31 жовтня 1996 року, WO 98/24893, опубліковану 11 липня 1998 року, WO 00/76310, опубліковану 21 грудня 2000 року. За альтернативним варіантом, інші застосували варіант підходу з "мінілокусом". За варіантом підходу з мінілокусом, екзогенний Ig локус імітують шляхом включення частин (окремих генів) з Ig локусу. Таким чином, один або декілька VH генів, один або декілька DH генів, один або декілька JH генів, константну ділянку мю і другу константну ділянку (відповідно до варіанта, якому віддається перевага, константну ділянку гамма) об'єднують у формі генно-інженерної конструкції для введення тварині. Цей варіант підходу описують у патенті США №5,545,807 на ім'я Сурані (Surani) та інших, патентах США №5,545,806, №5,625,825, №5,625,126, №5,633,425, №5,661,016, №5,770,429, №5,789,650, №5,814,318, №5,877,397, №5,874,299 та №6,255,458, кожен на ім'я Лонберг (Lonber) та Кей (Кау), патентах США №5,591,669 та №6,023,010 на ім'я Крімпенфорт 94211 46 (Krimpenfort) та Бернc (Berns), патентах США №5,612,205, №5,721,367 та №5,789,215 на ім'я Бернс (Berns) та інші, патенті США №5,643,763 на ім'я Чой (Choi) і Данн (Dunn), заявках фірми GenPharm на міжнародний патент №07/574,748, яка була подана 29 серпня 1990 року, №07/575,962, яка була подана 31 серпня 1990 року, №07/810,279, яка була подана 17 грудня 1991 року, №07/853,408, яка була подана 18 березня 1992 року, №07/904,068, яка була подана 23 липня 1992 року, №07/990,860, яка була подана 16 грудня 1992 року, №08/053,131, яка була подана 26 квітня 1993 року, №08/096,762, яка була подана 22 червня 1993 року, №08/155,301, яка була подана 18 листопада 1993 року, №08/161,739, яка була подана 3 грудня 1993 року, №08/165,699, яка була подана 10 грудня 1993 року, №08/209,741, яка була подана 9 березня 1994 року. Дивись також європейський патент №0 546 073 В1, заявки на міжнародний патент WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 та WO 98/24884 і патент США №5,981,175. Дивись, додатково, Тейлор (Taylor) та інші, 1992, Чен (Chen) та інші, 1993, Туайон (Tuaillon) та інші, 1993, Чой (Choi) та інші, 1993, Лонберг (Lonberg) та інші, (1994), Тейлор (Taylor) та інші, (1994), Туайон (Tuaillon) та інші, (1995), Фішвідд (Fishwild) та інші, (1996). Перевага варіанта підходу з мінілокусом полягає у швидкості, з якою можуть бути одержані і введені тваринам генно-інженерні конструкції, до складу яких входять частини Ig локусу. Відповідно, однак, значний недолік варіанта підходу з мінілокусом полягає у тому, що, теоретично, шляхом введення невеликої кількості V, D і J генів вводиться недостатня різноманітність. Дійсно, опублікована робота, як видається, підтримує це занепокоєння. Одержання В-клітин і продукування антитіл тваринами за варіантом підходу з мінілокусом видається занадто уповільненим. Унаслідок цього, дослідження, пов'язане з цим винаходом, постійно спрямовувалось на введення великих частин Ig локусу з метою досягнення більшого розмаїття і у намаганні відновити імунний спектр тварин. Кірін (Kіrіn) також продемонстрував продукування людських антитіл мишами, яким, шляхом злиття мініатюрних клітин, були введені великі частини хромосом або хромосоми у цілому. Дивись заявки на європейський патент №773 288 та №843 961. Реакція на людські антимишачі антитіла (НАМА) примусила цю галузь промисловості звернутись до одержання химерних або іншим чином гуманізованих антитіл. Незважаючи на те, що химерні антитіла мають людську константну ділянку та імунокомпетентну варіабельну ділянку, очікують, що на людські антихимерні антитіла (НАСА) також будуть спостерігатись певні реакції, зокрема, у разі постійного або багатодозового застосування цього антитіла. Таким чином, бажано було б надати повністю людські антитіла проти CD3 для зведення нанівець занепокоєнь та/або ефектів реакції на НАМА або НАСА. 47 Продукування антитіл зі зниженою імуногенністю також здійснюється шляхом гуманізації і методів проявлення із застосуванням відповідних бібліотек. Буде зрозуміло, що мишачі антитіла або антитіла від інших видів можуть бути гуманізованими або приматизованими за допомогою методів, добре відомих у цій галузі. Дивись, наприклад, Вінтер (Winter) та Гарріс (Harris), Immunol. Today, 14:43-46 (1993) і Райт (Wright) та інші, Crit. Reviews in Immunol, 12125-168 (1992). Антитіло, яке становить інтерес, може бути сконструйоване за допомогою методів рекомбінантних ДНК для заміни ділянок СН1, СН2, СН3, шарнірних ділянок та/або каркасної ділянки на відповідну людську послідовність (дивись WO 92/102190 та патенти США №5,530,101, №5,585,089, №5,693,761, №5,693,792, №5,714,350 і №5,777,085). У цій галузі відоме також застосування Ig кДНК для конструювання химерних імуноглобулінових генів (Лю (Liu) та інші, P.N.A.S., 84:3439 (1987) і J. Immunol, 139:3521 (1987)). мРНК виділяють із гібридоми або іншої клітини, що продукує антитіло, і застосовують для продукування кДНК. кДНК, яка становить інтерес, може бути ампліфікована за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням специфічних праймерів (патенти США №4,683,195 та №4,683,202). За альтернативним варіантом, створюють і перевіряють бібліотеку для виділення послідовності, яка становить інтерес. Після цього послідовність ДНК, яка кодує варіабельну ділянку антитіла, гібридизують із людськими послідовностями константних ділянок. Послідовності людських генів константних ділянок можна знайти у Кебот (Kabat) та інші, (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, публікація N.I.H. №91-3242. Гени людської С ділянки є легко доступними з відомих клонів. При виборі ізотипу будуть керуватись бажаними ефекторними функціями, наприклад, зв'язуванням комплементу або активністю у антитілозалежній клітинній цитотоксичності. Ізотипами, яким віддається перевага, є IgG1, IgG3 та IgG4. Застосовуватись можуть будь-які людські константні ділянки легкого ланцюга, каппа або лямбда. Після цього химерне гуманізоване антитіло експресують традиційними способами. Фрагменти антитіл, наприклад, Fv, F(ab')2 і Fab, можна одержати шляхом розщеплення інтактного білка, наприклад, за допомогою протеази або шляхом хімічного розщеплення. За альтернативним варіантом, конструюється скорочений ген. Наприклад, химерний ген, що кодує частину F(ab')2-фрагмента, повинен включати послідовності ДНК, що кодують домен СН1 і шарнірну ділянку Η ланцюга, за якими буде знаходитись кодон, що термінує трансляцію, для одержання скороченої молекули. Консенсусні послідовності Н, L і J ділянок можуть застосовуватись для конструювання олігонуклеотидів для застосування у ролі праймерів для вставляння придатних сайтів рестрикції до J ділянки для подальшого літування сегментів V ділянки до сегментів людської С ділянки. кДНК С ділянки може бути модифікований сайт-спрямованим мутагенезом для розміщення сайту у аналогічному положенні у людській послідовності. 94211 48 Вектори експресії включають плазміди, ретровіруси, YACs (штучні дріжджові хромосоми), епісоми EBV (вірус Епштейн-Барра) тощо. Зручним вектором є вектор, який кодує функціонально повну людську СН або CL імуноглобулінову послідовність із відповідними сайтами рестрикції, сконструйованими таким чином, що будь-яка VH або VL-31 послідовність може бути легко вставленою і експресованою. У таких векторах сплайсинг, як правило, відбувається між донорною точкою сплайсингу у вставленій J ділянці та акцепторного точкою сплайсингу, що передує людській С ділянці, а також на ділянках сплайсингу, які знаходяться у межах людських СН екзонів. Поліаденілування і термінація транскрипції відбувається на нативних хромосомних сайтах у 5'-3'-напрямку відносно кодувальних ділянок. Одержане химерне антитіло може приєднуватись до будь-якого сильного промотора, у тому числі довгих кінцевих повторів (LTR) ретровірусу, наприклад, раннього промотора SV-40 (мавпячий вірус-40) (Окаяма (Okayama) та інші, Моl. Cell Bio., 3:280 (1983)), довгого кінцевого повтору вірусу саркоми Рауса (Горман (Gorman) та інші, P.N.A.S., 79:6777 (1982)) і довгого кінцевого повтору вірусу мишачого лейкозу Молоні (Гроссшедл (Grosschedl) та інші, Cell, 41:885 (1985)). Зрозумілим буде також те, що можуть застосовуватись нативні Ig промотори тощо. На додаток до цього, людські антитіла або антитіла від інших видів можуть одержуватись за допомогою методів проявлення типу, у тому числі (без обмеження) проявлення у фагах, проявлення у ретровірусах, проявлення у рибосомах та інших методів, із застосуванням методів, добре відомих у цій галузі, і одержані молекули можуть бути піддані додатковому визріванню, наприклад, "визріванню афінності", оскільки такі методи є добре відомими у цій галузі. Райт (Wright) і Гарріс (Harris), дивись вище, Хейн (Hanes) і Плукто (Plucthau), PEAS USA, 94:4937-4942 (1997) (проявлення у рибосомах), Пармлі (Parmley) і Сміт (Smith), Gene, 73:305-318 (1998) (проявлення у фагах), Скотт (Scott), TIB5, 17:241-245 (1992), Квірла (Cwirla) та інші, PNAS USA, 87:6378-6382 (1990), Рассел (Russel) та інші, Nucl. Acids Research, 21:1081-1085 (1993), Хоганбум (Hoganboom) та інші, Immunol. Reviews, 130:43-68 (1992), Чізвел (Chiswell) та Маккафферті (McCafferty), TIBTECH; 10:80-8A (1992) та патент США №5,733,743. У разі, якщо методи проявлення застосовують для продукування антитіл, які не є людськими, такі антитіла можуть гуманізуватись, як описувалось вище. За допомогою цих методів можуть бути одержані антитіла проти клітин, що експресують CD3, самих CD3, форм CD3, антигенних детермінант або їхніх пептидів та бібліотеки еспресованих послідовностей (дивись, наприклад, патент США №5,703,057), які у подальшому можуть перевірятись, як описано вище, для ідентифікації активностей, описаних вище. Конструювання і одержання інших терапевтичних засобів За цим винаходом і виходячи з активності антитіл, які продукуються, і характеристики яких на 49 ведені у цьому описі відносно CD3, полегшується розробка інших способів терапевтичного впливу і терапевтичних засобів, окрім складових, якими є антитіла. До числа таких способів терапевтичного впливу і терапевтичних засобів (без обмеження) належать сучасні засоби на основі антитіл, наприклад, біспецифічних антитіл, імунотоксини і лікарські засоби, мічені радіоактивними ізотопами, розробка пептидних терапевтичних засобів, генотерапія, зокрема, внутрішньоклітинними антитілами, антисмислові лікарські засоби і невеликі молекули. У зв'язку з біспецифічними антитілами, наприклад, можуть бути одержані біспецифічні антитіла, що містять (і) два кон'юговані антитіла, з яких одне має специфічність до CD3, а інше до другої молекули, (іі) одне антитіло, один із ланцюгів якого є специфічним до CD3, а другий ланцюг є специфічним до другої молекули або (ііі) одноланцюгове антитіло, яке має специфічність до CD3 та іншої молекули. Такі біспецифічні антитіла можуть бути одержані за допомогою методів, які є добре відомими, наприклад, у зв'язку з (і) та (іі) дивись, наприклад, Фангер (Fanger) та інші, Immunol. Methods, 4:72-81 (1994), Райт (Wright) і Гарріс (Harris), дивись вище, а у зв'язку з (ііі) дивись, наприклад, Траунекер (Traunecker) та інші, Int. J. Cancer (Додаток), 7:51-52 (1992). У кожному разі, друга специфічність може надаватись до рецепторів активації важких ланцюгів, у тому числі без обмеження, CD16 або CD64 (дивись, наприклад, Део (Deo) та інші, 18:127 (1997)) або CD89 (дивись, наприклад, Валеріус (Valerius) та інші, Blood, 90:4485-4492 (1997)). Біспецифічні антитіла, одержані відповідно до вищевказаного, могли б, ймовірно, убивати клітини, що експресують CD3, і, зокрема, ті клітини, для яких є ефективними CD3 антитіла за цим винаходом. У зв'язку з імунотоксинами, антитіла можуть модифікуватись таким чином, щоб відігравати роль імунотоксинів, із застосуванням методів, добре відомих у цій галузі. Дивись, наприклад, Вітетта (Vitetta), Immunol. Today, 14:252 (1993). Дивись також патент США №5,194,594. У зв'язку з одержанням антитіл, мічених радіоактивним ізотопом, такі модифіковані антитіла можуть також бути легко одержані із застосуванням методів, які є добре відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, Юнгханс (Junghans) та інші, у Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 655-686 (2-е видання, редактори Чафнер (Chafner) та Лонго (Longo), Lippincott Raven (1996)). Дивись також патенти США №4,681,581, №4,735,210, №5,101,827, №5,102,990 (RE 35,500), №5,648,471 та №5,697,902. Кожен з імунотоксинів та кожна з молекул, мічених радіоактивним ізотопом, могли б, ймовірно, убивати клітини, що експресують CD3, і, зокрема, ті клітини, для яких є ефективними антитіла за цим винаходом. У зв'язку з одержанням терапевтичних пептидів, шляхом застосування структурної інформації, пов'язаної з CD3 та антитілами проти нього, наприклад, антитілами за цим винаходом або перевіркою пептидних бібліотек, можуть бути одержані терапевтичні пептиди, спрямовані проти CD3. Розробка і перевірка пептидних терапевтичних засо 94211 50 бів обговорюється у Хутен (Houghten) та інші, Biotechniques, 13:412-421 (1992), Хутен (Houghten), PNAS USA, 82:5131-5135 (1995), Пінала (Pinalla) та інші, Biotechniques, 13:901-905 (1992), Блейк (Blake) та Лізі-Девіс (Litzi-Davis), BioConjugate Chem., 3:510-513 (1992). Імунотоксини і молекули, мічені радіоактивним ізотопом, можуть також бути одержані, і подібним же чином, у зв'язку з пептидними складовими, як обговорювалось вище у зв'язку з антитілами. Припускаючи, що молекула CD3 (або форма, наприклад, сплайсований варіант або змінна форма) є функціонально активною у хворобливому процесі, можливим буде також конструювання гена і антисмислових лікарських засобів за допомогою традиційних методів. Такі способи терапевтичного діяння можуть застосовуватись для модулювання функції CD3. У зв'язку з цим, антитіла за цим винаходом полегшують розробку і застосування пов'язаних із цим функціональних аналізів. Розробка і стратегія застосування антисмислових лікарських засобів докладно обговорюється у міжнародній заявці на патент WO 94/29444. Розробка і стратегія застосування генотерапії є добре відомими. Однак, зокрема, застосування генотерапевтичних методів, що залучають внутрішньоклітинні антитіла, може виявитись особливо вигідною. Дивись, наприклад, Чен (Chen) та інші, Human Gene Therapy, 5:595-601 (1994) і Мараско (Marasco), Gene Therapy, 4:11-15 (1997). Загальна розробка і міркування, пов'язані з генотерапевтичними засобами, також обговорюються у міжнародний заявці на патент WO 97/38137. Інформація про структуру молекули CD3 та її взаємодію з іншими молекулами за цим винаходом, наприклад, антитілами за цим винаходом, та інша може бути застосована для раціональної розробки додаткових терапевтичних засобів. У цьому відношенні, раціональні методи розробки лікарських засобів, наприклад, рентгенівська кристалографія, автоматизоване молекулярне моделювання (САММ), методика кількісного та якісного визначення взаємодії структура-активність (QSAR) і подібні методи можуть застосовуватись для концентрування зусиль, спрямованих на розробку лікарських засобів. Раціональна розробка надає можливість прогнозування білкових або синтетичних структур, які можуть взаємодіяти з молекулою або її специфічними формами, які можуть застосовуватись для модифікування або модулювання активності CD3. Такі структури можуть бути синтезовані хімічним шляхом або експресовані у біологічних системах. Цей варіант підходу розглядається у роботі Капсі (Capsey) та інших, Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). На додаток до цього, комбінаторні бібліотеки можуть бути розроблені, синтезовані і застосовані у програмах перевірки, наприклад, високоефективних програмах скринінгу. Введення терапевтичних засобів і композицій Буде зрозуміло, що терапевтичні засоби за цим винаходом будуть вводитись із відповідними носіями, наповнювачами та іншими компонентами, які включають до складу композицій для забезпечення поліпшеного перенесення, доставки, толерантності тощо. Численні придатні композиції мо 51 жна знайти у фармакологічному довіднику, відомому усім фахівцям у галузі фармацевтичної хімії: Remington's Pharmaceutical Sciences (15-е видання, Mack Publishing Company, Easton, штат Пенсільванія (1975), зокрема, у його розділі 87 (Блау (Blaug), Сеймур (Seymour)). Ці композиції включають, наприклад, порошки, пасти, мазі, желе, що містять лікарські засоби, воски, масла, ліпіди, ліпіди (катіонні або аніонні), що містять мікросфери (наприклад, Lipofectin™), кон'югати ДНК, безводні абсорбційні пасти, емульсії типу масла у воді і води у маслі, емульсії карбоваксу (поліетиленгліколі різної молекулярної маси), напівтверді гелі і напівтверді суміші, що містять карбовакс. Будь-яка з вищезгаданих сумішей може бути придатною для лікування за цим винаходом, за умови, що активна складова композиції не інактивується у згаданій композицій і згадана композиція є фізіологічно прийнятною і сумісною зі шляхом введення. Дивись також Балдрік П. (Baldrick P.), "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol., 32 (2):210-8 (2000), Ванг В. (Wang W.), "Lyophilization and development of solid protein Pharmaceuticals". Int. J. Pharm. 203 (1-2): 1-60 (2000), Чармен B.H. (Charman W.N.), "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts", J. Pharm. Sci., 89 (8):967-978 (2000), Пауелл (Powell) та інші, "Compendium of excipients for parenteral formulations", PDA J. Pharm. Sci. Technol, 52:238311 (1998) та посилання у цьому описі для додаткової інформації відносно композицій, наповнювачів та носіїв, добре відомих фахівцям із фармацевтичної хімії. Терапевтичні композиції за цим винаходом, які включають huCD3 антитіло за цим винаходом, застосовують для лікування або полегшення симптому, пов'язаного з імунопатологією, наприклад, з автоімунним захворюванням або запальним розладом. Автоімунні захворювання включають, наприклад, синдром набутого імунодефіциту (СНІД, який являє собою вірусне захворювання з автоімунною складовою), вогнищеву алопецію, анкілозивний спондилоартрит, антифосфоліпідний синдром, автоімунну хворобу Аддісона, автоімунну гемолітичну анемію, автоімунний гепатит, автоімунне захворювання внутрішнього вуха (AIED), автоімунний лімфопроліферативний синдром (ALPS), автоімунну тромбоцитопенічну пурпуру (АТР), хворобу Бехчета, кардіоміопатію, синдром черевної мальабсорбції-герпетоформний дерматит; синдром хронічного перевтомлення з дисфункцією імунної системи (CFIDS), хронічну запальну демієлінізуючу поліневропатію (CIPD), рубцевий пемфігоїд, синдром холодової аглютинації, гребінцевий синдром, хворобу Крона, хворобу Дего, юнацький дерматоміозит, дискоїдний червоний вовчак, ідіопатичну кріоглобулінемію змішаного типу, фіброміалгію-фіброміозит, хворобу Грейвса, хворобу Пйєна-Барре, тиреоідит Хашимото, ідіопатичний фіброз легень, ідіопатичну тромбоцитопенічну пурпуру (ІТР), нефропатію IgA-типу, інсулінозалежний цукровий діабет, юнацький інфекційний артрит (хвороба Стілла-Шоффара), юна 94211 52 цький ревматоїдний артрит, хворобу Меньєра, дифузну хворобу сполучної тканини змішаного типу, розсіяний склероз, важку псевдопаралітичну міастенію, злоякісну анемію, нодозний поліартеріїт, поліхондрит, плюригландулярний синдром, ревматичну поліміалгію, поліміозит і дерматоміозит, початкову агаммоглобулінемію, первинний біліарний цироз печінки, псоріаз, псоріазний артрит, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматизм, ревматоїдний артрит, саркоідоз, склеродермію (прогресуючий системний склероз (PSS), відомий також як системний склероз (SS)), синдром Шегрена, синдром ригідної людини, системний червоний вовчак, синдром Такаясу, темпоральний артеріїт/гігантоклітинний артеріїт, неспецифічний виразковий коліт, увеїт, вітиліго і гранулематоз Вегенера. Запальні розлади включають, наприклад, хронічні і гострі запальні розлади. Приклади запальних розладів включають хворобу Альцгеймера, астму, атопічну алергію, алергію, атеросклероз, бронхіальну астму, екзему, гломерулонефрит, реакцію "трансплантат проти хазяїна", гемолітичну анемію, остеоартрит, сепсис, інсульт, трансплантацію тканини або органа, васкуліт, діабетичну ретинопатію і пошкодження легень, викликане апаратом штучної вентиляції легень. За одним із варіантів здійснення, композиції на основі huCD3 антитіла за цим винаходом вводять у поєднанні з другим агентом, наприклад, GLP-1 (глюкагоноподібний пептид) або сполукою, яка переводить бета-клітини у стан спокою (тобто сполукою, яка знижує або іншим чином пригнічує вивільнення інсуліну, наприклад, відкривачі калієвих каналів). Приклади придатних GLP-1 сполук описують, наприклад, у опублікованій заявці на патент США №200400037826, а придатні сполуки, які переводять бета-клітини у стан спокою, описують у опублікованій заявці на патент США №20030235583, обидві з яких у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. За іншим варіантом здійснення, композиції на основі huCD3 антитіла, що застосовуються для лікування імунопатології, вводять у комбінації з будь-яким з цілого ряду відомих протизапальних та/або імуносупресивних сполук. До числа придатних відомих сполук належать (але без обмеження) метотрексат, циклоспорин А (з включенням, наприклад, мікроемульсії циклоспорину), такролімус (tacrolimus), кортикостероїдні препарати, статини, бета-інтерферон, ремікад (Remicade (інфліксімаб (Infliximab)), енбрел (Enbrel (етанерцепт (Etanercept)) та гуміра (Humira (адалімумаб (Adalimumab)). Наприклад, при лікуванні ревматоїдного артриту, композиції на основі huCD3 антитіла за цим винаходом можуть вводитись разом із кортикостероїдними препаратами, метотрексатом, циклоспорином А, статинами, ремікадом (інфліксімабом), енбрелом (етанерцептом) та/або гуміра (адалімумабом). При лікуванні увеїту, композиції на основі huCD3 антитіла можуть вводитись разом, наприклад, із кортикостероїдними препаратами, метотрексатом, циклоспорином А, циклофосфамідом 53 та/або статинами. Подібним же чином, хворі, уражені таким захворюванням, як хвороба Крона або псоріаз, можуть лікуватись комбінацією композиції на основі huCD3 антитіла за цим винаходом і ремікаду (інфліксімабу), енбрелу (етанерцепту) та/або гуміра (адалімумабу). Хворі на розсіяний склероз можуть одержувати комбінацію композиції на основі huCD3 антитіла за цим винаходом, наприклад, з ацетатом глатирамеру (копаксон (Сорахоnе)), бета-інтерфероном la (Avonex), бета-інтерфероном 1а (Rebif), бетаінтерфероном 1b (Betaseron або Betaferon), мітоксантроном (Novantrone), дексаметазоном (Decadron), метилпреднізолоном (Depo-Medrol) та/або преднізоном (Deltasone) та/або статинами. Цей винахід пропонує також способи лікування або полегшення симптому, пов'язаного з імунопатологією або симптому, пов'язаного з відторгненням після трансплантації органа. Наприклад, композиції за цим винаходом застосовують для лікування або полегшення симптому будь-якого автоімунного захворювання або запальних розладів, опис яких наведено. Терапевтичні композиції за цим винаходом застосовують також як імуносупресивні засоби при трансплантації органа або тканини. Термін "імуносупресивний засіб", який вживається у цьому описі, означає засіб, наслідком дії якого на імунну систему є негайне або пролонговане зниження активності щонайменше одного шляху, який залучено до імунної реакції, незалежно від того, чи ця реакція відбувається природним шляхом або штучно ініційована, незалежно від того, чи ця реакція є частиною вродженого імунітету, адаптивного імунітету, чи обох разом. Ці імуносупресивні композиції на основі huCD3 антитіла вводять суб'єкту перед, під час та/або після трансплантації органа або тканини. Наприклад, huCD3 антитіло за цим винаходом застосовують для лікування або запобігання відторгнення органа або тканини після трансплантації. За одним із варіантів здійснення, імуносупресивні композиції на основі huCD3 антитіла за цим винаходом вводять у поєднанні з другим агентом, наприклад, GLP-1 (глюкагоноподібний пептид) або сполукою, яка переводить бета-клітини у стан спокою, як описано вище. За іншим варіантом здійснення, ці імуносупресивні композиції на основі huCD3 антитіла вводять у комбінації з будь-яким з цілого ряду відомих протизапальних та/або імуносупресивних сполук. До числа придатних протизапальних та/або імуносупресивних сполук для застосування з huCD3 антитілами за цим винаходом належить (але без обмеження) метотрексат, циклоспорин А (з включенням, наприклад, мікроемульсії циклоспорину), такролімус, кортикостероїдні препарати і статини. За ще іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло вводять людині у разі виявлення присутності у організмі згаданої людини автоантитіл. Такі автоантитіла відомі у цій галузі як антитіла зі зв'язувальною спорідненістю до одного або декількох білків, які експресуються ендогенно у організмі людини. За одним з аспектів цього ви 94211 54 находу, людину перевіряють на присутність автоантитіл, специфічно залучених до одного або декількох автоімунних захворювань, як добре відомо у цій галузі. За одним зі специфічних варіантів здійснення, людину перевіряють на присутність антитіл проти інсуліну, глутамінової кислоти, декарбоксилази та/або ІА-2 білка з подальшим введенням huCD3 антитіла у разі позитивного виявлення одного або декількох таких автоантитіл. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло вводять людині для запобігання, зниження або зменшення рекрутингу імунокомпетентних клітин до людських тканин. huCD3 антитіло за цим винаходом вводять суб'єкту, який потребує цього, для запобігання або лікування станів, пов'язаних із патологічним або порушеним рекрутингом імунокомпетентних клітин до тканин людини, уражених хворобою. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло вводять людині для запобігання, зниження або зменшення транссудації або діапедезу імунокомпетентних клітин до людських тканин. Так, huCD3 антитіла за цим винаходом вводять для запобігання та/або лікування станів, пов'язаних із патологічною або порушеною інфільтрацією імунокомпетентних клітин до тканин людини, уражених хворобою. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло вводять людині для запобігання, зниження або зменшення ефектів, які опосередковуються вивільненням цитокінів у межах людського тіла. Термін "цитокін" означає усі людські цитокіни, відомі у цій галузі, які зв'язують позаклітинні рецептори, експресовані на поверхні клітини і, тим самим, модулюють функцію клітини, у тому числі (але без обмеження) IL-2 (інтерлейкін2), -IFN (гамма-інтерферон), TNF-α (фактор некрозу пухлин), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 та IL-13. Наслідком вивільнення цитокінів є токсикоз, відомий як синдром вивільнення цитокінів (CRS), що є поширеним клінічним ускладненням, яке спостерігається, наприклад, у разі застосування антиТ-клітинного антитіла, наприклад, ATG (антитимоцитарного глобуліну) та ОKТ3 (мишачого антилюдського CD3 антитіла). Цей синдром характеризується надмірним вивільненням таких цитокінів, як TNF, -IFN та IL-2, до кровообігу. CRS виникає як результат одночасного зв'язування антитіл із CD3 (через варіабельну ділянку антитіла) та рецепторами Fc-фрагмента та/або рецепторами комплементу (через константну ділянку антитіла) на інших клітинах, з активацією, тим самим, Т-клітин до вивільнення цитокінів, що викликає системну запальну реакцію, яка характеризується гіпотензією, гіпертермією та ригідністю. Симптоми CRS включають пропасницю, озноб, нудоту, блювання, гіпотензію та задишку. Таким чином, huCD3 антитіло за цим винаходом включає одну або декілька мутацій, які запобігають патологічному вивільненню і продукуванню одного або декількох цитокінів in vivo. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло водять людині для запобігання, зменшення або зниження ефектів, опосередкованих вивільненням рецепторів цитокінів у 55 людському тілі. Термін "рецептор цитокінів" означає усі людські рецептори цитокінів, відомі у цій галузі, що зв'язують один або декілька цитокінів, як визначено у цьому описі, з включенням (але без обмеження) рецепторів вищезгаданих цитокінів. Так, huCD3 антитіло за цим винаходом вводять для лікування та/або запобігання станів, які опосередковуються шляхом патологічної активації, зв'язування або лікування одного або декількох рецепторів цитокінів у людському тілі. Додатково передбачається, що введення huCD3 антитіла in vivo знизить рівень внутрішньоклітинної передачі сигналів, опосередкованої рецептором(-ами) цитокінів у організмі такої людини. За одним з аспектів цього винаходу, huCD3 антитіла вводять людині у разі зниження функціонування панкреатичних бета-клітин. За одним із варіантів здійснення, індивіда перевіряють на функціонування бета-клітин, секрецію інсуліну або рівні С пептиду, як відомо у цій галузі. У подальшому, у разі виявлення достатнього рівня зниження будь-якого зі згаданих індикаторів, людині, за відповідною схемою приймання лікарського засобу, вводять huCD3 антитіло для запобігання подальшого прогресування автоімунного руйнування функціонування бета-клітин. Діагностичні і профілактичні композиції Повністю людські анти-СD3 Mabs (моноклональні антитіла) застосовують у діагностичних і профілактичних композиціях. За одним із варіантів здійснення, huCD3 Mab за цим винаходом вводять хворим, що належать до групи ризику розвитку одного з вищезгаданих автоімунних захворювань. Схильність хворого до одного або декількох із вищезгаданих автоімунних захворювань може визначатись за допомогою генотипових, серологічних або біохімічних маркерів. Наприклад, присутність конкретних підтипів НLА (головний комплекс гістосумісності людини) і серологічних автоантитіл (проти інсуліну, GAD65 та ІА-2) вказують на діабет типу І. За іншим варіантом здійснення цього винаходу, huCD3 антитіло вводять людям, у яких діагностоване одне або декілька з вищезгаданих автоімунних захворювань. У разі постановки діагнозу, huCD3 антитіло вводять для полегшення або обернення ефектів автоімунітету. У одному з таких прикладів, людині з діагностованим діабетом типу І вводять достатню дозу huCD3 антитіла для відновлення функції підшлункової залози і зведення до мінімального рівня пошкодження, обумовленого автоімунною інфільтрацією до підшлункової залози. За іншим варіантом здійснення, людині з діагностованим ревматоїдним артриром вводять huCD3 антитіло для зниження інфільтрації імунокомпетентних клітин до суглобів кінцівок і їх руйнування. Антитіла за цим винаходом є також корисними для виявлення CD3 у зразках від хворих і, відповідно, є придатними як діагностичні засоби. Наприклад, huCD3 антитіла за цим винаходом застосовують у аналізах in vitro, наприклад, ELISA (твердофазний імуноферментний аналіз), для визначення рівнів CD3 у зразку від хворого. 94211 56 За одним із варіантів здійснення, huCD3 антитіло за цим винаходом іммобілізують на твердій основі (наприклад, лунці (лунках) титраційного мікропланшета). Антитіло за цим винаходом відіграє роль іммобілізованого антитіла для будь-якого CD3, який може бути присутнім у експериментальному зразку. Перед контактуванням іммобілізованого антитіла зі зразком від хворого, тверду основу прополіскують і обробляють блокувальним агентом, наприклад, білком норки або альбуміном, для запобігання неспецифічної абсорбції досліджуваної речовини. У подальшому лунки обробляють експериментальним зразком, у якому припускається присутність антигену, або розчином, що містить стандартну кількість антигену. Таким зразком може бути, наприклад, проба сироватки від суб'єкта, у якого припускають присутність рівнів циркулюючого антигену, які вважаються придатними для діагностування патології. Після промивання експериментального зразка або стандарту, тверду основу обробляють другим антитілом, яке мітять із можливістю виявлення. Мічене друге антитіло відіграє роль ідентифікаційного антитіла. Визначають рівень мітки, яка виявляється, і концентрацію CD3 антигену у експериментальному зразку визначають шляхом порівняння зі стандартною кривою, яку одержали за допомогою стандартних зразків. Буде зрозуміло, що, виходячи з результатів, які одержали за допомогою huCD3 антитіл за цим винаходом та in vitro діагностичного аналізу, можна встановити стадію захворювання (наприклад, автоімунного або запального розладу) у суб'єкта, виходячи з рівнів експресії CD3 антигену. Для даного захворювання, проби крові відбирають у суб'єктів, які були діагностовані, як такі, що знаходяться на різних стадіях розвитку захворювання та/або у різних часових точках лікування захворювання. Застосовуючи набори проб, які забезпечують статистично значущі результати для кожної стадії прогресування або лікування, визначають діапазон концентрацій антигену, які можуть вважатись характерними для кожної стадії. Усі публікації та патентні документи, згадані у цьому описі, включені до нього шляхом посилання таким чином, як нібито кожна окрема публікація або документ були б конкретно та індивідуально призначені до включення шляхом посилання. Згадування публікацій і патентних документів не призначене для визнання того, що будь-який з них належить до відомого рівня техніки, і не представляє жодного визнання щодо їх вмісту або дати публікації. Після наведення письмового опису цього винаходу, фахівцям у цій галузі буде зрозуміло, що цей винахід може бути практично втіленим цілим рядом варіантів здійснення і що вищенаведений опис і наведені нижче приклади мають ілюстративне призначення, а не обмеження формули винаходу, що додається. Приклади Наведені нижче приклади, у тому числі проведені експерименти і одержані результати, наведені виключно з ілюстративною метою і не повинні розглядатись як такі, що обмежують обсяг цього винаходу. 57 Приклад 1: Одержання huCD3 антитіл Стратегія імунізації: Для одержання повністю людського huCD3 антитіла застосовували дві лінії трансгенних мишей, лінію мишей HuMab® і лінію мишей KM™ (Medarex, Princeton, штат НьюДжерсі). Стратегія початкової імунізації відповідала добре розробленим методикам із літературних джерел для одержання мишачих антитіл. (Дивись, наприклад, Кунг П. (Kung P.) та інші, Science; 206 (4416):347-349 (1979); Кунг П.К. (Kung P.C.) та інші, Transplant. Рroc. (3 Suppl. 1):141-146 (1980); Кунг П.К. (Kung P.C.) та інші, Int. J. Immunopharmacol, 3 (3):175-181 (1981)). За стандартними методиками, відомими у цій галузі, одержати повністю людські анти-СD3 антитіла у мишах ліній HuMab® та КМ™ не вдалось. Наприклад, наведені нижче стратегії імунізації були невдалими і не дозволили одержати функціональних антитіл ні у мишах лінії HuMab®, ні у мишах лінії KM™: - імунізація лише тимоцитами або лише Тклітинами; - імунізація лише рекомбінантним людським CD3 матеріалом; - імунізація рекомбінантним CD3 матеріалом у ад'юванті Фрейнда; - імунізація клітиною у ад'юванті Фрейнда; - імунізація тимоцитами або Т-клітинами з одночасним введенням розчинного CD3; - імунізація тимоцитами або Т-клітинами з одночасним введенням рекомбінантних клітин, що експресують CD3. Наслідком застосування цих стратегій імунізації, відомих у цій галузі техніки, на мишах лінії BALB/c, а не на мишах ліній HuMab® або KM™, є продукування мишачого анти-СD3 антитіла, а не людського анти-СD3 антитіла. Відповідно, шляхом зміни наведених нижче параметрів були розроблені нові стратегії імунізації: - типи застосованих імуногенів; - частота ін'єкцій; - типи застосованих ад'ювантів; - типи застосованих методів одночасного стимулювання; - застосовані шляхи імунізації; - типи вторинної лімфоїдної тканини, застосовані для злиття. Було розроблено ряд нових стратегій імунізації, у тому числі, наприклад, (і) імунізація вірусними частинками, що експресують лише CD3, та (іі) імунізація співстимуляторними сигналами (наприклад, CD40, CD27 або їх комбінаціями), введеними одночасно з Т-клітинами, тимоцитами або з клітинами, які були трансфіковані для експресії рекомбінантного CD3. За першою новою стратегією імунізації, яку у цьому описі називають "методикою гіпербустерін'єкцій", мишей лінії HuMab® (фірма Medarex, Inc., Princeton, штат Нью-Джерсі) або мишей лінії KM™ (фірма Medarex, Inc., Kirin) спочатку імунізували шляхом введення людських клітин, наприклад, тимоцитів або Т-клітин. У часових точках у межах 1-8 тижнів після ін'єкції тимоцитів та/або Т-клітин, миші одержували одну або декілька подальших "гіпербустер"-ін'єкцій. Згадана гіпербустер-ін'єкція 94211 58 включала, наприклад, розчинний CD3 білок (наприклад, рекомбінантний розчинний CD3 білок), додаткові ін'єкції тимоцитів або Т-клітин, СD3трансфікованих клітин, вірусних частинок, що експресують високі рівні CD3 та їх комбінації. Наприклад, гіпербустер-ін'єкція включала комбінацію розчинного CD3 білка і СD3-трансфікованих клітин. Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, за методиками гіпербустер-імунізації, імунізовані миші одержували дві завершувальні гіпербустерн-ін'єкції за -6 днів і -3 дні до злиття лімфатичних вузлів та/або селезінки. Наприклад, у мишей лінії KM™ злиту тканину одержують із селезінки, а у мишей лінії HuMab® злиту тканину одержують із лімфатичних вузлів та/або тканини селезінки. За одним із прикладів методики гіпербустерімунізації, одну мишу лінії HuMab® тричі імунізували людськими тимоцитами (~106 клітин) у 0 день, 7 день та 28 день. Після цього, на 47 день і 65 день, здійснювали ін'єкцію лінії клітин яєчнику китайського хом'ячка (СНО), трансфікованих кДНК, що кодує  і ε ланцюги людського CD3(CHO/CD3, ~106 клітин). Іншу бустер-ін'єкцію вірусних частинок, що експресують високі рівні CD3 ε на своїй поверхні, здійснювали на 79 день. І, нарешті, згадана миша одержувала ін'єкцію розчинного рекомбінантного людського CD3 ε на 121 день, на 124 день і, перед злиттям лімфовузлів, на 127 день. Усі ін'єкції здійснювали підшкірним шляхом із застосуванням Ribi (фірма Соrіха Соrp., Seattle, штат Вашингтон) як ад'ювант. Відбулось злиття у цілому 8,5×106 клітин. Лише сім із 470 перевірених гібридом продукували повністю людське анти-СD3 антитіло, і усі зі згаданих людських анти-СD3 антитіл являли собою молекули IgM. Два із цих антиСD3 антитіл були відібрані як терапевтичні клінічні кандидати (Фіг.1-3). За другим прикладом методики гіпербустерімунізації, одну мишу лінії KM™ двічі імунізували розчинним рекомбінантним людським CD3 ε на 0 день і 25 день. Після цього, для бустер-ін'єкцій на 40 день, 49 день і 56 день застосовували людські тимоцити (~106 клітин). Ін'єкції розчинного рекомбінантного CD3 ε здійснювали двічі на 70 день, 77 день, 84 день і 91 день. На 98 день здійснювали ін'єкцію лінії мишачих Т-клітин, трансфікованих кДНК, що кодує δ і ε ланцюги людського CD3 (EL4/CD3, ~106 клітин). І, нарешті, згадана миша одержувала ін'єкцію розчинного рекомбінантного людського CD3 ε на 101 день і, перед злиттям селезінки, на 104 день. Імунізацію здійснювали внутрішньоочеревинним шляхом із застосуванням галуну як ад'юванту, за виключенням 70 дня, коли застосовували ад'ювант Ribi. CpG застосовували як співстимуляторний засіб на Одень, 25 день, 84 день і 91 день. Відбулось злиття у цілому 1,27×108 клітин. Лише п'ять із 743 перевірених гібридом продукували повністю людське анти-CD3 антитіло і усі продуковані антитіла являли собою молекули IgG. Одне повністю людське анти-СD3 антитіло відібрали як терапевтичний клінічний кандидат (Фіг.4). 59 Критерії вибору. Терапевтичні клінічні кандидати були відібрані за наведеними нижче критеріями. По-перше, аналізували зв'язування антитіла з СD3-позитивними клітинами, порівняно з СD3негативними клітинами. Для цього СD3-позитивні клітини лінії Jurkat (J+) і негативні клітини лінії Jurkat (J-) інкубували з різними антитілами і зв'язування визначали засобами протокової цитометрії (Фіг.9А). По-друге, здійснювали конкурентний аналіз з оцінкою здатності згаданого антитілакандидата до пригнічення зв'язування мишачого анти-людського моноклонального антитіла ОKТ3 з CD3-позитивними клітинами із застосуванням J+ клітин, і рівень конкуренції оцінювали за допомогою протокової цитометрії (Фіг.9В). Далі, засобами протокової цитометрії оцінювали антигенну модуляцію CD3 і TcR з поверхні Т-клітин людської периферичної кровоносної системи (Фіг.9С). І, нарешті, здійснювали аналіз проліферації Т-клітин із застосуванням Т-клітин людської периферичної кровоносної системи, забарвлених CFSE (флуоресцеїном). Поділ клітин оцінювали за допомогою протокової цитометрії (Фіг.9D). Приклад 2: Переключення ізотипу людських анти-СD3 антитіл Деякі з huCD3 антитіл, одержаних за новими методиками, опис яких наведено у Прикладі 1, являли собою IgM антитіла. Ці IgM антитіла "перетворювали" на IgG антитіло, відповідно до варіанта, якому віддається перевага, на IgGl антитіло. Наприклад, IgM антитіла перетворювали за допомогою методики клонування, за якою VDJ ділянку гена, що кодує IgM антитіло, клонували до гена важкого ланцюга IgGl, який одержали з вектора, що містить ген, який кодує алотип F гамма 1. Для перетворення легкого ланцюга, послідовність IgM клонували до вектора, що містить каппа ділянку. У мишах фірми Medarex, наприклад, мишах лінії HuMab®, продукують численні легкі ланцюги завдяки відсутності алельного виключення. Кожну комбінацію важких і легких ланцюгів трансфікували до клітин 293Т за допомогою трансфекційного агента FuGENE 6 (фірма Roche Diagnostics) за інструкціями виробника. Секретовані моноклональні антитіла перевіряли на оптимізовану функціональність, наприклад, зв'язування антигену-мішені, із застосуванням критеріїв відбору, опис яких наведено у Прикладі 1. Приклад 3: Антигенна модуляція із застосуванням huCD3 антитіл huCD3 антитіла за цим винаходом є здатними до антигенної модуляції, яка визначається як перерозподіл та видалення комплексу CD3-TCR, індукованого зв'язуванням антитіла. Поверхневоклітинна експресія інших молекул на Т-клітинах, у тому числі, наприклад, CD4, у разі піддання дії анти-CD3 антитіла за цим винаходом не змінюється (Фіг.9С). Приклад 4: Зниження синдрому вивільнення токсичних цитокінів, що викликається huCD3 антитілами Відповідно до варіанта, якому віддається перевага, huCD3 антитіла за цим винаходом включають мутацію на Fc-ділянці, завдяки чому згадана мутація змінює синдром вивільнення цитокінів 94211 60 (CRS). Як описувалось вище, синдром вивільнення цитокінів (CRS) є поширеним безпосереднім ускладненням, яке спостерігається у разі застосування анти-Т-клітинного антитіла, наприклад, ATG (антитимоцитарного глобуліну) та ОKТ3 (мишачого антилюдського CD3 антитіла). Цей синдром характеризується надмірним вивільненням таких цитокінів, як TNF, -IFN та IL-2, до кровообігу. Вивільнення цитокінів активованими Т-клітинами викликає тип системної запальної реакції, подібної до реакції, яка спостерігається у разі тяжкої інфекції, яка характеризується гіпотензією, гіпертермією та ригідністю. Симптоми CRS включають, наприклад,пропасницю, озноб, нудоту, блювання, гіпотензію та задишку. huCD3 антитіла за цим винаходом включають одну або декілька мутацій, які запобігають опосередкованому константною ділянкою важкого ланцюга вивільненню одного або декількох цитокінів in vivo. За одним із варіантів здійснення, huCD3 антитіла за цим винаходом являють собою молекули IgG, що мають одну або декілька з наведених нижче мутацій у модифікованому каркасі IgG 1: "1Ν297Α", де залишок аспарагіну у положенні 297 замінено на залишок аланіну; "1L234/A, L235/A", де залишки лейцину у положеннях 234 і 235 замінені на залишки аланіну; "1L234/A; L235/E", де залишок лейцину у положенні 234 замінено на залишок аланіну, у той час як залишок лейцину у положенні 235 замінено на залишок глутамінової кислоти; "1L235/E", де залишок лейцину у положенні 235 замінено на залишок глутамінової кислоти; і "1D265/А", де залишок аспарагінової кислоти у положенні 265 замінено на залишок аланіну. Номенклатура залишків важкого ланцюга, наведена у цьому описі, відповідає номенклатурі Індексу Європейського Союзу (дивись. Кебот (Kabat) та інші, "Proteins of Immunological Interest''', US Dept. of Health & Human Services (1983)), як показано, наприклад, у патентах США №5,624,821 та №5,648,260, які у повному обсязі включено до цього опису шляхом посилання. Інші модифікації каркасу IgG 1, які можуть бути застосовані у huCD3 антитілах за цим винаходом, включають, наприклад, "A330/S", де залишок аланіну у положенні 330 замінено на залишок серину та/або "P331/S", де залишок проліну у положенні 331 замінено на залишок серину. Повністю людські CD3 антитіла за цим винаходом, що мають мутацію L234L235A234E235 на Fcділянці, мають унікальну функцію - припинення вивільнення цитокінів у присутності huCD3 антитіла. Попередні дослідження фактично продемонстрували необхідність виключення застосування мутації LE (дивись, наприклад, Key (Xu) та інші, Cellular Immunology, 200, стор.16-26 (2000), на стор.23). Однак, ці дві конкретні мутації у положеннях 234 і 235 (тобто L234L235A234E235) ліквідують синдром вивільнення цитокінів, як встановлено за допомогою in vitro аналітичної системи із застосуванням мононуклеарів периферичної системи кровообігу людини (Фіг.11А, Фіг.11В). Під час проведення цього аналізу, мононуклеари периферичної системи кровообігу людини виділяли за