Нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок

1. Синтезований полінуклеотид, що кодує інсектицидний білок, який включає амінокислоти 10-600 послідовності SEQ ID NO: 2. 2. Синтезований полінуклеотид за п. 1, вибраний з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей SEQ ID NO: 1 і SEQ ID NO: 3. 3. Синтезований полінуклеотид за п. 2 для експресії відповідного інсектицидного білка в сільськогосподарських культурах. 4. Синтезований полінуклеотид за п. 3, де сільськогосподарська культура вибрана з групи, що складається з однодольних і дводольних рослин. 5. Синтезований полінуклеотид за п. 4, де однодольна рослина вибрана з групи, що включає кукурудзу, пшеницю, овес, рис, сорго, гречку, жито, вівсяницю, тимофіївку лугову, стоколос, грястицю збірну, августинову траву, свинорий пальчастий, польовицю і ячмінь. 6. Синтезований полінуклеотид за п. 4, де дводольна рослина вибрана з групи, що складається з люцерни, яблуні, абрикоси, спаржі, квасолі, кави, ожини, чорниці, каноли, моркви, цвітної капусти, селери, вишні, нуту, цитрусових, бавовнику, вигни китайської, журавлини, огірка, гарбуза, баклажана, 2 (19) 1 3 12. Експресійна касета за п. 9, де клітина-хазяїн являє собою клітину рослини, і вказана експресійна касета додатково містить полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з енхансерної послідовності експресії, нетрансльованої лідерної послідовності, інтронної послідовності, послідовності, що кодує хлоропласттаргетувальний пептид, а також сигналів термінації транскрипції і поліаденілювання. 13. Експресійна касета за п. 12, що містить полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з послідовності SEQ ID NO: 5 і SEQ ID NO: 7. 14. Вектор, що містить експресійну касету за будьяким з пп. 9-12. 15. Трансгенна рослина або її рослинна клітина, де рослина стійка до зараження лускокрилими комахами, що включає полінуклеотидну послідовність, що кодує білок, який включає амінокислоти 10-600 послідовності SEQ ID NO: 2, який має інсектицидну активність, будучи експресованим в цій рослині або клітині. 16. Трансгенна рослина або її рослинна клітина за п. 15, де трансгенна рослина вибрана з групи, що складається з однодольних і дводольних рослин, де дводольні рослини вибрані з групи, що складається з люцерни, яблуні, абрикоси, спаржі, квасолі, кави, ожини, чорниці, каноли, моркви, цвітної капусти, селери, вишні, нуту, цитрусових, бавовнику, вигни китайської, журавлини, огірка, гарбуза, баклажана, плодових дерев, винограду, лимона, салату-латуку, льону, дині, гірчиці, горіхоплідних дерев, бамії, окри, апельсина, гороху, персика, арахісу, груші, сливи, картоплі, сої, великоплідного гарбуза, суниці, цукрового буряка, соняшника, батату, тютюну, томата, ріпи і інших овочів, а однодольні рослини вибрані з групи, що складається з кукурудзи, пшениці, вівса, рису, сорго, гречки, жита, вівсяниці, тимофіївки лугової, стоколосу, грястиці збірної, августинової трави, свинорию пальчастого, польовиці і ячменю. 17. Трансгенна рослина або її рослинна клітина за п. 16, де трансгенна рослина стійка до зараження лускокрилими комахами, вибраними з групи, що складається з листовійок, гусениць озимої совки, "похідних черв'яків", точильників, мішечниці поденкоподібної і кормових гусениць. 18. Трансгенна рослина або її рослинна клітина за п. 17, де трансгенна рослина стійка до зараження лускокрилими комахами, вибраними з групи, що складається з совки трав'яної, метелика стеблового кукурудзяного, гусениці совки бавовняної американської і вогнівки кукурудзяної південнозахідної. 19. Потомство або насіння трансгенної рослини або її рослинної клітини за п. 16, де вказане потомство або насіння містить полінуклеотид, що кодує білок, який включає амінокислоти 10-600 послідовності SEQ ID NO: 2. 20. Спосіб боротьби з лускокрилими комахамишкідниками рослин, що включає поїдання комахами одного або більше типів рослинних клітин, трансформованих нуклеїновою кислотою, що містить функціональний в рослинах промотор, оперативно зв'язаний з полінуклеотидом, що кодує білок, який включає амінокислоти 10-600 послідовності SEQ 96421 4 ID NO: 2, що демонструє інсектицидну активність відносно лускокрилих комах-шкідників. 21. Синтезований полінуклеотид, що кодує інсектицидний білок, який включає амінокислоти від 1 до 612 послідовності SEQ ID NO: 2. 22. Синтезований полінуклеотид, що кодує інсектицидний білок, який складається з амінокислот від 1 до 610 послідовності SEQ ID NO: 2. 23. Гібридний інсектицидний білок, що містить амінокислотний сегмент, який включає щонайменше 500 амінокислот, що становлять безперервну послідовність в складі сегмента, що складається з амінокислот в положенні від 10 до 600 послідовності SEQ ID NO: 2. 24. Композиція, що містить інсектицидно ефективні кількості білка Cry1A.105, що включає амінокислоти в положенні від 10 до 600 послідовності SEQ ID NO: 2, де вказана композиція вибрана з групи, що складається з рослинної клітини, бактеріальної клітини, клітини грибів, колоїдів, емульсії, насіння з покриттям, приманки і порошку. 25. Композиція за п. 24, де білок Cry1A.105 міститься в кількості від 0,5 до 200 частин на мільйон (PPM). 26. Композиція за п. 25, в якій білок Cry1A.105 міститься в кількості від 0,5 до 20 PPM. 27. Композиція за п. 25, що являє собою рослинну клітину або групу рослинних клітин. 28. Композиція за п. 27, в якій полінуклеотид, що кодує білок Cry1A.105, експресований в інсектицидно ефективних кількостях, присутній в кількості, яку можна виявити за допомогою зонда, послідовність якого являє собою сегмент SEQ ID NO: 1 з нуклеотидами в положенні 1401-1420 або сегмент SEQ ID NO: 1 з нуклеотидами в положенні 1821-1840, або послідовності, комплементарні цим сегментам. 29. Композиція за п. 27, в якій інсектицидно ефективна кількість вказаного білка при поїданні лускокрилими комахами-шкідниками достатня для контролю чисельності останніх; при цьому лускокрилі комахи-шкідники вибрані з групи, що складається з родів Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Epinotia і Armigera. 30. Спосіб захисту засіяної в полі сільськогосподарської культури від зараження лускокрилими комахами, що включає надання трансгенної культури, що експресує інсектицидно ефективну кількість інсектицидного білка Cry1A.105, який потрапляє в їжу лускокрилих комах, таким чином знижуючи виживаність цих комах на поверхні трансгенної рослини; при цьому інсектицидний білок Cry1A.105 включає амінокислоти в положенні від 10 до 600 послідовності SEQ ID NO: 2. 31. Спосіб за п. 30, в якому трансгенна рослинна культура додатково містить інший інсектицидний агент, токсичний відносно тих же видів комах, що і Cry1A.105, і вибраний з групи, що складається з токсинів бактерій родів Bacillus, Xenorhabdus і Photorhabdus toxin, і дволанцюжкової РНК, яка специфічно супресує один або більше генів, необхідних для виживання вказаних видів комах. 32. Спосіб за п. 30 або 31, в результаті застосування якого урожай вказаної культури перевищує 5 96421 6 такий, зібраний з ізогенної культури, позбавленої вказаного(их) інсектицидного(их) агента(ів). 33. Спосіб за п. 30, в якому інший інсектицидний агент являє собою токсин бактерій родів Bacillus, вибраний з групи білків, що складається з токсинів Cry1, Cry2, Cry5, Cry9 і білка VIP. 34. Спосіб затримки розвитку стійкості у лускокрилих комах до інсектицидів, що включає надання комахам першого інсектицидного білка Cry1A.105 і щонайменше другого інсектицидного білка, відмінного від першого, де вказаний перший інсектицидний білок включає щонайменше 500 амінокислот, що становлять безперервну послідовність в складі сегмента, що складається з амінокислот в положенні від 10 до 600 послідовності SEQ ID NO: 2, і де другий інсектицидний білок вибраний з групи, що складається з токсинів Cry1, Cry2, Cry5, Cry9 і білка VIP. Попередній рівень техніки Даний винахід стосується нових кодуючих послідовностей для використання в рослинах. Дані послідовності кодують химерний білок-інсектицид, токсичний для широкого видового спектра лускокрилих паразитів зернових культур. Протягом довгого часу для біологічного контролю за чисельністю сільськогосподарських комах-шкідників використовувалися комерційно доступні препарати природних штамів В. thuringiensis. Спори Bacillus thuringiensis, а також кристалічні продукти ферментації цих бактерій, у вигляді концентрованих препаратів використовуються для обробки листя рослин відповідно до прийнятої сільськогосподарської практики. Кристалічні білки сімейства Cry1 відомі своєї біоактивністю проти личинок лускокрилих комах і застосовуються як агенти для контролю за чисельністю лускокрилих комах-шкідників. Прекурсорна форма Cry1 -ендотоксину складається з двох приблизно рівних по розміру сегментів. С-кінцева частина прекурсорної форми, або про-токсичний сегмент, стабілізує кристалічну структуру і не має інсектицидної активності. N-кінцева частина прекурсора містить токсичний сегмент білка Cry1, який на основі множинного вирівнювання консервативних або практично консервативних послідовностей даних сегментів у різних членів сімейства Cry1, може бути розділений на три структурних домени. Основою для розділення цих трьох субдоменів служить тривимірна кристалографічна структурна модель Cry1 A -ендотоксину, три субдомени якого позначаються як домен І, домен II і домен III (нумерація йде з N-кінця токсичного сегмента білка Cry1). Першу третину активного токсичного сегмента займає домен І, і його наявність є необхідною для утворення каналів (Thompson з співавт., 1995). Домени II і III займають центральну і С-кінцеву частини активного токсичного сегмента, відповідно. Обидва ці домени беруть участь в зв'язуванні з рецепторами і в специфічному видовому розпізнаванні комах, в залежності від конкретних видів комах, що вивчаються і -ендотоксинів (Thompson з співавт., 1995). У тому випадку, якщо химерний білок планується створювати за допомогою довільної комбінації доменних структур різних кристалічних інсектицидних білків, відомих в даній галузі, імовірність того, що отриманий химерний білок буде володіти поліпшеними (в порівнянні з парентальними білками) властивостями, низька. Причиною цього є складність різних аспектів природи білків, таких як структура, фолдінг, олігомеризація і активація, в тому числі правильний протеолітичний процесінг химерного прекурсора (в тому випадку, якщо білок експресується в подібній формі), внаслідок якого повинен виділятися інсектицидний токсиновий сегмент. Таким чином, функціональні химерні інсектицидні токсини, що демонструють підвищену в порівнянні з кожним з парентальних білків інсектицидну активність, можуть бути отримані тільки шляхом ретельного відбору специфічних цільових регіонів кожного з парентальних білків, які надалі мають бути включеними в химерну конструкцію. На практиці, «перетасовування» токсинових доменів, тобто збирання химерного токсину, в якому домени І, II і III різних токсинів, приводить до отримання некристалізованого білка і/або до повної втрати інсектицидної активності по відношенню до переважних видів комахах-шкідників. У деяких випадках химерний токсин демонструє хороші здібності до кристалоутворення, однак позбавлений будь-якої інсектицидної активності. Таким чином, ефективні інсектицидні химерні білки отримують тільки методом проб і помилок, і навіть в цьому випадку цілком кваліфікований фахівець не може бути упевнений, що внаслідок його досліджень він отримає химерний білок, що демонструє інсектицидну активність, еквівалентну або перевищуючу таку для кожного з парентальних токсинів, фрагменти яких були взяті для отримання химерного білка. У літературі описана конструкція або зборка химерних білків з двох або більше кристалічних інсектицидних білків-прекурсорів В. thuringiensis, при цьому не всі з отриманих химер володіють здатністю до кристалоутворення, еквівалентними або, що перевищують такі для парентальних прекурсорних білків, з яких був отриманий химерний конструкт. (Bosch з співавт. (WO95/06730); Thompson з співавт. (WO95/30753); Thompson з співавт. (WO95/30752); Malvar з співавт. (WO98/22595); Gilroy з співавт. (патент США № 5128130); Gilroy (патент США № 5055294); Lee з співавт. (1992) Gene 267:3115-3121; Honee з співавт. (1991) Mol. Microbiol. 5:2799-2806; Schnepf з співавт. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Perlak з співавт. (1990) Bio/Technol. 8:939-9943; Perlak з співавт. (1993) Plant Mol. Biol. 22:313-321). Було показано, що експресія -ендотоксинів В. thuringiensis в трансгенній кукурудзі являє собою ефективний метод контролю за чисельністю посільськогосподарському значущих комахахшкідників (Perlak з співавт. 1990; 1993). Використання трансгенних культур, що експресують ендотоксини В. thuringiensis, дозволяють значно 7 знизити часові і грошові витрати на боротьбу з комахами-шкідниками, пов'язані з топічним використанням хімічних інсектицидів. Використання трансгенів, що кодують -ендотоксини В. thuringiensis, є особливо переважним. Сільськогосподарські культури, експресуючі -ендотоксини В. thuringiensis, засіяні в районах з підвищеною концентрацією комах-шкідників, демонструють кращі урожаї, ніж аналогічні нетрансгенні комерційні сорти. У той же час передбачається, що комахи можуть виробляти резистентність до експресованих в трансгенних рослинах -ендотоксинів В. thuringiensis. Подібна резистентність, за умови широкого поширення, може значно знизити комерційну цінність генів, що містяться в зародковій плазмі, таких як гени, що кодують -ендотоксини В thuringiensis. Одним з способів підвищення ефективності трансгенних інсектицидів проти цільових комах-шкідників, і одночасно - боротьби з появою резистентних до інсектициду комах, є отримання трансгенних рослин, експресуючих великі кількості -ендотоксинів В. thuringiensis (McGaughey і Whalon 1993, Roush 1994). Крім цього, створення єдиної бази даних, в яку занесені гени, що кодують інсектицидні білкові продукти, ефективні проти різних комах-шкідників і здійснюючі свої інсектицидні ефекти різними шляхами, може гарантовано запобігти появі будь-якої резистентності. Іншим способом контролю за розвитком резистентності є експресія в одній рослині двох або більше різних інсектицидних композицій, токсичних для одного і того ж виду комахах, причому кожна композиція експресується на рівні, досить високому для успішної затримки розвитку резистентності. Приклади інсектицидів, які можуть бути використані в подібних комбінаціях, включають в себе без обмеження токсини В. thuringiensis, інсектицидні білки представників родів Xenorhabdus і Photorhabdus, деалергенізовані і деглікозильовані білки пататини і/або пермутеїни, рослинні лектини і т.д. Однак на сьогоднішній момент коекспресія декількох інсектицидноактивних білків в одній рослині і/або досягнення високого рівня експресії цих інсектицидних білків, рослини, що не супроводжуються небажаними морфологічними змінами трансгену, залишаються важкодосяжними. Серед більш двохсот п'ятдесяти ідентифікованих інсектицидних білків Bacillus thuringiensis, усього лише для декількох були зроблені спроби експресії в рослинах. Так, в рослинах були успішно експресовані деякі білки сімейств Cry1, CryЗ, Cry2Аа, Cry2Аb, бінарні токсини Cry33/34 і Cry23/37, а також Cry9. Білки сімейства Cry1 являють собою найбільший клас білків, для якого були зроблені спроби експресії в рослинах, однак ні для одного з них не вдалося досягти експресії на високому рівні. Для того, щоб уникнути небажаних фітотоксичних ефектів, необхідно направити Cry2Аb в хлоропласти. Велика частина подібних рекомбінантних рослин експресує білки Cry1A. Імовірність розвитку резистентності до білків Cry1A може бути значною мірою знижена в тому випадку, якщо разом з cry1-алелем буде експресуватися алель контролю резистентності, або якщо експресія аллелю cry1 буде на високому рівні. Та 96421 8 ким чином, актуальною задачею є розробка альтернативних токсинових генів для експресії в рослинах, призначених для доповнення або заміщення токсинів, що раніше використовувалося в першому і другому поколіннях резистентних до комах трансгенних рослин. Короткий опис суті винаходу Даний винахід стосується виділених нуклеотидних послідовностей, призначених для експресії в рослинах і кодуючих білки, що демонструють інсектицидні властивості по відношенню до лускокрилих комах. SEQ ID NOT являє собою приклад подібної нуклеотидної послідовності; вона складається з гена сrу1A.105 і кодує інсектицидний білок Cry1A.105. Послідовність SEQ ID NO:1 подібна до послідовності SEQ ID NO:3; обидві з них кодують білок Cry1A.105. Послідовність SEQ ID NO:1 переважна для використання в клітинах дводольних рослин, в той час як SEQ ID NO:3 переважна для використання в клітинах однодольних рослин. Амінокислотна послідовність SEQ ID NO:4 кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:3 і ідентична амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2. Передбачається, що виділені нуклеотидні послідовності включають в себе послідовності, щонайменше приблизно на 88-90% ідентичні послідовності SEQ ID NO:1, або такі, що гібридизуються з SEQ ID NO:1 в жорстких умовах. Також передбачається, що виділені нуклеотидні послідовності включають в себе послідовності, щонайменше приблизно на 90% ідентичні послідовності SEQ ID NO:3, або такі, що гібридизуються з SEQ ID NO:3 в жорстких умовах. Винахід також стосується виділених і очищених інсектицидних білків, що володіють інсектицидними властивостями по відношенню до лускокрилих комах. Термін «інсектицидний білок», що використовується в даній заявці стосується білка, що містить щонайменше токсиновий фрагмент Cry1А.105, амінокислотна послідовність якого відповідає послідовності SEQ ID NO:2. Також, термін «інсектицидний білок Cry1А.105» стосується повнорозмірного білка-прекурсора, що складається з приблизно 1177 амінокислот згідно з послідовністю SEQ ID NO:2; в той же час, термін «інсектицидний білок Cry1А.105» також стосується будь-якого фрагмента білка-прекурсора, що демонструє інсектицидну біоактивність; в тому числі даний термін стосується інсектицидного білка Cry1А.105, амінокислотна послідовність якого відповідає сегменту, що складається з від приблизно амінокислоти 1 до приблизно амінокислоти 612 згідно з послідовністю SEQ ID NO:2, а також до сегмента, що складається з від приблизно амінокислоти 2 до приблизно амінокислоти 610 згідно з послідовністю SEQ ID NO:2. Будь-яка композиція, що містить інсектицидно-ефективні кількості інсектицидного білка, включена в об'єм даного винаходу. Даний винахід також стосується експресійної касети для експресії інсектицидного білка, відповідного амінокислотній послідовності SEQ ID NO:2, в клітині-хазяїні. Експресійна касета переважно містить функціональний (у вибраній для експресії клітині-хазяїні) промотор, напряму пов'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує інсектици 9 дний сегмент білка Cry1A.105, і регулюючий експресію цього сегмента. Прикладами експресійних касет можуть служити нуклеотидні послідовності SEQ ID NO:5 і SEQ ID NO:7, призначені для використання в клітинах дводольних і однодольних рослин, відповідно. Промотор і кодуюча послідовність оперативно пов'язані і функціонують разом в клітині-хазяїні. Екпресійна касета призначена для використання в будь-яких клітинах-хазяях, але переважно - в клітинах бактерій, грибів, ссавців або рослин. Бактерійні клітини переважно вибирають з групи, що включає в себе бактерії родів Bacillus, Enterobacteriacae, Pseudomonas, Clostridium, Rhizobium і Agrobacterium. У тому випадку, якщо клітини-хазяї являють собою рослинні клітини, їх переважно вибирають з групи, що включає в себе клітини сільськогосподарських культур, переважно дводольних або однодольних рослин. Прикладами кліток дводольних рослин можуть служити клітини люцерни, яблука, абрикоси, спаржі, квасолі, кави, ожини, чорниці, каноли, моркви, цвітної капусти, селери, вишні, нуту, цитрусових, бавовника, вигни китайської, журавлини, огірка, гарбуза, баклажана, плодових дерев, винограду, лимона, салату-латуку, льону, дині, гірчиці, горіхоплодних дерев, бамії, окри, апельсина, гороху, персика, арахісу, груші, сливи, картоплі, сої, крупноплідного гарбуза, суниці, цукрового буряка, соняшника, батату, тютюну, томата, ріпи і інших овочів. Прикладами клітин однодольних рослин можуть служити клітини кукурудзи, пшениці, вівса, рису, сорго, гречки, жита, злаків (вівсяниця, тимофіївка лугова, стоколос, грястиця збірна, августинова трава, свинорий пальчатий, польовиця) і ячменю. Екпресійні касети, призначені для використання в рослинних клітинах, містять оперативно пов'язані послідовності, регулюючі рівень і ефективність експресії цільового білка, такого як інсектицидний білок Cry1А.105. Подібні послідовності можуть являти собою експресійнний енхансер, нетрансльовану лідерну послідовність, інтрон, послідовність, що кодує пептид, який направляє екпресований білок в хлоропласти, а також сигнали термінації транскрипції і поліаденілювання. Експресійна касета переважно включається до складу вектора для стабілізації персистенції послідовності, що кодує Cry1A.105, в клітині-хазяїні. Вектор може являти собою будь-яку з відомих в даній галузі структур, але в типовому випадку це плазміда або реплікон, в якому конструюється, або в який вставляється експресійна касета перед трансфекцією вектора в клітину-хазяїна. Вектор може являти собою без обмеження плазміду, косміду, ВАС-міду, фагміду, YAC, ВАС, «суїцидний» вектор, інсерційну послідовність, транспозон, або навіть лінійну нуклеотидну послідовність, з якою пов'язана або в яку укладена експресійна касета. В одному з втілень даний винахід стосується трансгенних рослин, стійких до зараження лускокрилими комахами. Подібні рослини містять нуклеотидну послідовність, що кодує інсектицидний білок Cry1A.105, амінокислотна послідовність якого відповідає щонайменше фрагменту послідовності SEQ ID NO:2 (від приблизно амінокислоти 2 до приблизно амінокислоти 612). Використання поді 96421 10 бних трансгенних рослин є ефективним способом боротьби із зараженням лускокрилими комахами, такими як листовійки, гусениці озимої совки, «похідні черв'яки», точильники, мішечниця поденкоподібна і кормові гусениці. Переважними паразитами є совка трав'яна, метелик стеблевий кукурудзяний, гусениця совки бавовняної американської, огнівка кукурудзяна південно-західна, а також совкаіпсилон. Об'єм даного винаходу також включає в себе потомство, а також насіння, фруктові плоди і продукти, що отримується з трансгенних рослин згідно з даним винаходом, в тому випадку, якщо кодуючий інсектицидний білок Cry1A.105 нуклеотидна послідовність згідно з даним винаходом міститься в складі геномної або пластидної ДНК рослини, її потомства, насіння і т.д. Даний винахід також стосується способів боротьби із зараженням рослин лускокрилими комахами-шкідниками, що має на увазі годування комах композицією, що містить інсектицидноефективну кількість інсектицидного білка Cry1A.105. Одним з варіантів подібної композиції можуть бути рослинні клітини, отримані з (або що є потомством) рослинної клітини, трансформованої нуклеотидною послідовністю, що кодує інсектицидний сегмент амінокислотної послідовності Cry1A.105 згідно SEQ ID NO:2. Одним з джерел подібної інсектицидної композиції може бути трансгенна рослина, отримана з трансформованої рослинної клітини, що містить експресійнну касету, подібну до послідовностей SEQ ID NO:5 і SEQ DD NO:7.Іншим способом доставки подібної інсектицидної композиції може бути експресія інсектицидно-ефективної кількості Cry1A.105 в клітинах бактерій або грибів з подальшим годуванням цих клітин, їх гомогенатів або очищеного білка Cry1A.105, цільових комах-шкідників, сприйнятливих до інсектицидної дії Cry1A.105. Даний винахід також стосується способу ідентифікації нуклеотидної послідовності, що кодує амінокислотну послідовність Cry1A.105, в біологічній пробі. Даний спосіб має на увазі приведення проби, що тестується на наявність кодуючої послідовності Cry1A.105, в контакт з полінуклеотидним зондом, що специфічно зв'язується з кодуючою послідовністю Cry1A.105. Зокрема, послідовність зонд зв'язується, або гібридизується, з кодуючою послідовністю Cry1A.105 в жорстких гібридизаційних умовах. Детекція зв'язування в реакційній суміші є діагностичною відносно присутності кодуючої послідовності Cry1A.105. Даний винахід також стосується способу ідентифікації інсектицидного білкового фрагмента Cry1A.105. Даний спосіб має на увазі приведення проби, що тестується на наявність інсектицидного білкового фрагмента Cry1A.105, в контакт з антитілом, що специфічно зв'язується з інсектицидним білковим фрагментом Cry1A.105. Детекція зв'язування в реакційній суміші є діагностичною відносно присутності інсектицидного білкового фрагмента Cry1A.105. Даний винахід також стосується химерних або гібридних інсектицидних білків. Подібні гібриди складаються з двох або більше різних інсектицид 11 них білків, кожний з яких володіє інсектицидною активністю по відношенню щонайменше до одного виду комах, що належать до однієї і тієї ж групи. Гібридні інсектицидні білки конструюються з частин різних інсектицидних білків. Сегменти інсектицидних білків, що використовуються для конструювання гібридів, складаються щонайменше з приблизно від 50 до щонайменше приблизно 200 амінокислот, що утворюють безперервну послідовність в складі безперервної амінокислотної послідовності будь-якого з інсектицидних білків. Інсектицидний білок Cry1A.105, амінокислотна послідовність якого відповідає сегменту з приблизно 2-ої по приблизно 612-у амінокислоту в послідовності SEQ ID NO:2 входить до складу групи різних інсектицидних білків, кожний з яких може бути вибраний як сегмент для конструювання гібридного інсектицидного білка. Різні переваги, особливості і суть даного винаходу стануть більш очевидні з нижченаведеного докладного опису винаходу, прикладів і формули винаходу. Короткий опис послідовностей SEQ ID NO:1 являє собою синтетичну нуклеотидну послідовність для експресії інсектицидного білка Cry1А.105, переважно в дводольних рослинах. SEQ ID NO:2 являє собою амінокислотну послідовність білка Cry1A.105, що кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3 являє собою синтетичну нуклеотидну послідовність для експресії інсектицидного білка Cry1A.105, переважно в однодольних рослинах. SEQ ID NO:4 являє собою амінокислотну послідовність білка Cry1A.105, що кодується нуклеотидною послідовністю SEQ ID NO:3. SEQ ID NO:5 являє собою нуклеотидну послідовність, що складається з експресійної касети, яка функціонує в рослинних клітинах, переважно в клітинах дводольних рослин, призначену для експресії інсектицидного білка Cry1A.105. SEQ ID NO:6 являє собою амінокислотну послідовність білка Cry1A.105, що кодується кодуючим сегментом експресійної касети SEQ ID NO:5. SEQ ID NO:7 являє собою нуклеотидну послідовність, що складається з експресійної касети, що функціонує в рослинних клітинах, переважно в клітинах однодольних рослин, призначену для експресії інсектицидного білка Cry1A.105. SEQ ID NO:8 являє собою амінокислотну послідовність інсектицидного білка Cry1A.105, що кодується кодуючим сегментом експресійної касети SEQ ID NO:7. Докладний опис винаходу Згідно з даним винаходом автори сконструювали нуклеотидну послідовність, що кодує новий інсектицидний білок Cry1A.105. Було показано, що амінокислотна послідовність білка Cry1A.105 згідно SEQ ID NO:2 володіє поліпшеними властивостями в порівнянні з природними інсектицидними білками В. thuringiensis, токсичними по відношенню до лускокрилих комах. Зокрема, білок Cry1A.105 може бути експресований на високому рівні як в однодольних, так і в дводольних росли 96421 12 нах без характерних для трансгенозу фітотоксичних ефектів, виникаючих як результат підвищеного в порівнянні з природним рівня експресії білків Cry1. Крім цього, при експресії в Bacillus thuringiensis, білок Cry1A.105 формує стабільні кристали, мабуть, через стабілізуючий ефект протоксинового сегмента Cry1Ac, пов'язаний з токсиновим фрагментом в складі химерного білка Cry1A.105. Крім цього, інсектицидний білок Cry1A.105 володіє діапазоном різної біологічної активності по відношенню до лускокрилих комах, які не були знайдені в інших природних білків Cry1, ідентифікованих до теперішнього часу. Таким чином, експресія білка Cry1A.105 в трансгенних рослинах приводить до збільшення числа морфологічно нормальних трансгенних рослин, експресуючих підвищені рівні аналога токсину Cry1, що демонструє широкий діапазон засобів контролю за чисельністю лускокрилих комахшкідників в будь-якій трансгенній рослині, вибраній для подальшого комерційного впровадження. Використання подібних трансгенних рослин може привести до затримки розвитку резистентності до аналога токсину Cry1A, а у випадку комбінованого використання з другим токсином, який є токсичним по відношенню до одного або більше видів комахшкідників, по відношенню до яких аналог токсину Cry1A також є токсичним, і в тому випадку, якщо ці два токсини здійснюють свою інсектицидну дію різними шляхами, імовірність розвитку резистентності до будь-якого з двох токсинів надто мала. Автори даного винаходу сконструювали щонайменше дві різних нуклеотидних послідовності для використання в рослинах, при цьому обидві послідовності кодують один і той же білок Cry1A.105. Перші (або амінокінцеві) приблизно дві третини інсектицидного фрагмента білка Cry1A.105 складаються з амінокислотної послідовності Cry1Ab. Ця послідовність пов'язана з Скінцем токсиновой частини і фрагментом протоксинового домену інсектицидного білка Cry1, отриманого з штаму aizawai EG6346 В. thuringiensis (Ecogen) (Chambers з співавт., 1991, J. Bacteriol. 173:3966-3976). Токсиновий сегмент Cry1A.105 далі пов'язаний з сегментом, значну частину якого займає пептидна послідовність протоксину Cry1Ac. Автори даного винаходу продемонстрували, що дана конструкція кодує унікальну амінокислотну послідовність, яка демонструє несподівано поліпшені інсектицидні властивості в порівнянні з такими для парентальних білків, з яких була отримана химера. Крім цього, прекурсорний білок Cry1A.105 володіє прекрасними кристалоутворювальними властивостями і ефективно розчиняється і процесується в активну токсинову форму в кишечнику цільових лускокрилих комах-шкідників. Нуклеотидні послідовності, що становлять різні втілення даного винаходу, були сконструйовані за допомогою способів, описаних в патентах США № 5500365 і 5689052, зокрема - при їх конструкції уникали використання деяких підпослідовностей в кодуючому регіоні, які інтерферують з експресією гетерологічних генних послідовностей в клітинах рослин. Сегмент, що кодує токсиновий фрагмент білка Cry1A.105, складається з нуклеотидів в по 13 ложенні від приблизно 1 до приблизно 1830 (або може мати дещо більшу або меншу довжину) послідовностей SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3. Послідовність SEQ ID NO:1 була сконструйована для використання в дводольних рослинах, зокрема - в бавовнику. Послідовність SEQ ID NO:3 була сконструйована для використання в однодольних рослинах, зокрема - в кукурудзі. Нуклеотидні послідовності, що складають предмет даного винаходу, гомологичні одна по відношенню до іншої на 94,3% і ідентичні одна одній в області положень нуклеотидів від приблизно 1330 до приблизно 3534. Сегменти в області положень нуклеотидів від приблизно 1 до приблизно 1830 ідентичні один одному приблизно на 88,9%. Сегменти, що кодують перші два домени білка Cry1A.105, характеризуються значно меншою взаємною гомологією ідентичність складає близько 84,7% один по відношенню до іншого. Автори даного винаходу конструювали трансгенні рослини за допомогою описаних вище послідовностей. SEQ ID NO:1 вводили в плазмідний вектор, що містить екпресійну касету, що складається з посиленого промотору вірусу норичникової мозаїки (eFMV), оперативно пов'язаного з нетрансльованою лідерною послідовністю гена Hsp70 Petunia hybrida (Ph.Hsp70, DnaK), кодуючою послідовністю хлоропласт-таргетиувального пептиду малої субодиниці рибулозо-біс-фосфат-карбоксилази Arabidopsis thaliana, а також сигналами термінації транскрипції і поліаденілювання гена рибулозо-бісфосфат-карбоксилази Е9 Pisum sativum. Кодуючу послідовність Cry1A.105, згідно SEQ ID NO:1, вставляли в експресійну касету у відкритій рамці зчитування безпосередньо впритул до 3'-кінця кодуючої послідовності хлоропласттаргетувального пептиду, з 5'-кінця по відношенню до сигналу термінації трансляції Е9. Нуклеотидна послідовність отриманої експресійної касети наведена в SEQ ID NO:5. Сегмент вектора, що містить експресійну касету Cry1А.105 і пов'язаний з другою експресійною касетою, що містить рослинноекспресований GUS-маркер, вирізали і використали для трансгенозу, який здійснювали за допомогою біолістичних методів. Отримані продукти трансгенозу тестували на наявність інсектицидної активності по відношенню до декількох видів лускокрилих комах-шкідників; було показано, що продукти трансгенозу володіють значно кращими характеристиками контролю за чисельністю комах в порівнянні з раніше отриманим резистентним до зараження комахами бавовником, що містить тільки Cry1Ac або комбінацію білків Cry1Ac і Cry2Аb. Крім цього, деякі продукти трансгенозу демонстрували накопичення білка Cry1A.105, що складає більше 10-20 частин на мільйон за один вегетаційний період; подібне накопичення також мало місце в насіннєвих коробочках бавовника, при цьому не було виявлено ніяких фітотоксичних ефектів на рослину або репродуктивні тканини. Отримані продукти трансгенозу значно відрізнялися від протестованих раніше продуктів, що містять інші білки Cry1, акумуляція яких становила менше приблизно 10 частин на мільйон, незалежно від того, чи тар 96421 14 гетувався продукт експресії в хлоропласти чи ні. Крім цього, при тестуванні інших білків Cry1 в бавовнику, особливо якщо рівень накопичення трансгенного білка становив більше приблизно 10 частин на мільйон, були зареєстровані різні фітотоксичні ефекти. SEQ ID NO:3 вводили в плазмідний вектор, що містить екпресійну касету, що складається з посиленого промотору вірусу мозаїки цвітної капусти (eCaMV), оперативно пов'язаного з нетрансльованою лідерною послідовністю гена хлорофіл-а/bзв'язуючого білка Triticum aestivum, інтронною послідовністю гена актину Oryza sativa, а також сигналами термінації трансляції і поліаденілювання гена hsp17. Кодуючу послідовність Cry1A.105 згідно з SEQ ID NO:3 вставляли в експресійну касету безпосередньо впритул до 3'-кінця інтрону, з 5'кінця по відношенню до сигналу термінації трансляції. Нуклеотидна послідовність отриманої експресійної касети приведена в SEQ ID NO:7. Вектор також містить ген стійкості до гербіциду гліфосату, який служить як селекційний маркер для відбору тих клітин або рослин, в яких сталася трансгенна подія. Продукти трансгенозу кукурудзи, відібрані після трансформації експресійною касетою Cry1A.105, тестували на наявність інсектицидної активності по відношенню до декількох видів лускокрилих комах-шкідників; було показано, що продукти трансгенозу володіють широким спектром інсектицидних властивостей, нехарактерних для трансформантів, отриманих з використанням інших інсектицидних білків таких як В. thuringiensis. Демонстрована експресуючими інсектицидні кількості білка Cry1A.105 продуктами трансгенозу кукурудзи інсектицидна активність по відношенню до совки трав'яної і совки-іпсилон сумарно з інсектицидної активністю Cry1A.105 по відношенню до совки бавовняної і точильника зернового розширює спектр інсектицидної активності Cry1Ab, що демонструється продуктами трансгенозу Cry1A.105. Нуклеотидні послідовності згідно з даним винаходом є лише прикладами. Інші нуклеотидні послідовності також можуть бути використані для екпресії інсектицидного білка Cry1A.105 в рослинних клітинах, або їх дизайн може бути проведений таким чином, щоб забезпечити експресію Cry1A.105 в інших типах клітин-хазяїв. Без обмеження об'єму розкритого винаходу, нуклеотидна послідовність для екпресії інсектицидного фрагмента Cry1A.105 щонайменше приблизно на 85%, щонайменше приблизно на 90%, щонайменше приблизно на 95% або щонайменше приблизно на 99% ідентична ілюстративним послідовностям згідно з даним винаходом. Інші нуклеотидні послідовності, призначені для експресії інсектицидного фрагмента Cry1A.105 в нерослинних клітинаххазяях, можуть демонструвати будь-який процент гомології або ідентичності з модельними послідовностями згідно з даним винаходом. Нуклеотидні послідовності можуть варіюватися внаслідок виродженості генетичного коду; таким чином, можна синтезувати будь-яке число нуклеотидних послідовностей, що кодують будь-який фрагмент амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2, і всі подібні 15 послідовності включені в об'єм даного винаходу. В об'єм даного винаходу також включені будь-які виділені і очищені нуклеотидні послідовності, що кодують щонайменше інсектицидний фрагмент білка Cry1.105, а також будь-які композиції, за допомогою антитіла, ДНК/РНК-зонду, або двох або більше пар праймерів, дизайн яких проведений таким чином, що при проведенні ПЛР з цими праймерами синтезується амплікон, який містить одну з нуклеотидних послідовностей, що обговорюються. Кодуючий регіон експресованої в кукурудзі модельної послідовності містить тільки послідовність, що кодує білок-прекурсор Cry1A.105, в той час як модельна послідовність, що екпресується в бавовнику, містить також кодуючу послідовність хлоропласт-таргетувального пептиду у вигляді химерної конструкції з Cry1A.105. Було показано, що експресія білків Cry1 в рослинах вельми проблематична. Апріорі невідомо, чи буде той або інший білок Cry1 добре експресуватися в рослинах, тому неминуче використання методу «проб і помилок». Деякі білки Cry1, будучи екпресованими в кукурудзі, приводять до фітотоксичних ефектів; подібні ефекти іноді можуть бути ослаблені шляхом спрямування синтезованого білка в хлоропласти. Вищесказане також справедливо і для бавовника, що експресує білки Cry1. Приведені в даній заявці приклади не мають на меті показати, що експресія Cry1A.105 в кукурудзі можлива тільки в тому випадку, якщо білковий продукт трансгену локалізується в цитоплазматичному просторі, і аналогічно що експресія Cry1A.105 в бавовнику можлива тільки в тому випадку, якщо білковий продукт трансгену локалізується в хлоропластах. Наведені приклади мають на меті продемонструвати, що будьяка локалізація є функціональною для білка, що складає предмет даного винаходу, причому отримані морфологічно нормальні трансгенні рослини демонструють високі рівні експресії і накопичення білка Cry1A.105, а також комерційно прийнятні рівні резистентності до широкого спектра лускокрилих комах-шкідників, вибраних з групи, що складається з родів Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Helicoverpa, Heliothis, Spodoptera, Epinotia і Armigera. Автори винаходу вважають, що послідовність, що кодує будь-який з хлоропласттаргетувальних пептидів, буде ефективна для спрямування білка-прекурсора Cry1A.105 в хлоропласти/пластиди. Нетрансльовані лідерні послідовності, інтрони і 3'-сигнали термінації трансляції і поліаденілювання добре відомі в даній галузі, і відповідному фахівцеві буде зрозуміло, що в деяких випадках експресія може бути поліпшена або стабілізована шляхом включення подібних послідовностей в експресійну касету. В генній інженерії відоме велике число подібних послідовностей, і використання їх всіх в контексті експресії білка Cry1A.105 включене в об'єм даного винаходу. Аналогічно, в галузі генної інженерії добре відомі різні промотори, регулюючі експресію контрольованої і зв'язаної з ними послідовності; використання їх всіх в контексті експресії білка Cry1A.105 також включене в об'єм даного винаходу. Промотори можуть бути 96421 16 вибрані таким чином, щоб регулювати експресію контрольованої послідовності відповідно до будьякого числа комбінацій різних параметрів, наприклад, щоб забезпечувати часовий, просторовий або тканиноспецифічний контроль експресії, а також контроль накопичення білкового продукту трансгену в тій або іншій рослинній тканині або клітині. Виділений і очищений білок, що містить інсектицидний фрагмент амінокислотної послідовності Cry1A.105, також включений в об'єм даного винаходу, рівно як і різні варіанти подібного білка, в тому випадку, якщо амінокислотна(і) заміна(и) в подібних варіантах є консервативними і не приводять до зниження інсектицидної біоактивності або звуження спектра видової специфічності останньої. Мається на увазі, що інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105 являє собою сегмент, що включає в себе амінокислоти в положенні від приблизно 1 до приблизно 650, від приблизно 2 до приблизно 612, від приблизно 5 до приблизно 610 або від приблизно 10 до приблизно 600 амінокислотних послідовності SEQ ID NO:2. Як альтернатива, інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105 може являти собою амінокислотну послідовність довжиною від приблизно 550 до приблизно 650 амінокислот, що складають безперервну амінокислотну послідовність в складі послідовності SEQ ID NO:2. Повнорозмірний белок-прекурсор (амінокислоти від положення 1 до приблизно 3534) володіє прекрасними кристалоутворювальними характеристиками і добре переноситься як однодольними, так і дводольними видами. Білокпрекурсор також демонструє чудову стабільність в кристалічній формі, а також прекрасну розчинність при лужних значеннях рН, зокрема, при рН від приблизно 8,0 до приблизно 12,0, від приблизно 8,5 до приблизно 11,5 або від приблизно 9,0 до приблизно 11,0. Білок, що складає предмет даного винаходу, може бути очищений і використаний в інсектицидно-ефективній кількості в складі будь-якого числа композицій, призначених для контролювання чисельності лускокрилих комах-шкідників; даний білок може бути також скомбінований в інсектицидно-ефективній кількості з будь-яким числом інших пестицидних агентів, відмінних від білка Cry1A.105. Подібні пестицидні агенти включають в себе без обмеження інші білки Cry В. thuringiensis, інші інсектицидні композиції, в тому числі хімічні інсектициди (незалежно від їх токсичності по відношенню до лускокрилих комах), фунгіцидні і фунгістатичні агенти, антибіотики, антибактерійні агенти, бактеріостатичні агенти, а також нематоцидні і нематостатичні агенти. Подібні пестицидні комбінації, що містять в своєму складі білок Cry1A.105 і будь-яке число інших пестицидних агентів, можуть продукуватися трансгенною клітиною, або ж вони можуть бути отримані змішуванням очищених або значною мірою очищених індивідуальних пестицидних агентів з отриманням єдиної пестицидної композиції у вигляді порошку, гранульованого матеріалу, масляної суспензії, водної суспензії, водно-масляної емульсії або змочуваного порошку, яка далі у вигляді суміші з сільськогосподарські 17 прийнятним носієм може бути використана для обробки листя. Композиція також може бути отримана у вигляді, придатному для обробки насіння - або у вигляді композиції, що містить Cry1A.105 і призначеної для обробки насіння, або у вигляді композиції, призначеної для обробки насіння, отриманого з трансгенної рослини, що екпресує інсектицидноефективні кількості Cry1A.105 - в цьому випадку цільові лускокрилі комахи-шкідники отримують як композицію, що містить пестицидні агенти, так і клітини рослин, що зросли з насіння, що продукує пестицидно-ефективні кількості білка Cry1A.105. Комбінація інсектицидних білків, кожний з яких токсичний по відношенню до одних і тих же видів комах, і які в той же час реалізовують свій токсичний потенціал по різних механізмах, може бути особливо корисній для контролю за чисельністю лускокрилих комах-шкідників, або для затримки розвитку резистентності до кожного з пестицидних агентів, що входять в комбінацію, які за відсутності резистентності ефективні проти даних конкретних видів лускокрилих комах-шкідників. Модельною комбінацією подібних білків може служити комбінація білка Cry1A.105 (тобто першого інсектицидного білка), складаючого предмет даного винаходу, щонайменше з одним іншим інсектицидним білком, відмінним від першого. Подібні інсектицидні білки включають в себе без обмеження інші кристалічні білки В. thuringiensis (інші білки Cry1, білки Cry2, білки Cry5 і білки Cry9), білки VIP, токсичні по відношенню до лускокрилих комах білки TIC, а також інсектицидні білки, що продукуються бактеріями родів Xenorhabdus і Photorhabdus. Комбінація одного або більше інсектицидних білків з агентом, що забезпечує dsPHK-опосередковану супресію одного або більше генів, критичних для виживання комахи, є особливо корисною для контролю за чисельністю лускокрилих комахшкідників, або для затримки розвитку резистентності до кожного пестицидних агентів, що входять в комбінацію, які за відсутності резистентності ефективні проти даних конкретних видів лускокрилих комах-шкідників. В іншому втіленні даний винахід стосується рослин, трансформованих нуклеотидними послідовностями, що складають предмет даного винаходу. Способи стабільної трансформації рослинних клітин добре відомі в галузі генної інженерії рослин і включають в себе без обмеження вакуумну інфільтрацію, Agrobacterium- або Rhizobiiimопосередковану трансформацію, електропорацію і різні балістичні методи. ДНК, що вводиться в рослини, звичайно таргетується для інтеграції в ядерну хромосому, хоча інтеграція в ДНК пластидів/хлоропластів також може бути здійснена. ДНК, що вводиться в рослини, звичайно пов'язана з послідовністю, кодуючої маркерні білки, що дозволяють ідентифікувати або відібрати клітину(и), в якій(их) сталася стабільна трансформація цільової ДНК. Подібні маркерні гени включають в себе без обмеження гени, що кодують флуоресцентні або світлорозсіювальні білки, пігменти або ферменти, що наділяють екпресуючі їх клітини колориметричними властивостями. Як альтернатива, подібні 96421 18 маркерні гени можуть являти собою селекційні маркери, за допомогою яких можна проводити позитивну селекцію трансформованих клітин або тканин, і які надають трансформованим клітинам перевагу в рості, причому таким чином, що нетрансформовані клітини при цьому стають статичними або гинуть. Прикладами подібних селекційних маркерів можуть без обмеження служити гени basta і bar, ген стійкості до метотрексату, ген неоміцинфосфотрансферази, гени нечутливих до гліфосату ферментів EPSPS, гени гліфосатоксидоредкутаз (GOX), ген phnO Ε. coli, еквіваленти всього вищепереліченого і т.д. Також, в об'єм даного винаходу включені вектори і інші послідовності, призначені для підтримки і маніпуляцій з модельними нуклеотидними послідовностями в лабораторії, а також для введення їх в клітину-хазяїна; приклади подібних послідовностей включають в себе без обмеження фаги, плазміди, ВАС-міди, YAC-міди, косміди і т.д. Трансформовані рослини також включені в об'єм даного винаходу. Особливо, даний винахід стосується трансформованих рослин, що містять щонайменше інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105. В об'єм даного винаходу включені як однодольні, так і дводольні трансформовані рослини. Однодольні рослини включають в себе без обмеження кукурудзу, пшеницю, овес, рис, сорго, гречку, жито, злаки (вівсяницю, тимофіївку лугову, стоколос, грястицю збірну, августинову траву, свинорий пальчатий, польовицю) і ячмінь; дводольні рослини включають в себе без обмеження люцерну, яблуко, абрикос, спаржу, квасолю, каву, ожину, чорницю, канолу, моркву, цвітну капусту, селеру, вишню, нут, цитрусові, бавовник, вигну китайську, журавлину, огірок, гарбуз, баклажан, плодові дерева, виноград, лимон, салат-латук, льон, диню, гірчицю, горіхоплідні дерева, бамію, окру, апельсин, горох, персик, арахіс, грушу, сливу, картоплю, сою, крупноплідний гарбуз, суниці, цукровий буряк, соняшник, батат, тютюн, томат, ріпу і інший овочі. Отримана з цих рослин продукція, рівно як насіння і тканини останніх, також включені в об'єм даного винаходу в тому випадку, якщо це насіння, тканини або продукти містять трансген, що кодує інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105. Даний винахід також стосується способів детекції білка Cry1A.105 або нуклеотидної послідовності, що кодує інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105, в біологічній пробі. Cry1A.105 може бути використаний для імунізації тварин з метою отримання антитіл, специфічних до епітопів Cry1A.105. Cry1A.105-специфічні антитіла можуть бути використані для виявлення білка Cry1A.105 в біологічній пробі. Способи детектування зв'язування антиген-антитіло добре відомі в даній галузі. Виявлення зв'язування антитіла з епітопами Cry1A.105 є діагностичним відносно присутності в біологічній пробі білка Cry1A.105. Нуклеотидні послідовності, що кодують інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105, також можуть бути детектовані в біологічній пробі. Так, для зв'язування з детектованою нуклеотидною послідовністю, що кодує інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105, може бути використаний синтетичний 19 олігонуклеотидний зонд. Способи детектування зв'язування зонд-мішень добре відомі в даній галузі. Виявлення зв'язування зонда з мішенню, тобто з кодуючою послідовністю Cry1A.105, є діагностичним відносно присутності в біологічній пробі кодуючої послідовності Cry1A.105. Синтетичні олігонуклеотидні праймери можуть бути використані в реакції ампліфікації для отримання амплікону з біологічної проби, що приблизно містить нуклеотидну послідовність, яка кодує інсектицидний фрагмент білка Cry1A.105. Присутність в реакційній суміші після проведення ампліфікації подібного амплікону є діагностичним у відношенні присутності в біологічній пробі шуканої нуклеотидної послідовності. Особливо корисними як зонди, діагностичні відносно присутності в біологічній пробі кодуючих послідовностей білка Cry1A.105 згідно з даним винаходом, є послідовності, відповідні або повністю комлементарні (1) нуклеотидам 1401-1420 послідовностей SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3, або (2) нуклеотидам 18211840 послідовностей SEQ ID NO:1 або SEQ ID NO:3. Ці послідовності відповідають (1) 20-ти нуклеотидам, що перекривають ділянку стику між доменами II і III, що належать сегментам різних інсектицидних білків, використаних для конструювання інсектицидного фрагмента білків, які складають предмет даного винаходу, і (2) 20-ти нуклеотидам, що перекривають ділянку стику домену III і протоксинового кодуючого сегмента, різних інсектицидних білків, що належать кодуючим сегментам, використаним для конструювання кодуючої послідовності пре-про-токсинового білка Cry1Ab.105. Нуклеотидні послідовності, відповідні або комлементарні будь-якому з цих сегментів ДНК (1401-1420 або 1821-1840) можуть бути використані як зонди для детектування цих кодуючих послідовностей в біологічних пробах. Виявлення подібного зв'язування є діагностичним відносно присутності в біологічній пробі кодуючих послідовностей, що обговорюються. Фахівцеві в даній галузі буде зрозуміло, що будь-які послідовності, фланкуючі ці сегменти ДНК, можуть бути використані як праймери для ампліфікації сегментів різної довжини в різних біологічних пробах, і що виявлення подібних ампліконів після закінчення реакції ампліфікації є діагностичним відносно присутності подібних кодуючи послідовностей в біологічній пробі. Наприклад, перший праймер, нуклеотидна послідовність якого відповідає ділянці 1201-1220 послідовності SEQ ID NO:1, може бути використаний як прямий праймер, а другий праймер, нуклеотидна послідовність якого відповідає оберненому на 180° комплементу ділянки 1581-1600 послідовності SEQ ID NO:1 - як зворотний праймер. При спільному використанні цих праймерів і біологічної проби, що містить SEQ ID NO:1 як матриця, в реакції ампліфікації, отримуваний амплікон має довжину 400 нуклеотидів і являє собою відрізок 12011600 послідовності SEQ ID NO:1, що містить 20нуклеотидний сегмент 1401-1420 послідовності SEQ ID NO:1 і, таким чином, є діагностичним відносно присутності кодуючої послідовності Cry1A.105 в біологічній пробі. 96421 20 Даний винахід також стосується набору для детектування присутності Cry1A.105 або нуклеотидної послідовності, що кодує Cry1A.105, в біологічній пробі. Набір містить всі необхідні реагенти і контрольні проби, необхідні для виконання визначення цільових речовин, а також інструкції із застосування. Нижченаведені приклади ілюструють переважні втілення даного винаходу. Виходячи з міркувань специфікацій і практики даного винаходу і згідно з розкритим в даній заявці, фахівцеві в даній галузі також будуть очевидні інші втілення, що входять в об'єм даного винаходу. Опис і приклади повинні розглядатися тільки як пояснювальні і не обмежуючі суть і об'єм даного винаходу, вказані в наведеній услід за розділом «Приклади» формулі винаходу. Приклади Приклад 1 У даному прикладі демонструються синтетичні нуклеотидні послідовності, що кодують інсектицидний білок Cry1A.105. Для використання в дводольних рослинах була сконструйована нуклеотидна послідовність SEQ ID NO:1, що кодує інсектицидний білок Cry1A.105. Відповідна трансльована амінокислотна послідовність наведена в SEQ ID NO:2. Токсинкодуючий сегмент відповідає нуклеотидам в положенні від приблизно 1 до приблизно 1830 (або може мати дещо більшу або меншу довжину). Для використання в однодольних рослинах була сконструйована нуклеотидна послідовність SEQ ID NO:3, що кодує інсектицидний білок Cry1A.105. Відповідна трансльована амінокислотна послідовність наведена в SEQ ID NO:4. Токсинкодуючий сегмент відповідає нуклеотидам в положенні від приблизно 1 до приблизно 1830 (або може мати дещо більшу або меншу довжину). Нуклеотидні послідовності SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3 значною мірою еквівалентні одна одній. Так, SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3 гомологичні одна по відношенню до іншої на 94,3%. Кодуючі послідовності ідентичні одна одній в області положень нуклеотидів від приблизно 1330 до приблизно 3534. Токсин-кодуюча частина кожної з послідовностей відповідає нуклеотидам в області від приблизно 1 до приблизно 1830; ці сегменти послідовностей SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3 ідентичні один одному приблизно на 88,9%. Істотними відмінностями між двома послідовностями характеризуються регіони, відповідні нуклеотидам від приблизно 1 до приблизно 1329, тобто перші дві третини токсин-кодуючого сегмента Cry1A.105. У цьому регіоні ідентичність SEQ ID NO:1 і SEQ ID NO:3 складає близько 84,7% одна по відношенню до іншої. Штам Е. соlі (ТОР10, Invitrogen, Inc.), трансформований плазмідою pMON70522, що містить бета-лактамазний селекційний маркер і кодуючу Cry1A.105 послідовність SEQ ID NO:3, був депонований в Колекцію Дослідницьких Сільськогосподарських Культур при керівництві Міжнародного Депозитарія (Agriculture Research Culture Collection (NRRL) International Depository Authority) за адресою 1815, North University Street, Peoria, Illinois 61604, США, відповідно до Будапештської Конвен 21 96421 ції про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для патентних цілей, під номером NRRL B-30873. Приклад 2 У даному прикладі демонструється трансгенний бавовник, що експресує білок Cry1A.105. Насіння бавовника Delta і Pineland DP50 піддавали поверхневій стерилізації і пророщували протягом ночі. Експланти меристеми виділяли, і первинне листя видаляли за допомогою мікродисекції. Препаровані експланти вмішували в середовище для трансфекції таким чином, щоб меристеми були орієнтовані перпендикулярно потоку частинок. Трансформуючий вектор pMON47740 містив експресійну касету SEQ ID NO:9. ΚpnΙ фрагмент, що містить маркерний ген GUS під контролем промотора e35S кодуючу послідовність, що направляється в хлоропласти Cry1А.105, під контролем промотора eFMV, вирізали з плазміди, очищали за допомогою ВЕРХ і використали для «gun»-трансформації експлантів меристеми. Очищена ДНК, що містить екпресійну касету Cry1А.105 і маркерний ген GUS осаджували на мікроскопічні золоті кульки і тонким шаром наносили на листи майлара. Частинки з ДНК доставляли в тканину меристеми за допомогою електричних розрядів в низькому вакуумі. Після бомбардування експланти вміщували в середовище без гормонів і селекційних агентів. Листя регенерованих паростків збирали, і тканину листя аналізували на присутність маркера GUS. Трансгенні рослини з високим рівнем експресії GUS далі вміщували в теплиці для подальших тестів. Відібрані рослини знову тестували на експресію GUS, і негативні частини рослин обрізали. Даний цикл пробовідборів і обрізань продовжували доти, поки всі сектори всіх рослин не виявилися GUS-позитивними. Після цього рослини вирощували в стандартних тепличних умовах до моменту збору насіння. Тканини GUS-позитивних трансгенних рослин F1 далі тестували на наявність інсектицидної активності проти совки бавовняної (CBW) і совки трав'яної (FAW). Як позитивний контроль викорис 22 тали раніше отримані ізогенні рослини, що екпресують інсектицидні кількості Cry1Ac або комбінації Cry1Ac і Cry2Аb, як негативний контроль використали ізогенні нетрансгенні рослини. Як один із способів визначення інсектицидної активності трансгенного бавовника був вибраний метод листових квадратів (т.н. «CBW square assay») (Adamczyck з співавт., (2001) J. Econ. Entomol. 94:284-290; Kranthi з співавт, (2005) Current Science 89:291-298). З листя вирізали квадрати (величиною зі сірникову головку і більше), які вміщували в ямку аналітичного планшета по одному квадрату на ямку. На кожний квадрат вмішували одну гусеницю CBW третьої вікової стадії. Через п'ять днів підраховували кількість комах, що вижили. Для дослідження інсектицидної активності тканини виділених з трансгенних рослин насіннєвих коробочок застосовували т.н. «CBW boll assay». З кожної трансгенної рослини після цвітіння збирали по 8 яскраво-зелених насіннєвих коробочок, які вміщували в індивідуальні ємності, куди далі саджали одну гусеницю CBW третьої вікової стадії. Через п'ять днів підраховували кількість комах, що вижили. Листові аналізи застосовували для вивчення інсектицидної активності трансгенної листової тканини проти FAW. З верхівок рослин бавовника збирали нове листя. У кожну з 16 ямок аналітичного планшета вміщували по 2 круглих шматочка листа, отриманих за допомогою диропробивного преса (діаметр приблизно 3/4"). У кожну ямку вміщували по одній гусениці FAW другої або третьої вікової стадії. Через п'ять днів підраховували кількість комах, що вижили. Результати проведених досліджень наведені в таблиці. Отримані дані вказують на те, що трансгенний бавовник, екпресуючий Cry1A.105, демонструє більшу інсектицидну активність по відношенню до FAW і CBW, ніж трансгенні рослини, експресуючі Cry1Ac або комбінацію Cry1Ac і Cry2Аb. Таблиця Результати біоаналізу FAW і CBW з використанням тканин трансгенного бавовника Рослина Cry1Ac/Cry2Ab Cry1Ac Ізогенний негативний контроль 17238 17567 17774 17875 18026 18122 FAW (% особнів, що ви- CBW (% особнів, що вижи- CBW (% особнів, що вижили) жили) (тканина листа) ли) (листові квадрати) (насіннєві коробочки) 74,5 32,0 35,8 92,7 35,5 35,8 99,6 96,8 54 10,9 0 1,6 3,1 1,6 7,8 9,4 12,5 1,2 4,2 18,8 22,9 25 12,5 0 0 12,5 0 23 Крім експериментів, результати яких наведені в таблиці, аналогічні дослідження були проведені на гусеницях тютюнової листовійки-брунькоїда і совки бавовняної американської. У всіх експериментах, рослини, екпресуючі Cry1A.105, демонстрували інсектицидну активність також і проти цих видів. Приклад 3 Даний приклад демонструє трансгенну кукурудзу, експресуючу білок Cry1A.105. Рослини трансгенної кукурудзи регенерували з клітин, трансформованих вектором pMON40232. pMON40232 містить експресійну касету, що має нуклеотидну послідовність SEQ ID NO:7 і містить оперативно пов'язані один з одним посилений промотор CAMV 35S, лідер ну послідовність гена CAB пшениці, інтрон гена актину 1 рису, кодуючу послідовність Cry1A.105 і 3'-сигнали термінації трансляції і поліаденілювання гена hsp17 пшениці. Нуклеотидна послідовність хлоропласттаргетувального пептиду гена EPSPS Arabidopsis thaliana (At.EPSES-CTP2) вміщена з 5'-кінця відносно кодуючої послідовності Cry1A.105 в одній рамці зчитування з останньою. pΜΟΝ40232 містить призначений для селекції трансгенних рослин рекомбінантний ген, що кодує фермент EPSPS, нечутливий до гербіциду гліфосату. Трансгенні рослини, отримані з тканин, трансформованих pΜΟΝ40232, кодували як LAJ 105. Трансгенні рослини скринували на відсутність яких-небудь залишків векторних послідовностей за межами експресійної касети, на присутність однієї простої інтегрованої послідовності, а також на інтактність експресійної касети, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує білок Cry1A.105. Трансгенні рослини, що задовольняють всім вищезгаданим скринінговим умовам, далі піддавали різним біологічним тестам. Трансгенні рослини кукурудзи LAJ105 порівнювали з ізогенною кукурудзою LH198 як негативний контроль, а також з експресуючим інсектицидний фрагмент білка Cry1Ab сортом MON810. З кожного з Cry1A.105трансгенних і контрольних рослин отримували по п'ять дисків листової тканини діаметром приблиз 96421 24 но 10 мм кожний. Диски вміщували в заповнену агаром ямку для підтримки тканин в набряклому стані, після чого згодовували новонародженим гусеницям FAW, совкі-іпсилон (BCW), метелика кукурудзяного (ЕСВ), совки бавовняної американської (CEW) і огнівки кукурудзяної південнозахідної (SWCB). У кожну ямку саджали по одній новонародженій гусениці FAW, по одній новонародженій гусениці CEW, по дві новонароджених гусениці BCW, по дві новонароджених гусениці SWCB, або по чотири новонароджених гусениці ЕСВ. Пошкодження листа внаслідок поїдання гусеницями оцінювали через чотири дні за допомогою шкали пошкодження листа (LDR), в якій бал 0 відповідає відсутності видимих пошкоджень, бал 11 відповідає знищенню половини (50%) кожного з дисків, при цьому кожний бал в проміжку між: цими значеннями відповідає збільшенню видимих пошкоджень листових дисків на 5%. Результати біологічних тестів вказують на те, що рослини, експресуючі білок Cry1A.105, демонструють більшу інсектицидну активність (LDR) по відношенню до FAW, ЕСВ і CEW, ніж екпресуючі Cry1Ab контрольні рослини. Так, значення LDR для трьох вищезгаданих шкідників складали менше 1 при тестуванні Cry1А.105-трансгенів в порівнянні з приблизно 8 - приблизно 10 при тестуванні Cry1Ab-контролів. У той же час, при тестуванні цих же рослин на SWCB, показники LDR як для Cry1A.105-трансгенів, так і для Cry1Ab-контролів, становили 1-2, що вказує на те, що білок Cry1A.105 не є більш токсичним по відношенню до SWCB, ніж Cry1Ab. Результати цих тестів підтверджують попередні дані, вказуючі на те, що Cry1Ab не ефективний для боротьби з BCW. Cry1А.105трансгени не є більш ефективними проти BCW, ніж Cry1Ab-контролі. Таким чином, при рівнях експресії білка Cry1A.105, досяжних in planta, отримані трансгени можуть бути ефективні для боротьби з лускокрилими комахами-шкідниками, що є представниками інших родів, які включають в себе без обмеження Anticarsia, Pseudoplusia, Rachiplusia, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Epinotia і Armigera. 25 96421 26 27 96421 28 29 96421 30 31 96421 32 33 96421 34 35 96421 36 37 96421 38 39 96421 40 41 96421 42 43 96421 44 45 96421 46 47 96421 48 49 96421 50 51 96421 52 53 96421 54 55 96421 56 57 96421 58 59 96421 60