Спосіб одержання водоростевої біомаси і її використання

Реферат: UA 112080 C2 (12) UA 112080 C2 Винахід стосується способу одержання водоростевої біомаси з загальним вмістом жиру щонайменше 67 %; водоростевої біомаси, одержаної таким способом, із загальним вмістом жиру щонайменше 67%, яка містить 170-250 мг/г докозагексаєнової кислоти і 150-400 мг/г пальмітинової кислоти; ліпідної композиції, одержаної з вказаної водоростевої біомаси; харчового продукту, який містить вказану ліпідну композицію; харчового продукту, який містить вказану водоростеву біомасу, і застосування водоростевої біомаси у виробництві біопалива. UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Ця Заявка має пріоритет щодо Заявки на тимчасовий патент США, серійний № 61/507,390, поданий 13 липня 2011, який врахований тут шляхом посилання на нього у повному обсязі. ГАЛУЗЬ ЗАСТОСУВАННЯ ВИНАХОДУ Даний винахід стосується складних речовин, які містять водорості з високим ліпідним вмістом, а також методів їх отримання і використання. Зокрема, він відноситься до водоростевої біомаси з високим ліпідним вмістом і водоростевих ліпідних матеріалів, отриманих з неї, методів її отримання, а також біопалива (наприклад, біодизелю) і складання або отримання харчових сумішей (наприклад, кормів для тварин). Складні речовини і методи винаходу знаходять застосування у різних напрямках, у тому числі для виробництва біопалива, споживання у їжу (наприклад, харчування людей і відгодівля тварин), а також для терапевтичних і дослідницьких цілей. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Протягом останніх декількох років спостерігалась зацікавленість у виробництві біопалива (наприклад, біодизелю). Частково це було пов'язано з тим, що для вирощування водоростей (водоростевої біомаси) не були потрібні високоякісні сільськогосподарські земельні угіддя. Проте, промислове виробництво біопалива (наприклад, біодизелю) з водоростей залишається складним питанням. Окрім цього, протягом останніх п'ятдесяти років змінились підходи до забезпечення відгодівлі тварин. Більше немає тварин, яких годують усілякими кормами або іншими речовинами, які можуть бути доступними. Натомість, режим відгодівлі тварин є об'єктом уважного стеження з огляду на загальну цінність і вартість кормів. Дуже часто за тваринами, які отримують спеціальні корми, здійснюється контроль для визначення якісних і продуктивних характеристик з метою коригування поживних компонентів корму, щоб отримати його максимальну харчову цінність та оптимальні продуктивні характеристики тварин. Тим не менш, критичним фактором є вартість. Здійснюється постійний пошук економічно ефективних кормів для тварин, не тільки для стабільного стану тварин, але і в багатьох випадках, щоб зумовити посилене набирання ваги і цінність тварин. СТИСЛА ХАРАКТЕРИСТИКА сутності ВИНАХОДУ Даний винахід стосується складних речовин, які містять водорості з високим ліпідним вмістом, а також методів їх отримання і використання. Зокрема, він відноситься до водоростевої біомаси з високим ліпідним вмістом і водоростевих ліпідних матеріалів, отриманих з неї, методів її отримання, а також біопалива (наприклад, біодизелю) і складання або отримання харчових сумішей (наприклад, кормів для тварин). Складні речовини і методи винаходу знаходять застосування у різних напрямках, у тому числі для виробництва біопалива, споживання у їжу (наприклад, харчування людей і відгодівля тварин), а також для терапевтичних і дослідницьких цілей. Відповідно, винахід забезпечує процес отримання водоростевої біомаси з потрібним високий вмістом жиру (наприклад, принаймні 67 % загального вмісту жиру), у тому числі вирощування водоростей в умовах культивування, достатніх для отримання водоростевої біомаси, яка містить потрібний високий вміст жиру. У винаході визначені умови культивування, за яких можна отримати водоростеву біомасу, що містить потрібний загальній рівень жиру (наприклад, принаймні 67 % загального вмісту жиру). Використання винаходу не обмежується загальним вмістом жиру у водоростевій біомасі (наприклад, вираженого у масі), яка генерується відповідно до винаходу. У кращому варіанті застосування винаходу водоростева біомаса, яка генерується і/або використовується відповідно до винаходу, має масовий вміст жиру щонайменше 67 %. При цьому, винахід також забезпечує компонування і методи генерації водоростяної біомаси, що містить більший об'єм жиру (наприклад, більше ніж 68 %, більше ніж 69 %, більше ніж 70 %, більше ніж 71 %, більше ніж 72 %, більше ніж 73 %, більше ніж 74 %, більше ніж 75 %, більше ніж 76 %, більше ніж 77 %, більше ніж 78 %, більше ніж 79 %, більше ніж 80 %, більше ніж 81 %, більше ніж 82 %, більше ніж 85 % або ще більше) чи менший (наприклад, приблизно 66 %, приблизно 65 %, приблизно 64 %, приблизно 63 %, приблизно 62 %, приблизно 61 %, приблизно 60 %, приблизно 59 %, приблизно 58 %, приблизно 57 %, приблизно 56 %, приблизно 55 %, приблизно 54 % або менше). Дійсно, описані тут методи і складні речовини можуть використовуватись для генерації водоростяної біомаси з будь-яким потрібним рівнем загального вмісту жиру. У деяких варіантах водоростева біомаса вирощується у двох або більше видах культурального середовища в послідовному порядку. Наприклад, у деяких варіантах одне культуральне середовище, яке складається з двох або більше культуральних середовищ, містить 50 г/л джерела вуглецю, приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, 0,15 г/л хлориду кальцію і 0,15 г/л хлориду магнію. Винахід не обмежується за джерелом вуглецю. Безумовно, можуть використовуватись 1 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 різні джерела вуглецю, в тому числі серед інших вуглець з таких джерел, як: глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза чи розчинний крохмаль, а також олеїнова кислота, жири, такі як: соєва олія, меляса, гліцерин, маніт і ацетат натрію, бавовняне борошно, гліцерин, патока і кукурудзяний екстракт. У деяких варіантах інше культуральне середовище з двох або більше культуральних середовищ містить 50 г/л джерела вуглецю, приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, 4,0 г/л сульфату магнію, приблизно 1 г/л сечовини, приблизно 2 г/л хлориду кальцію, приблизно 2 г/л хлориду магнію і приблизно 0,25 г/л первинного кислого фосфату. У деяких варіантах одне культуральне середовище з двох або більше культуральних середовищ містить джерело вуглецю, дріжджовий екстракт і морську сіль. У деяких варіантах і, як тут описано, водорості вирощуються у першому культуральному середовищі (наприклад, яке містить глюкозу, дріжджовий екстракт і морську сіль), переносяться і інкубуються у другому культуральному середовищі (наприклад, яке містить глюкозу, дріжджовий екстракт, сульфат магнію, хлорид кальцію і хлорид магнію), а також переносяться і інкубуються у третьому культуральному середовищі (наприклад, яке містить глюкозу, дріжджовий екстракт, сульфат магнію, сечовину, хлорид кальцію, хлорид магнію і первинний кислий фосфат). У деяких варіантах одне із культуральних середовищ доповнюється підживленням. У кращому варіанті трете культуральне середовище доповнюється підживленням. Застосування винаходу не обмежується за типом або тривалістю підживлення, яке використовується. У деяких варіантах підживленням складається з сечовини і первинного кислого фосфату. Застосування винаходу не обмежується об'ємом і/або співвідношенням компонентів середовища, які використовуються у цих культурах. У цьому документі докладно наведені приклади можливого використання компонентів для кожного з різних середовищ (наприклад, першого культурального середовища, другого культурального середовища, дозованих середовищ, середовищ з підживленням). У деяких варіантах врожай водоростяної біомаси збирають з культури (наприклад, з третього культурального середовища) у період 12-24 годин після припинення процесу підживлення. У деяких варіантах врожай водоростевої біомаси збирається з третього культурального середовища після видалення/спожиття усіх поживних речовин із середовища. Застосування винаходу не обмежується способом збирання урожаю водоростяної біомаси. Безумовно, для збирання врожаю біомаси можуть використовуватись різні методи, у тому числі серед інших описані тут методи. У деяких варіантах урожай водоростяної біомаси збирають за допомогою центрифугування. У деяких варіантах культуральне середовище, яке містить водоростеву біомасу, охолоджують до збирання урожаю водоростяної біомаси. Винаходом не обмежується температура, до якої культуральне середовище, що містить водоростеву біомасу, охолоджують до збирання її врожаю. Безумовно, можуть використовуватись різні температури, у тому числі серед інших описані в цьому документі. У деяких варіантах культуральне середовище, яке містить водоростеву біомасу, охолоджують до приблизно від 5 °C до 25 °C. Застсоування винаходу не обмежується за видом водоростей, які використовуються у ньому. Безумовно, можна використовувати різноманітні водорості (наприклад, окремо або в поєднанні), у тому числі серед інших описані в цьому документі. У деяких варіантах водорості є штамом або видами роду хлорели, роду Schizochytrium або роду Crypthecodinium. У кращому варіанті застосовуються водорості Schizochytrium limacinum. У деяких варіантах перше культуральне середовище містить приблизно 50 г/л глюкози, приблизно 10 г/л дріжджового екстракту і приблизно 4 г/л морської солі. У деяких варіантах друге культуральне середовище містить приблизно 50 г/л глюкози, приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і 0,15 г/л хлориду магнію. У деяких варіантах трете культуральне середовище містить приблизно 50 г/л глюкози, приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 4,0 г/л сульфату магнію, приблизно 1 г/л сечовини, приблизно 2 г/л хлориду кальцію, приблизно 2 г/л хлориду магнію і приблизно 0,25 г/л первинного кислого фосфату. У деяких варіантах культуральні умови передбачають вирощування водоростевої культури при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 10 %. У деяких варіантах трете культуральне середовище (наприклад, культуральні середовища присутні в момент інокуляції головного ферментера (наприклад, у резервуарах місткістю 70000 л, 120000 л, 256000 л)) містить середовище з початковим співвідношенням азоту (N), фосфору (P), і калію (K) у вигляді 46:13:8,5. У кращому варіанті співвідношення N: P: К є однаковим у дозованому режимі і режимі з підживленням. У деяких варіантах співвідношенням магнію (Mg) і кальцію (Са) складає 3:1 у культуральних середовищах, які використовуються в обох дозуючому режимі і режимі підживлення, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 4:1, 4,5:1 чи вищі) і нижчі (наприклад, 2,5:1, 2:1, 1,5:1 чи нижчі) співвідношення. В іншому варіанті співвідношення хлориду (Cl2) і сульфату (SO4) 1:1 в культуральних середовищах, використовуються в обох дозуючому 2 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 режимі і режимі підживлення, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1 чи вищі) і нижчі (наприклад, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 чи нижчі) співвідношення. У деяких варіантах співвідношення сульфату (SO4) і фосфату (PO4) в середовищах під час інокуляції головного ферментера (наприклад, у резервуарах місткістю 70000 л, 120000 л, 256000 л) складає 16:1, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 20:01, 25:1, 30:1, 32:1 чи вищі) і нижчі (наприклад, 10:1, 8:1, 5:1, 3:1 чи нижчі) співвідношення. У деяких варіантах загальне співвідношення сульфату (SO4) і фосфату (PO4), яке у дозуванні і підживленні наприкінці повної культури (наприклад, яка містить затравку, першу стадію посіву, другу стадії посіву та культури головного ферментера), яка генерує водоростеву біомасу, що містить потрібний вміст жиру (наприклад, більше 67 % жиру), складає 5,3:1, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 5,5:1, 5,7:1, 6:1, 7:1, 8:1 чи вище) і нижчі (наприклад, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3:1 чи нижче) співвідношення. У деяких варіантах співвідношення хлориду (Cl2) і фосфату (PO4) у середовищах під час інокуляції у головному ферментері (наприклад, у резервуарах місткістю 70000 л, 120000 л, 256000 л) складає 16:1, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 20:1, 25:1, 30:1, 32:1 чи вищі) і нижчі (наприклад, 10:1, 8:1, 5:1, 3:1 чи нижчі) співвідношення. У деяких варіантах загальне співвідношення хлориду (Cl2) і фосфату(PO4), яке використовувалось у дозуванні і підживленні наприкінці повної культури (наприклад, яка містить затравку, першу стадію посіву, другу стадії посіву та культури головного ферментера), яка генерує водоростеву біомасу, що містить потрібний вміст жиру (наприклад, більше 67 % жиру), складає 5,3:1, хоча можуть використовуватись вищі (наприклад, 5,5:1, 5,7:1, 6:1, 7:1, 8:1 чи вищі) і нижчі (наприклад, 5:1, 4,5:1, 4:1, 3:1 чи нижчі) співвідношення. Винахід також забезпечує отримання водоростяної біомаси, яка має потрібний, високий вміст жиру (наприклад, загальний вміст жиру щонайменше 67 %). У деяких варіантах біомаса містить приблизно 170-250 мг/г докозагексаєнової кислоти (ДГК) і/або приблизно 150-400 мг/г пальмітинової кислоти. У деяких варіантах, винахід забезпечує отримання ліпідної композиції, харчового продукту або іншого матеріалу, який містить водоростеву біомасу (наприклад, висушені водоростеві біомаси) або її компонент (наприклад, компонент жирної кислоти). У деяких варіантах водоростева біомаса (наприклад, висушені водоростеві біомаси (наприклад, отримані за методом, описаним в даному документі)) містить потрібний загальний об'єм жиру і/або інших компонентів (наприклад, більше ніж приблизно 68 % загального жиру, більше ніж приблизно 69 % загального жиру, більше ніж приблизно 70 % загального жиру, більше ніж приблизно 71 % загального жиру, більше ніж приблизно 72 % загального жиру, більше ніж приблизно 73 % загального жиру, більше ніж приблизно 74 % загального жиру, більше ніж приблизно 75 % загального жиру, більше ніж приблизно 76 % загального жиру, більше ніж приблизно 77 % загального жиру або більше ніж приблизно 78 % загального жиру). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, яка містить більше 67 % загального жиру), висушується таким чином, щоб вона містила менше 5 % вологи (наприклад, менше 4,5 % вологи, менше 4 % вологи, менше 3,5 % вологи, менше 3 % вологи, менше 2,5 % вологи, менше 2 % вологи або менше 1,5 % вологи). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, що містить менше 5 % вологи), містить приблизно 170-250 мг/г або більше докозагексаєнової кислоти (ДГК) (наприклад, приблизно 170-180 мг/г ДГК, приблизно 180-190 мг/г ДГК, приблизно 190-200 мг/г ДГК, приблизно 200-210 мг/г ДГК, приблизно 210-220 мг/г ДГК, приблизно 220-230 мг/г ДГК, приблизно 230-240 мг/г ДГК, приблизно 240-250 мг/г ДГК або більше 250 мг/г ДГК). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, що містить менше 5 % вологи), містить приблизно 150-400 мг/г або більше пальмітинової кислоти (назва IUPAC: гексадеканова кислота (наприклад, приблизно 150-200 мг/г, приблизно 200-225 мг/г, приблизно 225-250 мг/г, приблизно 250-275 мг/г, приблизно 275-300 мг/г, приблизно 300-325 мг/г, приблизно 325-350 мг/г, приблизно 350-375 мг/г, приблизно 375-400 мг/г або більш ніж 400 мг/г)). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, що містить менше 5 % вологи), містить приблизно 300-600 мг/г або більше загального вмісту жирних кислот (наприклад, приблизно 300-350 мг/г, приблизно 350-400 мг/г, приблизно 400-450 мг/г, приблизно 450-500 мг/г, приблизно 500-550 мг/г, приблизно 550-600 мг/г або більше 600 мг/г жирних кислот)). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, що містить менше 5 % вологи), містить менш ніж приблизно 15 % білку (наприклад, менш ніж приблизно 14 % білку, менш ніж приблизно 13 % білку, менш ніж приблизно 12 % білку, менш ніж приблизно 11 % білку, менш ніж приблизно 10 % білку, менш ніж приблизно 9 % білку або менш ніж приблизно 8 % білку). У деяких варіантах водоростева біомаса або її компонент, отримані у результаті 3 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 застосування винаходу, використовуються у виробництві біопалива (наприклад, біодизелю). У деяких варіантах водоростева біомаса або її компонент, отримані у результаті застосування винаходу, використовуються для приготування харчового продукту (наприклад, корму для тварин або його компонентів). КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1 відображає дані великомасштабного виробництва гетеротрофної водоростевої біомаси відповідно до аспектів винаходу. Фіг. 2 відображає склад жирної кислоти у водоростевій біомасі, зібраній з кількох незалежних великомасштабних водоростевих культур. Фіг. 3 відображає характеристику складної жирної кислоти біомаси, зібраної з використанням матеріалів і методів, описаних у даному документі. ВИЗНАЧЕННЯ У даному документі "фосфоліпід" відноситься до органічної сполуки, яка має наступну загальну структуру: 1 2 3 де R - залишок жирної кислоти, R - залишок жирної кислоти або -OH і R є -H або азот, + який містить складний холін (HOCH2CH2N (CH3)3OH)Ю, етаноламін (HOCH2CH2NH2), інозит або 1 2 3 серин. R і R не можуть одночасно бути ОН. Коли R є -OH, сполука являє собою 3 діацилглікерофофат, а коли R є азотовмісною сполукою, склад є фосфатидом, таким як: лецитин, цефалін, фосфатидилсерин або плазмалоген. Термін "ефір фосфоліпіду", який використовується у даному документі, відноситься до фосфоліпіду, що має простий ефірний зв'язок у положенні 1 гліцеринового остову. Приклади ефіру фосфоліпіду містять серед іншого алкилацилфосфатидилхлорін (AAPC), лізоалкилацилфосфатидилхлорін (LAAPC) і алкилацилфосфатидилетаноломін (AAPE). "Неефірний фосфоліпід" є фосфоліпідом, який не має ефірного зв'язку у положенні 1 гліцеринового остова. Термін "омега-3 жирна кислота", який використовується у цьому документі, відноситься до поліненасичених жирних кислот, що мають кінцевий подвійний зв'язок у вуглецевому ланцюзі між третім і четвертим атомами вуглецю з метилового кінця молекули. Неграничні приклади омега-3 жирних кислот містять 5, 8, 11, 14, 17 - ейкозапентаєнову кислоту (EPA), 4, 7, 10, 13, 16, 19 - докозагексаєнову кислоту (DHA) і 7,10, 13, 16, 19 – докозапентаєнову кислоту (DPА). Терміни "триацилгліцерид", "тригліцерид" і "триацилгліцерин" та "TAG", які використовуються у цьому документі, відносяться до ефіру, отриманого з гліцерину і трьох жирних кислот, де "жирні кислоти" відносяться до карбонової кислоти з довгим нерозгалуженим аліфатичним хвостом, який є або насиченим, або ненасиченим. Пальмітинова кислота – це єдиний неграничний приклад триацилгліцериду. Терміни «% м/м (маса/маса)» і "м/м %» та їх граматичні еквіваленти, які використовуються у даному документі, відносяться до об'єму (у відсотках) даної речовини у складній речовині на основі співвідношення маси до маси. Наприклад, складна речовина, яка містить 50 % м/м фосфоліпідів, означає, що маса фосфоліпідів складає 50 % від її загальної маси (тобто, 50 г фосфоліпідів в 100 г складної речовини, такої як олія). Термін "водорості", який використовується у даному документі, відноситься до одноклітинних або багатоклітинних організмів, раніше класифікованих як рослини, які виникають у прісній або солоній воді, автотрофні або гетеротрофні, але у яких відсутнє справжнє стебло, коріння і листя. Використовуваний у цьому документі термін "гетеротрофний" відноситься до організму, який не може синтезувати свою власну їжу і залежить від органічних речовин (наприклад, складних і/або простих органічних речовини) для харчування. Таким чином, термін "гетеротрофні водорості" відноситься до водоростей, які не можуть синтезувати власну їжу і залежать від органічних речовин для харчування. Використовуваний у даному документі термін "автотрофний" відноситься до організму, здатного синтезувати свою власну їжу з неорганічних речовин, використовуючи світло або хімічну енергію. Використовуваний у даному документі 4 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 термін "водорості" також відноситься до мікроводоростей і, таким чином, поширюється на "мікроводорості". Термін "водоростева композиція" відноситься до будь-якого композиції, що містить морські водорості, такої як водна композиція, а не обмежується лише водяною масою або культурою, в якій вирощуються водорості. Водоростева композиція може бути водоростевою культурою, водоростевою біомасою, концентрованою водоростевою культурою або зневодненою масою водоростей і може бути в рідкій, напіврідкій або твердій формі. Нерідка водоростева композиція може бути охарактеризована у контексті рівня вологості або відсотку маси твердих речовин. "Водоростева культура" є водоростевою композицією, яка містить у собі живі водорості. Термін "водорості" також відноситься до макроводоростей (широко відомих як морські водорості) і мікроводоростей. Терміни "водоростева біомаса" або "біомаса" відноситься до зібрання або маси водоростевих клітин, вирощених у даному районі чи екосистемі у даний момент часу. Район або екосистема може бути середовищем, яке виникло природно (наприклад, водоймою), або синтетичним середовищем (наприклад, ферментером або біореактором (наприклад, відкритим або закритим)). Термін "загальний жир" відноситься до суми тригліцеридів, фосфоліпідів, воскового ефіру і стеролів, присутніх у матеріалі. Наприклад, вміст "загального жиру" водоростевої біомаси відноситься до суми тригліцеридів, фосфоліпідів, воскового ефіру і стеролів, присутніх у біомасі. Крім того, до загального жиру відносяться як насичені, так і ненасичені жири. Термін "консервант" відноситься до речовини, яка збільшує строк зберігання продуктів харчування та непродовольчих товарів за рахунок уповільнення або запобігання погіршенню смаку, запаху, кольору, текстури, зовнішнього вигляду, харчової цінності або безпеки. Консервант потрібен для забезпечення відсутності смертельних, незворотних дій, що призводять до часткового або повного руйнування або недієздатності мікробних клітин. Стерилізуючі речовини, санітарні засоби, дезінфікуючі засоби, спроциди, вірусоциди і тубекульоциди забезпечують таку незворотну дію, яку іноді називають "бактерицидною дією". І навпаки, консервант може забезпечити гальмівну або бактеріостатичну дію, яка має зворотний характер, щоб цільові мікроби могли знову розмножуватись у разі видалення консерванту. Перш за все, основні відмінності між консервантом і дезінфікуючим засобом полягають у способі дії (консервант запобігає росту, а не вбиває мікроорганізми) і тривалості впливу (консервант діє від кількох днів до кількох місяців, у той час як дезінфікуючий засіб може діяти лише кілька хвилин). Терміни "дріжджі" і "дріжджові клітини" відноситься до еукаріотичних мікроорганізмів, які за класифікацією в царстві грибів мають клітинну стінку, клітинну мембрану і внутрішньоклітинні компоненти. Дріжджі не формують конкретне таксономічне або філогенетичне угруповання. В даний час відомі приблизно 1500 видів. Вважається, що був описаний тільки 1 % всіх видів дріжджів. Термін "дріжджі" часто сприймається як синонім для S.cerevisiae, однак про філогенетичну різноманітність дріжджів свідчить їх розміщення в обох категоріях Аскомицетів і Базіоміцетів. Дріжджі, які розпукуються ("істинні дріжджі"), класифікуються у порядку Цукроміцеталів. Більшість видів дріжджів розмножуються безстатевим шляхом брунькування, хоча деякі розмножуються шляхом бінарного ділення. Дріжджі є одноклітинними, хоча деякі види стають багатоклітинними через формування рядка пов'язаних клітин, які брунькуються, відомих як псевдогіфи або помилкові гіфи. Розмір дріжджів може сильно відрізнятись в залежності від виду. Звичайний розмір складає 3-4 мікрометра в діаметрі, хоча деякі дріжджі можуть досягати більше 40 мікрометрів. Терміни "збагачені селеном дріжджі" та "селеновані дріжджі", які використовуються у даному документі, відносяться до будь-яких дріжджів (наприклад, Saccharomyces cerevisiae), які вирощуються у середовищі, що містить неорганічні солі селену. Цей винахід не обмежується використанням селенової солі. Натомість, очікується, що різні солі селену є корисними для даного винаходу, у тому числі серед інших селеніт натрію, селенат натрію, селеніт кобальту або селенат кобальту. Вільний селенометіонін (наприклад, не зв'язаний з клітиною або дріжджами) також може використовуватись як джерело селену для збагачених селеном дріжджів, оскільки дріжджі засвоюють цю форму селену. Під час вирощування, завдяки хімічній подібності між селеном і сіркою, дріжджі засвоюють селен замість сірки у тому місці, де у клітині звичайно перебувають сірковмісні органічні сполуки. Селеновмісна сполука у таких дріжджових препаратах є селенометіоніном, який буде присутній у формі, що сполучається з поліпептидами/білками. Величина сумарного клітинного селену, присутнього у формі селенометіоніну в таких препаратах, буде різною, однак може складати від 10 % до 100 %, 20 %-60 %, 50 %-75 % і від 60 % до 75 %. Залишок органічного селену в селенованих дріжджових препаратах переважно складається з проміжних сполук на шляху до біосинтезу 5 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 селенометіоніну. До них відносяться, у тому числі через інших селеноцистеїн, селеноцистатіонін, селеногомоцистеїн і селено-аденосилселенометіонін. Об'єм залишкової неорганічної солі селену у готовому продукті, як правило, досить низький (< 2 %). Однак дане застосування винаходу не обмежується цим відсотком. Даним винаходом передбачаються препарати, що містять більше (наприклад, від 2 % до 70 %) або менше (наприклад, від 0,1 % до 2 %) ніж вищевказаний відсоток. Термін "SEL-PLEX" відноситься до висушених, нежиттєздатних збагачених селеном дріжджів (наприклад, Sacchoromyces Cerevisiae з інвентарним номером CNCM 1-3060, Національної колекції культур мікроорганізмів (CNCM) Інституту Пастера в Парижі, Франція), вирощених за допомогою дозованого ферментаційного підживлення, який забезпечує зростання обсягів тростинної патоки і солей селену, щоб таким чином звести до мінімуму шкідливі наслідки від впливу солі селену на швидкість росту дріжджів і сприяти оптимальному засвоєнню неорганічного селену у клітині органічного матеріалу. Залишковий неорганічний селен видаляється (наприклад, з використанням ретельного процесу промивання) і не перевищує 2 % від загального вмісту селену. Термін "органічний селен", який використовується у даному документі, відноситься до будьякої органічної сполуки, у якій селен замінює сірку. Таким чином, органічний селен може відноситись до будь-якої такої сполуки, що біосинтезується дріжджами, або він може стосуватись вільних органічних хімічно синтезованих селеносполук. Прикладом останнього є вільний селенометіонін. Термін "неорганічний селен", який використовується у даному документі, в цілому відноситься до будь-якої солі селену (наприклад, селеніту натрію, селенату натрію, селеніту кобальту і селенату кобальту). Є також безліч інших неорганічних джерел селену (див., наприклад, перелічені у в індексі Мерка). Селеновані дріжджі можуть утворюватись з використанням джерела неорганічного селену, у тому числі серед інших селеніту натрію, селенату натрію, селеніту кобальту, селенату кобальту, селенової кислоти, селенистої кислоти, броміду селену, хлориду селену, гексафториду селену, оксиду селену, оксиброміду селену, оксихлориду селену, оксифториду селену, сульфіду селену, тетраброміду селену, чотирихлористого селену і тетрафториду селену. Термін "стінка дріжджової клітини", яка також називається "СДК", відноситься до стінки клітини дріжджового організму, що оточує мембрану плазми і внутрішньоклітинні компоненти дріжджів. Стінка дріжджової клітини складається з зовнішнього шару (в основному з манану) і внутрішнього шару (в основному глюкану і хітину). Функція стінки клітини має забезпечувати структуру і захист метаболічно активної цитоплазми. У стінці дріжджової клітини відбувається сигналізація і розпізнання. Склад стінки дріжджової клітини змінюється від штаму до штаму і відповідно до умов росту дріжджів. Термін "очищений" або "очистити", який використовується у даному документі, відноситься до видалення компонентів із зразка. Наприклад, стінки дріжджової клітини або екстракти стінки дріжджової клітини очищають видаленням компонентів стінки недріжджової клітини (наприклад, клітинної оболонки і/або дріжджових внутрішньоклітинних компонентів); їх також очищають за допомогою видалення забруднюючих речовин або інших агентів, відмінних від стінки дріжджової клітини. У результаті видалення компонентів дріжджових клітин і/або забруднюючих речовин із стінки недріжджової клітини збільшується відсоток стінки дріжджової клітини або її компонентів у зразку. Термін "in vivo", який використовується у даному документі, відноситься до досліджень і/або експериментів, проведених на живому організмі, які стосуються біологічного організму. Термін "in vitro", який використовується у даному документі, відноситься до штучного середовища за межами живого організму і біологічних процесів або реакцій, які зазвичай виникають у організмі, але отримані у штучному середовищі. До середовищ in vitro можуть відноситись серед інших пробірки і клітинна культура. Термін "високопродуктивна рідинна хроматографія" і термін "ВПРХ", які використовуються у даному документі, відносяться до форми рідинної хроматографії для розділення сполук. Сполуки розчиняються у розчині. Їх розділення відбувається шляхом введення пробірки із зразком суміші на колонку. Інструменти ВПРХ складаються з резервуару рухомої фази, насоса, інжектора, колонки для розділення і детектора. Наявність аналітів в елюаті фіксується шляхом кількісного виявлення змін у індексі рефракції, поглинанні УФ і видимої області на заданій довжині хвилі, флуоресценції після збудження відповідною довжиною хвилі або електрохімічної реакції. Термін "скануюча електронна мікроскопія" і термін "СЕМ", які використовуються у даному документі, відносяться до використання типу електронного мікроскопа, який відтворює 6 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зображення поверхні зразка шляхом сканування його за допомогою високоенергетичного пучка електронів у шаблоні растрового сканування. Електрони взаємодіють з атомами, з яких складається зразок, виробляючи сигнали, що містять інформацію про топографію поверхні зразка, його складу та інших властивостей, таких як електропровідність. Термін "агент фіксації", які використовується у даному документі, відноситься до хімічної речовини, яке здатна прикріплювати одну речовину до іншої для того, щоб "зафіксувати", стабілізувати або іншим чином зберегти речовину у її поточній формі, щоб запобігти погіршенню або інакшим змінам її стану. Часто агенти фіксації використовуються в скануючій електронній мікроскопії (СЕМ) для приготування зразка. Первинний агент фіксації, який використовується у даному документі як термін "первинний агент фіксації", відноситься до першого агента фіксації, який застосовується для "фіксації" речовини. Вторинний агент фіксації, який використовується у даному документі як термін "вторинний агент фіксації", відноситься до другого агента фіксації, який застосовується для "фіксації" речовини. Третинний агент фіксації, який використовується у даному документі як термін "третинний агент фіксації", відноситься до третього агента фіксації, який застосовується для "фіксації" речовини. Термін "аналіт", який використовується у даному документі, відноситься до атома, молекули, групи атомів і/або молекул, речовини або хімічної складової. Розмір власне аналіту виміряти неможливо, однак можна визначити його аспекти або властивості (фізико-хімічні, біологічні і т.д.) з використанням аналітичної процедури, такої як СЕМ. Наприклад, ніхто не може виміряти сам по собі "стілець" (аналіт-компонент), але можна виміряти висоту, ширину і т.д. стільця. Подібним чином, ніхто не може виміряти мікотоксин, але можна виміряти його флуоресценцію, яка пов'язана з його концентрацією. Термін "сигнал", який використовується у даному документі, зазвичай застосовується по відношенню до будь-якого процесу, що виявляється, який вказує, що відбулася реакція (наприклад, зв'язування антитіла з антигеном). Можна проводити як якісну, так і кількісну оцінку сигналу. Приклади типів "сигналів" містять серед іншого радіоактивні сигнали, флуорометричні сигнали або колориметричні сигнали продуктів/реагентів. Термін "біодоступність", який використовується у даному документі, відноситься до фракції молекули або компоненту, які доступні для організму або потрапляють в системний кровоток. Коли молекула або компонент вводяться внутрішньовенно, їх біодоступність становить 100 %. Однак, коли молекула або компонент вводяться через інші шляхи (наприклад, перорально), їх біодоступність зменшується (завдяки неповному всмоктуванню і пресистемному метаболізму). Якщо йдеться про споживання, біодоступність відноситься до рівнів всмоктування і утилізації поживних речовин. Наприклад, різні форми однакової поживної речовини, можуть мати різну біодоступність. Термін "ефективний об'єм", який використовується у даному документі, відноситься до об'єму складної речовими, достатнього для отримання корисних чи потрібних результатів. Ефективний об'єм можна вводити і/або поєднувати з іншим матеріалом за один або декілька прийомів, застосувань або дозувань, і його обмеження за конкретною формою або способом введення не передбачається. Термін "травлення", який використовується у даному документі, відноситься до перетворення їжі, кормів, або інших органічних сполук у всмоктувані форми для пом'якшення, розкладання або руйнуватися під дією тепла і вологи або хімічного впливу. Термін "система травлення", який використовується у даному документі, відноситься до системи (у тому числі шлунково-кишкового тракту), у якій може або відбувається травлення. Термін "харчові продукти", який використовується у даному документі, відноситься до матеріалу (матеріалів), які споживаються ссавцями (наприклад, людьми і тваринами) і привносять енергію та/або поживні речовини в раціон ссавця. До прикладів харчових продуктів відносяться серед інших загальний змішаний раціон (ЗЗР), фураж, гранули, концентрати, премікси, супутні продукти, зерно, зерно після перегонки, меляса, волокно, корми, трава, сіно, ядра плодів, листя, шріт, розчини і добавки. Терміни "харчова добавка", "біологічно активна добавка", "біологічно активна композиція" тощо, які застосовуються у даному документі, відносяться до харчового продукту у формі харчової або біогологічно активної добавки, які використовуються як частина харчування. У даному документі описані приклади біологічно активних композицій. Термін "тварина", який використовується у даному документі, відноситься до представників царства "тварин". До них відносяться серед інших худоба, сільськогосподарські тварини, свійські тварини, домашні тварини, морські і прісноводні тварини та дикі тварини. 7 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Терміни "застосування" і термін "введення" відноситься до надання суб'єкту субстанції, у тому числі лікарського засобу, пролікарняного засобу або іншої речовини чи терапевтичного лікування (наприклад, суб'єкту або клітинам, тканинам, і органам in vivo, in vitro або ex vivo). Застосування може проводитись через очі (офтальмологічне), рот (пероральне), шкіру (місцеве або трансдермальне), ніс (назальне), легені (інгаляційне), слизову оболонку порожнини рота (буккальне), вуха, ректум, вагіну та з допомогою ін'єкцій (наприклад, внутрішньовенне, підшкірне, інтратуморальне, внутрішньочеревне і т. д.) і тому подібне. Термін "комбіноване застосування" і термін "комбіноване введення", які застосовуються у даному документі, стосуються застосування до суб'єкта принаймні двох речовин або видів терапії і/або матеріалів (наприклад, кормів). Комбіноване застосування двох або більше речовин або видів терапії може бути одночасним або перша речовина/вид терапії може застосовуватись перед другою речовиною/видом терапії. Термін "лікування", який застосовується у даному документі, відноситься до заходів, які сприяють поліпшенню і/або купіруванню симптомів хвороби. Термін "лікування" відноситься як до терапевтичного лікування, так і профілактичних або превентивних заходів. Наприклад, до суб'єктів, яким може бути корисне лікування за допомогою комбінованих речовин і методів даного винаходу, відносяться ті, які вже захворіли, із розладами здоров'я, а також ті, захворювання і/або розлад здоров'я яких повинне бути попереджене (наприклад, використовуючи профілактичне лікування відповідно до даного винаходу). Термін "з ризиком захворювання", який використовується у даному документі, відноситься до суб'єкта, який схильний до конкретного захворювання. Ця схильність може бути генетичною (наприклад, особлива генетична тенденція захворіти, така як спадкові розлади здоров'я) або під дією інших факторів (наприклад, віку, ваги, умов навколишнього середовища, впливу шкідливих сполук, присутніх в навколишньому середовищі і т.д.). Термін "захворювання", термін "інфекція" і термін "патологічний стан або реакція", які використовуються у даному документі, відносяться до стану, ознак і/або симптомів, пов'язаних з погіршенням звичайного самопочування живої тварини або будь-якого з її органів або тканин, які перешкоджають або змінюють виконання звичайних функцій, і може бути реакцією на фактори навколишнього середовища (наприклад, недоїдання, небезпечні умови праці або кліматичні умови, у тому числі мікотоксикози), специфічні збудники інфекції (наприклад, хробаки, бактерії або віруси), внутрішні дефекти організму (наприклад, різні генетичні аномалії) або поєднання цих та інших факторів. Термін "страждати від хвороби", який використовується у даному документі, відноситься до суб'єкта (наприклад, тварини або людини), який відчуває конкретне захворювання, і не обмежується будь-якими конкретними ознаками або симптомами, або захворюванням. Термін "токсичний", який використовується у даному документі, відноситься до будь-якого шкідливого, отруйного, небезпечного чи іншого негативного впливу за суб'єкт, клітину або тканину у порівнянні з тією ж клітиною або тканиною до контакту з або застосування токсину/токсичної речовини. Термін "фармацевтична композиція", який використовується у даному документі, стосується поєднання активної речовини з носієм, інертним або активним, внаслідок чого композиція найкраще підходить для діагностичного або терапевтичного застосування in vitro, in vivo або ex vivo. Термін "фармацевтично прийнятний" і термін "фармакологічно прийнятний", які використовуються у даному документі, відносяться до композицій, які по суті не спричиняють відомі побічні реакції у порівнянні з відомими корисними реакціями. Термін "інокуляція" відноситься до введення мікроорганізму або суспензії мікроорганізмів (наприклад, водоростевих, дріжджових, грибкових, бактеріальних і т.д.) в культуральне середовище. Інокуляція є дією або процесом введення чого-небудь у середовище, у якому воно буде рости або розмножуватися. Термін "інокулянт" і термін "попередній інокулянт", які використовуються у даному документі, відносяться до клітин, що використовуються в інокуляції як клітини для закладення культури. Термін "центрифугування", який використовується у даному документі, відноситься до розділення молекул за розміром або щільністю з використанням відцентрових сил, що виникають під час обертання ротору, який містить об'єкт обертання, навколо нерухомої осі, застосовуючи силу, перпендикулярну їй. Центрифуга працює, застосовуючи принцип осідання, відповідно до якого застосовується доцентрове прискорення для рівномірного розподілу речовини за більшою і меншою щільністю у різних шарах щільності Термін "концентрація", який використовується у даному документі, відноситься до об'єму речовини у певному просторі. Концентрація зазвичай виражається в одиницях маси на одиницю 8 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 об'єму. Для розведення розчину потрібно додати більше розчинника або зменшити кількість розчиненої речовини (наприклад, шляхом селективного випаровування, сушіння розпиленням, сушіння виморожуванням, наприклад, концентрованого екстракту клітинної стінки дріжджів або концентрованого модифікованого дріжджового екстракту клітинної стінки дріжджів). І навпаки, для того, щоб зробити розчин концентрованим, потрібно додати більше розчину або зменшити об'єм розчинника. Термін "шар", який використовується у даному документі, зазвичай відноситься до горизонтального відкладення, організованого в пласт матеріалу, що утворює покривну частину або сегмент, отриманий після розділення центрифугуванням відповідно до властивостей щільності матеріалу. Термін "урожай", який використовується у даному документі, відноситься до збирання або об'єднання отриманих матеріалів (наприклад, об'єднання матеріалів, отриманих у процесі виробництва дріжджів). Термін "сушіння", який використовується у даному документі, відноситься до сушіння розпиленням, сушіння виморожуванням, сушіння повітрям, вакуумного сушіння або будь-якого іншого процесу, який зменшує або усуває рідину в речовині. Термін "сушіння розпиленням", який використовується у даному документі, часто відноситься до використовуваного методу висушування рідкої речовини з використанням гарячого газу для випаровування рідини, щоб зменшити або видалити її з речовини. Іншакше кажучи, матеріал сушать шляхом розпилення або розпилення у потоці нагрітого сухого повітря. Термін "сушіння виморожуванням", термін "ліофілізація" і термін "сушіння сублімацією", які використовуються у даному документі, відносяться до видалення розчинника з речовини у замороженому стані за допомогою сублімації. Це досягається шляхом заморожування матеріалу, що піддається сушінню, нижче його евтектичної точки, а потім застосуванням прихованої теплоти сублімації. Точний контроль підведення тепла дозволяє висушувати продукт із замороженого продукту без зворотного розплавлення. Під час практичного застосування, процес прискорюється і точно контролюється в умовах зниженого тиску. Термін "сухий вільно плинний порошок", який використовується у даному документі, відноситься до вільно плинного сухого порошку, наприклад, порошоку, який можна буде висипати із контейнера, мішка, посудини тощо без перешкод у вигляді великих грудок. Термін "подрібнення", який використовується у даному документі, відноситься до зменшення розміру частинок від удару, різання або тертя. Термін "проба" використовується у даному документі у широкому сенсі, враховуючи зразок або культуру, отримані з будь-якого джерела, а також біологічні проби та проби з навколишнього середовища. Біологічні проби можуть отримуватись від тварин (у тому числі людей) і враховують рідини, тверді речовини, тканини і гази. Біологічні проби включають препарати крові, такі як: плазма, сироватка крові тощо. До проб навколишнього середовища відноситься екологічний матеріал, такий як: поверхня речовини, грунт, вода, кристали і промислові проби. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Даний винахід стосується складних речовин, які містять водорості з високим ліпідним вмістом, а також методів їх отримання і використання. Зокрема, він відноситься до водоростевої біомаси з високим ліпідним вмістом і водоростевих ліпідних матеріалів, отриманих з неї, методів її отримання, а також біопалива (наприклад, біодизелю) і складання або отримання харчових сумішей (наприклад, кормів для тварин). Складні речовини і методи винаходу знаходять застосування у різних напрямках, у тому числі для виробництва біопалива, споживання у їжу (наприклад, харчування людей і відгодівля тварин), а також для терапевтичних і дослідницьких цілей. Відповідно, один аспект даного винаходу забезпечує процес підготовки біомаси водоростей, яка містить підвищені об'єми загального вмісту жиру (наприклад, на основі м/м). У наведених в даному документі прикладах деякі варіанти його застосування передбачають метод генерації водоростевої біомаси, яка містить потрібний високий рівень загального вмісту жиру (наприклад, більш ніж 60 % загального жиру, на відміну від традиційних методів, які генерують біомасу водоростей, яка містить значно нижчий рівень загального вмісту жиру (наприклад, 60 % або менше загального жиру)). Велика проблема, яка пов'язана з біопаливом на основі водоростей (наприклад, біодизелем), полягає в забезпеченні отримання біомаси без використання енергії, більшої ніж та, яка отримана в кінцевому паливному продукті. Відповідно, в деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації біомаси водоростей, яка містить більше 65 % загального жиру. У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації водоростевої біомаси, яка містить більше ніж 66 % загального жиру. У деяких варіантах даний метод 9 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 забезпечує генерацію водоростевої біомаси, яка містить більше ніж 67 % загального жиру. У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації водоростевої біомаси, яка містить більше ніж 68 % загального жиру. У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації водоростевої біомаси, яка містить більше ніж 69 % загального жиру. У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації водоростевої біомаси, яка містить більше ніж 70 % загального вмісту жиру. У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод генерації водоростевої біомаси, яка містить більше 70 % (наприклад, більше ніж 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % або більше) жирів на основі м/м. У деяких варіантах застосування методу використовується закрита система біореактора (наприклад, ферментер), хоча даний винахід не обмежується тільки ним (наприклад, в деяких варіантах можна застосовувати відкриті біореактори). У кращому варіанті вирощування водоростевої біомаси за цим винаходом проводиться в асептичних умовах, а в іншому кращому варіанті для вирощування водоростей (наприклад, для генерації водоростевої біомаси, яка містить високий вміст жиру (наприклад, більш ніж 67 % жиру)) застосовується процес з дозованим підживленням. У деяких варіантах застосування даний винахід забезпечує метод культивування водоростей для отриманням водоростевої біомаси, яка містить потрібний, високий загальний вміст жиру (наприклад, 67 % або більше загального жиру), відповідно до прикладів 1 і 2. Наприклад, у деяких варіантах даний винахід забезпечує метод культивування водоростей, який передбачає культивування водорості у поетапному порядку, щоб отримати водоростеву біомасу, яка містить потрібний високий загальний вміст жиру (наприклад, 67 % або більше загального жиру).У деяких варіантах поетапний процес для культивування водорості передбачає відтавання збереженого штаму водоростей і додавання (наприклад, у стерильних умовах) відталої водорості у колбу місткістю1 л, яка струшується, з середовищем, що містить джерело вуглецю (наприклад, цукор (наприклад, глюкозу)), екстракт дріжджів і морську сіль. У деяких варіантах джерело вуглецю присутнє у концентрації 50 г/л, дріжджовий екстракт присутній у концентрації 10 г/л і/або морська сіль присутня у концентрації 4 г/л. У деяких варіантах колбу місткістю 1 л, яка містить водоростеве середовище, витримують при 30 °C і струшують (наприклад, при 100-400 оборотах за хвилину) до досягнення водоростями експоненційної фази росту при неповному виснаженні джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)). За результатами експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування даного винаходу, встановлено, що водорості досягають експоненціального росту при неповному виснаженні джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)) протягом періоду часу від 72 до 144 годин. Таким чином, у деяких варіантах водорості культивують у культуральній колбі місткістю 1 л при 30 °C протягом 72-144 годин при принаймні 100-400 оборотах за хвилину (наприклад, 250 оборотах за хвилину) у середовищі, що містить джерело вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), дріжджовий екстракт і морську сіль, які використовуються для інокуляції першої стадії посіву культури (наприклад, у більшій посудині (наприклад, місткістю 40, 27 або 18 л)). У деяких варіантах культуральне середовище, використане у першій стадії посіву, містить джерело вуглецю наприклад, цукор (наприклад, глюкозу)), дріжджовий екстракт, сульфат магнію, хлорид кальцію і/або хлорид магнію. У кращому варіанті культуральне середовище, використане у першій стадії посіву, містить 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію. У деяких варіантах культура першого етапу посіву обробляється при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 7 %-15 % (наприклад, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %), хоча можна використовувати нижчі і вищі умови насичення розчиненим киснем. У кращому варіанті культура першого етапу посіву обробляється при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 10 %. У деяких варіантах культура першого етапу посіву, що містить водорості і середовище, підтримується при 30 °C і культивується до досягнення водоростями експоненційної фази росту і спожиття 20 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)) при його неповному виснаженні. За результатами експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування даного винаходу, встановлено, що водорості досягають експоненційного росту, споживають принаймні 20 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)) при його неповному виснаженні протягом періоду часу від 24 до 48 годин після інокуляції першої стадії посіву культури. У деяких варіантах водорості, які культивували у культурі першої стадії посіву при 30 °C протягом 24-48 годин у середовищі, що містить джерело вуглецю (наприклад, цукру 10 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, глюкози)), дріжджовий екстракт, сульфат магнію, хлорид кальцію і хлорид магнію, використовуються для інокуляції культури другої стадії посіву у більших посудинах (наприклад, місткістю 2000 л). У деяких варіантах культуральне середовище, використане у другій стадії посіву культури, містить джерело вуглецю (наприклад, цукор (наприклад, глюкозу)), дріжджовий екстракт, сульфат магнію, хлорид кальцію і/або хлорид магнію. У кращому варіанті культуральне середовище, використане у другій стадії посіву культури, містить приблизно 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію. У деяких варіантах обробку культури другої стадії посіву проводять при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 7 % - 15 % (наприклад, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %), хоча можуть використовуватись нижчі і вищі умови насичення кисню. У кращому варіанті обробку культури другої стадії посіву проводять при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 10 %. У деяких варіантах культуру другої стадії посіву, яка містить водорості, і середовище витримують при 30 °C і культивують до досягнення водоростями експоненційної фази росту і спожиття принаймні 20 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)) при його неповному виснаженні. За результатами експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування даного винаходу, встановлено, що водорості досягають експоненційного росту, споживають принаймні 20 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)) при його неповному виснаженні протягом періоду часу від 24 до 48 годин після інокуляції другої стадії посіву культури. У деяких варіантах водорості, які культивували у культурі другої стадії посіву при 30 °C протягом 24-48 годин у середовищі, що містить джерело вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), дріжджовий екстракт, сульфат магнію, хлорид кальцію і хлорид магнію, використовуються для інокуляції у великих посудинах (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л або ще більших резервуарах (наприклад, головному ферментері)), які містять середовище, що використовується для подальшого культивування/ферментації водоростей. У деяких варіантах після перенесення культури другої стадії посіву у великі посудини (наприклад, головний ферментер), культуральне середовище (наприклад, дозоване середовище), присутнє у великій посудині (наприклад, головному ферментері), містить джерело вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), дріжджовий екстракт, сульфат магнію, сечовину, хлорид кальцію, хлорид магнію і/або первинний кислий фосфат калію. У кращому варіанті культуральне середовище, яке використовується у культурі (наприклад, у посудинах місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л або більших (наприклад, головному ферментері)), включає приблизно 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, 4,0 г/л сульфату магнію, приблизно 1 г/л сечовини, приблизно 2 г/л хлориду кальцію, приблизно 2 г/л хлориду магнію і/або приблизно 0,25 г/л первинного кислого фосфату калію. У деяких варіантах обробку культури великого об'єму проводять при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 7 % - 15 % (наприклад, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %), хоча можуть використовуватись нижчі і вищі умови насичення киснем. У кращому варіанті обробку культури великого об'єму проводять при 30 °C під потоком повітря і в умовах перемішування, щоб підтримувати розчинений кисень на рівні приблизно 10 %. У кращому варіанті джерело вуглецю (наприклад, цукор (наприклад, глюкоза)) підтримується на рівні 10 г/л протягом певного періоду часу (наприклад, 1 або більше днів (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або більше днів (наприклад, з використанням процесу дозованого підживлення)). Наприклад, у деяких варіантах після спожиття необхідного об'єму глюкози водоростями у великій посудині (наприклад, після спожиття водоростями приблизно 20-30 г/л глюкози у великій посудині (наприклад, після спожиття 30 г/л глюкози)), починається введення глюкози і дозованого підживлення. За результатами експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування даного винаходу, встановлено, що дозоване підживлення має додаватись протягом приблизно 34 годин, хоча можна використовувати коротші (наприклад, приблизно 32, 28, 24, 20 години або менше) і довші (наприклад: 36, 38, 42, 46, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168 годин або більші) періоди часу. У інших кращих варіантах після закінчення процесу дозованого підживлення, вирощування водоростей продовжується у посудинах великого об'єму до моменту видалення/спожиття усіх поживних речовин із середовища. За результатами експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування даного винаходу, встановлено, що поживні речовини вичерпуються із середовища у період приблизно між 12 і 24 годинами після припинення процесу дозованого підживлення. У деяких варіантах врожай біомаси водоростей збирають з культурального середовища/бульйону великого об'єму і використовують у 11 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 описаному в цьому документі порядку. У деяких варіантах культуральний бульйон великого об'єму проходить центрифугування, щоб отримати водоростеву біомасу. У деяких варіантах перед центрифугуванням культуральний бульйон великого об'єму охолоджується. Хоча для практичного застосування винаходу розуміння його механізму не потрібне, і даний винахід не обмежений будь-яким конкретним механізмом, у деяких варіантах охолодження культурального бульйону підвищує щільність водоростевої біомаси з підвищеним рівнем загального жиру (наприклад, ліпідів/олії) і дозволяє отримати більш високий рівень відновлення біомаси, ніж той, що досягається за відсутності охолодження культурального бульйону (див., наприклад, Приклад 3). Винахід не є об'єктом обмежень температури, до якої культура великого об'єму охолоджується перед центрифугуванням. У деяких варіантах культура великого об'єму охолоджується до температури від 0 до 50 °C, від 5 до 40 °C, від 5 до 25 °C, від 5 до 15 °C або від 5 до 10 °C. Отже, у винаході використовуються режими дозування і дозованого підживлення культивування водоростей (наприклад, окремо і/або послідовно у першому і/або другому етапі посіву) для того, щоб генерувати водоростеву біомасу, яка містить потрібний вміст жиру (наприклад, вміст жиру більше ніж 67 %). Винахід не обмежується окремими компонентами, присутніми в середовищі, яке використовується або в режимі дозування, або в режимі дозованого підживлення. У деяких варіантах культуральне середовище, присутнє в момент інокуляції головного ферментера (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л) містить середовище з початковим співвідношенням азоту (N), фосфору (P), і калію (K) у вигляді 46:13:8,5. У кращому варіанті співвідношення N:P:К є однаковим в режимах дозування і дозованого підживлення культури. У деяких варіантах співвідношення магнію (Mg) і кальцію (Са) у культуральному середовищі, яке використовується у режимі дозування і дозованого підживлення, складає 3:1. У іншому варіанті співвідношення хлориду (Cl2) і сульфату (SО4) у культуральному середовищі, яке використовується у режимі дозування і дозованого підживлення, складає 1:1. У деяких варіантах співвідношення сульфату (SO4) і фосфату (PO4) у середовищах в момент інокуляції головного ферментера (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л) складає 16:1. У деяких варіантах загальне співвідношення сульфату (SO4) і фосфату (PO4), яке додається дозами і як підживлення наприкінці повної культури (наприклад, у тому числі інокулянт, культури першої стадію посіву, другої стадії посіву та головного ферментера), яка генерує водоростеву біомасу, що містить потрібний вміст жиру (наприклад, більш ніж 67 % жиру), складає 5,3:1, а в деяких варіантах співвідношення хлориду (Cl2) і фосфату (PО4) в середовищах в момент інокуляції головного ферментера (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л) складає 16:1. У деяких варіантах загальне співвідношення хлориду (Cl2) і фосфату (PО4), який дозують і піживлюють наприкінці культури (наприклад, у тому числі інокулянт, культури першої стадію посіву, другої стадії посіву та головного ферментера), яка генерує водоростеву біомасу, що містить потрібний вміст жиру (наприклад, більш ніж 67 % жиру), складає 5,3:1. Як описано в прикладі 2 нижче, винахід також передбачає створення композиції, яка містить водоростеву біомасу (наприклад, висушену водоростеву біомасу (наприклад, отриману у відповідності з методом, описаним в даному документі)), що містить бажану кількість загального жиру і/або інші компоненти. Наприклад, у деяких варіантах, даний винахід передбачає створення композиції, яка містить водоростеву біомасу (наприклад, висушену водоростеву біомасу), що містить більше 67 % загального жиру (наприклад, більш ніж приблизно 68 % загального жиру, більш ніж приблизно 69 % загального жиру, більш ніж приблизно 70 % загального жиру, більш ніж приблизно 71 % загального жиру, більш ніж приблизно 72 % загального жиру, більш ніж приблизно 73 % загального жиру, більш ніж приблизно 74 % загального жиру, більш ніж приблизно 75 % загального жиру, більш ніж приблизно 76 % загального жиру, більш ніж приблизно 77 % загального жиру, більш ніж приблизно 78 % загального жиру або вищий об'єм загального жиру), в деяких варіантах водоростеву біомасу (наприклад, яка містить більше 67 % загального жиру) сушать таким чином, щоб біомаса містила менше 5 % вологи (наприклад, менше 4,5 % вологи, менше 4 % вологи, менше 3,5 %вологи, менше 3 % вологи, менше 2,5 % вологи, менш ніж 2 % вологи або менше 1,5 % вологи). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, яка містить менше 5 % вологи), містить приблизно 170-250 мг/г або більше докозагексаєнової кислоти (ДГК) (наприклад, приблизно 170-180 мг/г ДГК, приблизно 180-190 мг/г ДГК, приблизно 190-200 мг/г ДГК, приблизно 200-210 мг/г ДГК, приблизно 210-220 мг/г ДГК, приблизно 220-230 мг/г ДГК, приблизно 230-240 мг/г ДГК, приблизно 240-250 мг/г ДГК або більше 250 мг/г ДГК). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, яка містить 12 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 менше 5 % вологи) містить приблизно 150-400 мг/г або більше пальмітинової кислоти (назва Міжнародного союзу теоретичної і прикладної хімії - гексадеканова кислота (наприклад, приблизно 150-200 мг/г, приблизно 200-225 мг/г, приблизно 225-250 мг/г, приблизно 250-275 мг/г, приблизно 275-300 мг/г, приблизно 300-325 мг/г, приблизно 325-350 мг/г, приблизно 350375 мг/г, приблизно 375-400 мг/г або більш ніж на 400 мг/г)). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, яка містить менше 5 % вологи), містить приблизно 300-600 мг/г або більше загального вмісту жирних кислот (наприклад, приблизно 300-350 мг/г, приблизно 350-400 мг/г, приблизно 400-450 мг/г, приблизно 450-500 мг/г, приблизно 500-550 мг/г, приблизно 550-600 мг/г або більше 600 мг/г жирних кислот)). У деяких варіантах водоростева біомаса, отримана у результаті застосування винаходу (наприклад, висушена біомаса, яка містить менше 5 % вологи) містить менш ніж приблизно 15 % білку (наприклад, менш ніж приблизно 14 % білку, менш ніж приблизно 13 % білку, менш ніж приблизно 12 % білку, менш ніж приблизно 11 % білку, менш ніж приблизно 10 % білку, менш ніж приблизно 9 % білка, або менш ніж приблизно 8 % білку). Застосування винаходу не обмежуються штамом або видами водоростей, які використовуються в методах і композиціях, описаних у даному документі. Безумовно, у винаході знаходять застосування різні види водоростей, у тому числі серед інших один або більше видів роду Thraustochytrium. У деяких варіантах, водорості є одним з видів роду Chlorella. У деяких варіантах водорості є одним з видів роду Schizochytrium. У деяких варіантах водорості є одним з видів роду Crypthecodinium. У деяких варіантах водорості Thraustochytrium stratium, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium aureum, Crypthecodinium cohnii і/або Aurantiochytriuм sp. У кращому варіанті у методах і композиціях, описаних у даному документі, використовується Schizochytrium limacinum. Застосування винаходу не обмежується видом ліпідів, отриманих з допомогою процесу винаходу, щоб отримати водоростеву біомасу з підвищеними рівнями ліпідів, відображених у даному документі. У деяких варіантах, до ліпідів, отриманих з допомогою даного винаходу відносяться серед інших, міристинова кислота, пальмітинова кислота, олеїнова кислота, лінолева кислота, докозапентаєнова кислота (ДПК), докозагексаєнова кислота (ДГК) і стеаринова кислота. Ці ліпіди були корисними як для здоров'я тварин, так і людей для профілактики різних захворювань, таких як серцево-судинні і запальні захворювання, і в дитячому харчуванні для правильного розвитку мозку і сітківки очей. У іншому варіанті застосування даного винаходу передбачає процес виробництва водоростевої біомаси, що містить підвищені рівні (наприклад, більш ніж 67 %) загального вмісту жиру, з видів водоростей (наприклад, Schizochytrium limacinum). Цей процес полягає у культивуванні водоростей у посудині з першим дозованим підживленням, яка містить середовище (наприклад, містить приблизно 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду укальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію), з перенесенням (наприклад, в стерильних умовах) культури з першим дозованим підживленням у культуральне середовище дозованого посіву (наприклад, яке містить приблизно 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію), з перенесенням (наприклад, в стерильних умовах) культури з другим дозованим підживленням у культуральну посудину великого об'єму, яка містить середовище (наприклад, основний ферментер (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л, який містить, наприклад, середовище, у якому приблизно 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, 4,0 г/л сульфату магнію, приблизно 1 г/л сечовини, приблизно 2 г/л хлориду кальцію, приблизно 2 г/л хлориду магнію і/або приблизно 0,25 г/л первинного кислого фосфату калію), де рівень глюкози у посудині великого об'єму для культивування підтримують на рівні 10 г/л з використанням процесу дозованого підживлення, у якому урожай водоростевих клітин збирається з культури великого об'єму у період 12-24 годин після припинення процесу дозованого підживлення у разі видалення/спожиття усіх поживних речовин із середовища. Інший варіант застосування даного винаходу передбачає процес виробництва водоростевої біомаси, що містить підвищені рівні (наприклад, більш ніж 67 %) загального вмісту жиру, з видів водоростей, наприклад, Schizochytrium limacinum). За цим процесом культуральне середовище (наприклад, протягом кожної стадії ферментації (наприклад, перша стадія посіву, друга стадія посіву і/або стадія вирощування дозованої культури (з підживленням)) містить джерело вуглецю (наприклад, цукру), дріжджовий екстракт, джерело фосфату (наприклад, фосфат певинного кислого калію, сульфат магнію і/або сульфату цинку), джерело азоту (наприклад, сечовину), хлорид магнію і/або хлорид кальцію. У кращому варіанті застовування даного винаходу 13 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 передбачається процес виробництва водоростевої біомаси, що містить підвищені рівні (наприклад, більше 67 %) загального вмісту жиру, з штаму водоростей, у якому культуральне середовище (наприклад, протягом кожної стадії ферментації (наприклад, перша стадія посіву, друга стадія посіву і/або стадія вирощування дозованої культури (з підживленням)), містить джерело вуглецю (наприклад, цукру), дріжджовий екстракт, джерело фосфату (наприклад, фосфат первинного кислого калію, сульфат магнію і/або сульфату цинку), джерело азоту (наприклад, сечовину), хлорид магнію і/або хлорид кальцію. Проте, застосування винаходу не обмежується типом поживної речовини, використовуваної у культуральному середовищі, у якому вирощують водорості. У деяких варіантах у середовище додають одне або більше джерел вуглецю. Приклади джерел вуглецю представлені серед іншого вуглеводами, такими як: глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза чи розчинний крохмаль, а також олеїнова кислота, жирами, такими як: соєва олія, меляса, гліцерин, маніт і ацетат натрію, борошном з бавовняного насіння, гліцерином, мелясою і кукурудзяним екстрактом. У деяких варіантах до середовища додають одне або більше джерел азоту. До прикладів джерел азоту відносяться серед іншого природні джерела азоту, такі як пептон, дріжджовий екстракт, солодовий екстракт, м'ясний екстракт, казамінова кислота і кукурудзяний екстракт, органічні джерела азоту, такі як: глутамат натрію і сечовина, або неорганічні джерела азоту, такі як: ацетат амонію, сульфат амонію, хлорид амонію, нітрат амонію і сульфат натрію. У деяких варіантах до середовища додають одне або більше джерел фосфату. До прикладів джерел фосфату відносяться серед іншого фосфат калію і дігидрофосфат калію, неорганічні солі, такі як: сульфат амонію, сульфат натрію, сульфат магнію, сульфат заліза, сульфат цинку, і сульфат міді. У деяких варіантах у культурне середовище вносять хлорид магнію, хлорид кальцію і/або вітаміни. Застосування винаходу не обмежується об'ємом (наприклад, концентрацією) кожного з цих компонентів у культуральному середовищі. У деяких варіантах використовується об'єм, який є нешкідливим для росту водоростей. У кращому варіанті об'єм (наприклад, концентрація і/ або співвідношення) кожного інгредієнта середовища встановлюється на рівні (наприклад, протягом кожної стадії ферментації (наприклад, перша стадія посіву, друга стадія посіву і/або стадія вирощування дозованої культури (з підживленням)), який сприяє формуванню морських водоростей з високим вмістом жиру (наприклад, водоростевої біомаси, яка містить 67 % або більше жирового вмісту). У деяких варіантах у культуральному середовищі присутнє джерело вуглецю (наприклад, цукор) на рівні від 20 до 120 грамів на літр середовища. У інших варіантах у культуральному середовищі присутнє джерело вуглецю (наприклад, цукор) на рівні від 30-70 грамів на літр середовища. А ще інших інших варіанта у культуральному середовищі присутнє джерело вуглецю (наприклад, цукор) на рівні приблизно від 20 до 120 грамів на літр середовища. У кращому варіанті джерело у культуральному середовищі присутнє джерело вуглецю (наприклад, цукор) на рівні приблизно 50 грамів на літр середовища. У деяких варіантах відношення сечовини до фосфату первинного кислого калію (сечовина: KH2PO4) приблизно знаходиться у діапазоні 5:0,1 (наприклад, приблизно 4.5:0.1; 4:0.25; 3:0.25; 4:0.3; 5:0.3; 5:0,5; 4:0,5; 3:0,5; 2:0.5 або 1:0,5), хоча можна використовувати більш високі і більш низькі співвідношення (наприклад, 1:1, 1:2, 1:3 тощо). У кращому варіанті співвідношення сечовини до фосфату первинного кислого калію у культуральному середовищі складає 4:1. У деяких варіантах культуральне середовище не містить хлорид натрію. У інших варіантах культуральне середовище містить хлорид натрію. У деяких варіантах співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцію (CaCl2) складає 1:1. У деяких варіантах співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцію (CaCl2) складає 1:2. Безумовно, можуть використовуватись різні співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцій (CaCl2), у тому числі серед іншого 1:1; 1:1,125; 1:1,5; 1:1,75; 1:2; 1:2,125; 1:2,25; 1:2,5, 2,5:1; 2,25:1; 2,125:1; 2:1; 1,75:1; 1,5:1; 1,25:1 або 1,125:1. У кращому варіанті співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцію (CaCl2) у культуральному середовищі першого посіву складає 1:1, а в іншому кращому варіанті співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцію (CaCl2) у культуральному середовищі другого посіву складає 1:1. У ще одному кращому варіанті співвідношення сульфату магнію (MgSO4) і хлориду кальцію (CaCl2) у культуральному середовищі великого об'єму (наприклад, головному ферментері (наприклад, місткістю 70000 л, 120000 л, 220000 л), який у цьому документі також називають третім культуральним середовищем) складає 1:2. В іншому кращому варіанті, після приготування середовища, регулювання показника рН середовища є необов'язким. Наприклад, під час поетапного процесу ферментації відповідно до винаходу не потрібне регулювання показника рН культурального середовища, у якому вирощують водорості. Хоча розуміння механізму застосування виноходу не є обов'язковим, і даний винахід не обмежений будь-яким конкретним механізмом дії, у деяких варіантах стерильні і/або асептичні умови поетапного процесу ферментації, передбачені винаходом, 14 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 виключають необхідність регулювання рН культуральної середовища в процесі ферментації. У деяких варіантах значення показника рН культурального середовища знаходиться у діапазоні між 4,0 і 6,5. Культивування водоростей протягом поетапного процесу ферментації відповідно до винаходу можна проводити при температурі від 10 °C до 40 °C, краще від 17 °C до 35 °C, і найкраще - приблизно при 30 °C. Культивування може бути здійснюватись в умовах керування і перемішування, струшування, у стаціонарному стані або подібних умовах. У кращому варіанті водорості культивують в таких умовах, щоб розчинений кисень підтримувався на рівні або трохи вище 10 %. У деяких варіантах застосування винаходу передбачається внесення біогологічно активної, кормової, поживної або терапевтичної добавки, яка містить усі або частину водоростевої біомаси (наприклад, сухої водоростевої біомаси, описаної у даному документі, і/або отриманої відповідно до методів і композицій, описаних у даному документі) з підвищеним рівнем загального жиру (наприклад, більше 67 %). Наприклад, у деяких варіантах даний винахід передбачає внесення біогологічно активної, кормової, поживної або терапевтичної добавки, яка містить висушену розпиленням водоростеву біомасу з підвищеним рівнем загального вмісту жиру (наприклад, більше 67 %). В інших варіантах застосування винаходу передбачає внесення біогологічно активної, кормової, поживної або терапевтичної добавки, яка містить ліпіди, екстраговані і/або виділені з водоростевої біомаси з підвищений рівнем загального вмісту жиру (наприклад, більше 67 %). Застосування винаходу не обмежується типом ліпідів, екстрагованих і/або виділених з водоростевої біомаси з підвищеним рівнем загального вмісту жиру (наприклад, більше 67 %). У деяких варіантах ліпіди містять міристинову кислоту, пальмітинову кислоту, олеїнову кислоту, лінолеву кислоту, альфа-ліноленову кислоту(ALA), стеарідонову кислоти (SDA), ейкозатрієнову кислоту, ейкозатетраєнову кислоту, ейкозапеніаєнову кислоту (EPA), докозапентаєновую кислоту (DPA), клупанодонову кислоту, докозагексаєнову кислоту (DHA), тетракозапентаноєнову кислоту і/або тетракозагексаєнову кислоту. У кращому варіанті ліпіди містять DHA і/або пальмітинову кислоту. У деяких варіантах застосування даний винахід забезпечує процес підготовки ліпідів (наприклад, описаних у даному документі (наприклад, докозагексаєнової кислоти)), який передбачає вирощування штаму водоростей (наприклад, Schizochytrium limacinum) у першому культуральному середовищі (наприклад, яке містить 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), 10 г/л дріжджового екстракту і 4 г/л морської солі) і інкубацію культури при температурі у діапазоні 25 °C-35 °C протягом періоду приблизно від 72 до 144 годин, перенесення культури в друге культуральне середовище (наприклад, яке містить 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію) і інкубацію культури при температурі в діапазоні 25 °C-35 °C протягом періоду часу приблизно 24-48 годин, перенесення культури в третє культуральне середовище (наприклад, яке містить 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, приблизно 0,15 г/л сульфату магнію, приблизно 0,15 г/л хлориду кальцію і/або 0,15 г/л хлориду магнію) і інкубацію культури при температурі в діапазоні 25 °C -35 °C протягом періоду часу приблизно 24-48 годин, перенесення у четверте культуральне середовище (наприклад, яке містить 50 г/л джерела вуглецю (наприклад, цукру (наприклад, глюкози)), приблизно 7,5 г/л дріжджового екстракту, 4,0 г/л сульфату магнію, приблизно 1 г/л сечовини, приблизно 2 г/л хлориду кальцію, приблизно 2 г/л хлориду магнію і/або приблизно 0,25 г/л фосфату первинного кислого калію) і інкубацію культури при температурі в діапазоні 25 °C-35 °C (наприклад, 30 °C) протягом періоду часу приблизно 24-192 годин (наприклад, приблизно 36, приблизно 38, приблизно 42, приблизно 46, приблизно 60, приблизно 72, приблизно 84, приблизно 96, приблизно 108, приблизно 120, приблизно 132, приблизно 144, приблизно 156, приблизно 168, приблизно 180 або приблизно 192 годин), виділення клітинної біомаси з культури та екстракцію ліпідів з біомаси. У деяких варіантах водоростеві культури (наприклад, вирощені для отримання водоростевої біомаси) вирощують в підходящих обсягах і посудинах, починаючи від 100 мл до сотень тисяч літрів, у колбах або великих ферментерах, використовуючи різні описані в даному документі поживні середовища. У ще одному аспекті поділ клітинної біомаси, яка містить ліпіди, здійснюється за допомогою центрифугування, фільтрації і/або флокуляції або подібними методами. У кращому варіанті водоростеву біомасу отримують із культури за допомогою центрифугування. В іншому кращому варіанті центрифугування відбувається після охолодження клітинної культури (наприклад, з метою дозволити відновлення клітин, які містять підвищені рівні ліпідів). У деяких варіантах 15 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриману водоростеву біомасу піддають сушінню розпилюванням і використовують (наприклад, безпосередньо в кормах для тварин або для виробництва біопалива). У одному з варіантів застосування цього винаходу водорості є сумішшю різних видів водоростей (наприклад, одного або більше з описаних у даному документі видів водоростей). У деяких варіантах водоростева біомаса, яка містить підвищені рівні загального вмісту жиру і/або ліпідів, екстрагованих з водоростей біомаси, що містить підвищені рівні загального жиру, доповнюється ліпідами (наприклад, поліненасиченими жирними кислотами) з інших джерел, у тому числі серед іншого рослинних джерела. У деяких варіантах водоростева біомаса, яка містить підвищені рівні загального жиру, також містить ліпіди у концентрації (м/м) у діапазоні від приблизно 60 %-90 % (наприклад, приблизно 65 %-90 %, приблизно 66 %-89 %, приблизно 67 %-88 %, приблизно 68 %-87 %, приблизно 68 %-86 %, приблизно 69 %-85 % або приблизно 70 %-80 %). Таким чином, водоростева біомаса, яка містить підвищені рівні ліпідів, може мати у композиції ліпіди у концентрації 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 8 % 2, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 % тощо. В одному варіанті водоростева біомаса, що містить підвищені рівні загального жиру, включає ліпіди в концентрації щонайменше 67 %. У деяких варіантах DHA вноситься у композицію водоростевої біомаси, отриманої, відповідно до винаходу, у діапазоні від 1 % до 75 % від загального об'єму ліпідів/ жирних кислот. Таким чином, DHA може бути представлена у композиції в об'ємі загального вмісту жирних кислот у розмірі 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, приблизно 35 %, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 % тощо. У інших варіантах DHA може вноситись у композицію в об'ємі загального вмісту жирних кислот у діапазоні від 1 % до 5 %, 1 % до 10 %, 1 % до 15 %, 1 % до 20 %, 1 % до 25 %, від 1 % до 30 %, від 5 % до 10 %, від 5 % до 15 %, від 5 % до 20 %, від 5 % до 25 %, від 5 % до 30 %, від 10 % до 15 %, від 10 % до 20 %, від 10 % до 25 %, від 10 % до 30 %, від 15 % до 20 %, від 15 % до 25 %, від 15 % до 30 %, від 20 % до 25 %, від 20 % до 30 %, від 25 % до 30 %, 30 % до 35 %, від 35 % до 40 %, від 40 % до 45 %, від 45 % до 50 %, від 50 % до 55 %, від 55 % до 60 %, від 60 % до 65 %, від 65 % до 70 %, 70 %, до 75 % тощо. У деяких варіантах пальмітинова кислота входить до композиції водоростевої біомаси, передбаченої винаходом, у розмірі від 1 % до 75 % від загального об'єму ліпідів/жирних кислот. Отже, пальмітинова кислота може бути представлена у композиції у ромірі 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, приблизно 35 %, приблизно 40 %, приблизно 45 %, приблизно 50 %, приблизно 55 %, приблизно 60 %, приблизно 65 %, приблизно 70 %, приблизно 75 %, тощо від загального об'єму жирних кислот. У інших варіантах пальмітиновова кислоти може бути представлена у композиції у ромірі від 1 % до 5 %, 1 % до 10 %, 1 % до 15 %, 1 % до 20 %, 1 % до 25 %, 1 % до 30 %, 5 % до 10 %, 5 % до 15 %, 5 % до 20 %, 5 % до 25 %, 5 % до 30 %,10 % до 15 %, 10 % до 20 %, 10 % до 25 %, 10 % до 30 %, 15 % до 20 %, 15 % до 25 %, 15 % до 30 %, 20 % до 25 %, 20 % до 30 %, 25 % до 30 %, 30 % до 35 %, 35 % до 40 %, 40 % до 45 %, 45 % до 50 %, 50 % до 55 %, 55 % до 60 %, 60 % до 65 %, 65 % до 70 %, 70 % до 75 % тощо від загального об'єму жирних кислот. Додаткові варіанти застосування даного винаходу передбачають процеси виготовлення кормових добавок для тварин. Таким чином, один з аспектів даного винаходу є процес виготовлення кормової добавки для тварин, яка містить ліпіди з водоростей (наприклад, водоростеву біомасу). Цей процес передбачає культивування водоростей для отриманням водоростевої біомаси, яка містить потрібний, підвищений рівень загального жиру (наприклад, більш ніж 67 % загального жиру), екстракцію водоростевого ліпіду з біомаси водоростей для отриманням водоростевої олії і/або видалення води з водоростевої біомаси для отримання її з вмістом твердих речовин приблизно від 5 % до 100 % масової долі, у якій кормова добавка для тварин містить ліпіди з морських водоростей. У деяких варіантах жирні кислоти, отримані з водоростей, є коротколанцюговими, середньоланцюговими або довголанцюговими омега-3 жирними кислотами. В інших варіантах водостевий ліпід, який екстрагують з водоростевої біомаси, поєднується з водоростевою біомасою, а вміст твердих речовин у якій складає приблизно від 5 % до 100 % масової долі. Кормова добавка, передбачена винаходом, може поєднануватись з іншими компонентами для виробництва оброблених харчових або кормових продуктів (наприклад, для відгодівлі тварин і/або харчування людей). Ці інші харчові компоненти містять одну або більше 16 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ферментних добавок, вітамінні харчові добавки і мінеральні харчові добавки. Отримана (комбінована) кормова добавка може бути змішана у відповідному об'ємі з іншими харчовими компонентами, такими як: зернові і рослині білки, для формування обробленого харчового продукту. Обробка цих компонентів для отримання обробленого харчового продукту може бути проведена з використанням будь-яких звичайно використовуваних переробних пристороїв. Кормові/харчові добавки, передбачені даним винаходом, можуть використовуватись як власне добавки у їжу/корм додатково з вітамінами, мінералами, іншими кормовими ферментами, сільськогосподарськими побічними продуктами (наприклад, висівками або кукурудзяне глютенове борошно) або у поєднанні з ними. У подальшому аспекті даний винахід передбачає процес виробництва омега-3 жирних кислот з підвищеним вмістом тканин для тварин/людей. Цей процес передбачає харчування тварин/людей кормовою добавкою, яка містить ліпіди/жирні кислоти, отримані з водоростей. Також, кормова добавка містить: (а) водоростевий ліпід, екстрагований з біомаси культивованих водоростей і/або (б) водоростеву біомасу із культивованих водоростей, в яких вода видаляється з водоростевої біомаси для досягнення вмісту твердих речовин приблизно від 5 % до 100 % масової долі, внаслідок чого у тварин/людей підвищується вміст тканин омега-3 жирних кислот. Застосування винаходу не обмежується будь-яким конкретним видом ссавця (наприклад, твариною або людиною), для яких композиція, передбачений винаходом, може бути корисним. Безумовно, до тварини, передбачених винаходом відносяться будь-які тварини, чиї яйця, м'ясо, молоко або інші продукти, які споживаються людьми або тваринами. Отже, до тварин, передбачених винаходом, відносяться серед іншого риба, птиця (кури, індички, качки та ін), свині, вівці, кози, кролики, ялова і молочна худоба. У деяких варіантах застосування даний винахід забезпечує метод лікування захворювання ссавців у суб'єкта, який його потребує, шляхом введення цьому суб'єкту терапевтично ефективного об'єму композиції, передбаченого винаходом. У деяких варіантах до захворювання ссавців, яке підлягає лікуванню, відносяться серед іншого серцево-судинні захворювання, запальні захворювання і різні ракові захворювання. В інших варіантах до серцево-судинних захворювань, які підлягають лікуванню, відносяться серед іншого гіпертригліцеридемія, ішемічна хвороба серця, інсульт, інфаркт міокарда і атеросклероз. У ще одних варіантах до запальних захворювань, які підлягають лікуванню, відносяться серед іншого астма, артрит, алергічний риніт, псоріаз, атопічний дерматит, запальні захворювання кишечника, хвороба Крона і алергічний ринокон'юктивіт. В інших варіантах до ракових захворювань, які підлягають лікуванню, відносяться серед іншого рак передміхурової залози, рак молочної залози і рак товстої кишки. У ще одних варіантах до захворювань ссавців, які підлягають лікуванню, віносяться психічні розлади. До психічних розладів відносяться серед іншого депресія, біполярні розлади, шизофренія. Окрім цього, композиції, передбачені винаходом, можуть бути використані для підтримки і/або посилення когнітивної функції. У деяких варіантах застосування даний винахід забезпечує метод лікування захворювання ссавців у суб'єкта, який потребує його, шляхом введення суб'єкту терапевтично ефективного об'єму ліпідної композиції, передбаченого і/або отриманного з водоростевої біомаси, що містить підвищений рівень загального жиру (наприклад, більш ніж 67 % загального жиру). До суб'єктів, яким таке лікування може бути корисним відносяться серед іншого птахи і ссавці. До ссавців, передбачених даним винаходом, відносяться серед іншого собакоподібні, кішкоподібні, велика рогата худоба, козлоподібні, конеподібні, вівцеводібні, свиноподібні, гризуни (наприклад, миші і щури), зайцеподібні, примати (у тому числі примати, інші ніж люди), люди і ссавці у період внутрішньоутробного розвитку. Підходить будь-який вид ссавця, який потребує лікування відповідно до цього винаходу. До ссавців, передбачених даним винаходом, відносяться серед іншого собакоподібні, кішкоподібні, велика рогата худоба, козлоподібні, конеподібні, вівцеводібні, свиноподібні, гризуни (наприклад, миші і щури), зайцеподібні, примати (у тому числі примати, інші ніж люди), люди і ссавці у період внутрішньоутробного розвитку. Згідно з деякими варіантами застосування даного винаходу ссавцем є ссавець, інший ніж людина. У деяких варіантах ссавець є людиною. Відповідно до даного винаходу можна лікувати ссавців обох статей і на будь-якій стадії розвитку (наприклад, новонароджених, дітей, неповнолітніх, підлітків, дорослих). До птахоподібних відповідно до даного винаходу відносяться кури, качки, індики, гуси, перепели, фазани, безкілеві (наприклад, страусині), домашні птахи (наприклад, папуги і канарки) і птахи в яйці. Водорості Будь-які водорості, здатні, використовуючи описані тут процеси, до продукування підвищених рівнів загального жиру або водоростевої біомаси, яка містить підвищені рівні загального жиру, можуть використовуватись в процесах, композиціях, харчових добавках, 17 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біопаливі і/або прекурсорі біопалива і/або кормових добавках, передбачених цим винаходом. Отже, в деяких варіантах водорості, передбачені даним винаходом, вибирають з Thraustochytrium, Dinophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Pinguiophyceae та їх комбінацій. В інших варіантах водорості, предебачені даним винаходом, вибирають з Thraustochytrium striatum, Thraustochytrium roseum, Thraustochytrium aureum, Crypthecodinium cohnii, Parietochloris spp., Rhodomonas spp., Cryptomonas spp., Parietochloris spp., Hemisehnis spp., Porphyridium spp., Glossomastix spp. та їх комбінацій. У ще інших варіантах водорості, передбачені даним винаходом, вибирають з Parietochloris incise, Rhodomonas salina, Hemiselmis brunescens, Porphyridium cruentum, Glossomastix chrysoplasta та їх комбінацій. А також в інших варіантах винахід передбачає водорость Schizochytrium limacinum У деяких варіантах застосування даного винаходу водорості є сумішшю різних видів водоростей. В інших варіантах - водорості одного виду водоростей. У деяких варіантах застосування даного винаходу водоростеві ліпіди/жирні кислоти представлені у вигляді водоростевих олій. В інших варіантах водоростеві ліпіди/жирні кислоти представлені у вигляді водоростевої біомаси (наприклад, висушеної (наприклад, порошкоподібної) біомаси). Крім того, до водоростей, передбачених винаходом, відносяться серед іншого дикоростучі, мутантні (природні або індуковані) водорості або водорості, отримані внаслідок генної інженерії. У кращому варіанті водорості, які використовуються у процесах, композиціях, БАДах, біопаливі або прекурсорі біопалива і/або кормових добавках відповідно до даного винаходу, не є генетично модифікованими організмами. Терміни "генетично модифікований варіан" і "генетично модифікований організм", які використовуються у даному документі, відносяться до штаму водоростей, який в цілях досягнення бажаного результату має модифікований (наприклад, мутований, змінений) геном відносно своєї нормальної форми (наприклад, дикого типу, який зустрічається в природі). До того ж, до водоростей, передбачених винаходом, відносяться водорості, які містять клітини з клітинними стінками зменшеної товщини у порівнянні з клітинами дикого типу водоростей, внаслідок чого клітинна стінка зменшеної товщини покращує екстракцію і/або біодоступність водоростевої ліпідної фракції (наприклад, покращується легкість засвоєння водоростей і легкість екстракції водоростевих ліпідів/жирних кислот з клітин водоростевої біомаси). Водорості, які містять клітини з клітинними стінками зменшеної товщини у порівнянні з клітинами дикого типу водоростей, можуть бути природними, мутуваними і/або отриманими внаслідок генної інженерії, щоб мати клітинні стінки зменшеної товщини порівняно зі штамами дикого типу. Таким чином, в одному варіанті застосування винаходу водорості є водоростями, які мають клітинну стінку зменшеної товщини у порівнянні з диким типом водоростей, внаслідок чого клітинні стінки зменшеної товщини покращують екстракцію і/або біодоступність водоростевої ліпідної фракції. Методи отримання водоростей зі зменшеними клітинними стінками передбачають методи, передбачені у патенті WO 2006/107736 A1, який включений у даний документ шляхом посилання на нього у повному обсязі. Таким чином, водорості можуть бути видозмінені шляхом мутагенезу з мутагенів, які відомі фахівцям у даній галузі, у тому числі серед іншого за допомогою хімічних агентів або радіації. У конкретних варіантах до хімічних мутагенів відносяться у тому числі серед іншого етилметансульфонат (EMS), метилметан сульфонат (MMS), N-етил-N-нітрозосечовина (ENU), триетилмеламін (TEM), N-метил-N-нітрозосечовина (MNU), прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамід, діетилсульфат, акриламід мономер, мелфалан, азотистий іприт, вінкристин, діметилнітрозамін, N-метил-N'- нітро- нітрозогуанідін (MNNG), нітрозогуанідін, 2- амінопурін, 7,12 диметил- бенз(а)антрацен (DMBA), етиленоксид, гексаметилфосфорамід, бісулфан, діепоксиалкани (діепоксиоктан (DEO), діепоксибутан (BEB) і т.п.), 2-метоксі-6-хлор-9 (3-(етил-2-хлор-о-етипаміннопропиламо)акридин дигідрохлорид (ICR170), формальдегід тощо. До методів радіаційного мутагенезу відносяться, у тому числі серед іншого рентгенівські промені, гамма-випромінювання, ультрафіолетове світло тощо. Мутовані клітинні стінки можуть бути вибрані для на основі підвищеної чутливості до детергентів або спростегінання через мікроскоп за змінами у товщині клітинних стінок (див., наприклад, патент WO 2006/107736 A1) або будь-якого іншого методу, відомого у даній сфері діяльності, щоб виявити зменшену товщину клітинної стінки або зменшену цілісність клітинної стінки. Водорості, передбачені даним винаходом, можна культивувати відповідно до методик, відображених у Прикладах 1-3. Відповідно, у деяких варіантах водорості культивують при температурі в діапазоні від 10 °C до 35 °C. Таким чином, водорості можна культивувати при температурі 10 °C, 11 °C, 12 °C, 18 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C тощо. В інших варіантах водорості можна вирощувати в діапазоні від 20 °C до 35 °C, хоча можна використовувати нижчі (наприклад, менш ніж 20 °C) і вищі (наприклад, більш ніж 35 °C) температури. У кращому варіанті водорості вирощують при температурі близько 30 °C. У деяких варіантах після культивування збирають врожай водоростей. У деяких варіантах збирання врожаю водоростей виконується з використанням звичайних методик, відомих фахівцям у даній галузі, у тому числі центрифугуванням, флокуляцією або фільтрацією. У кращому варіанті до збору врожаю водоростеву культуру охолоджують, тим самим дозволяючи успішно зібрати водоростеві клітини, які містять підвищені рівні загального жиру. Зібраний урожай водоростевих клітин або водоростеву біомасу можна використовувати безпосередньо як джерело ліпіду/жирної кислоти або екстрагувати, щоб отримати олію, яка містить водоростеві ліпіди/жирні кислоти. У деяких варіантах, у яких біомаса водоростей має використовуватись безпосередньо, вода видаляється з водостевої біомаси для досягнення вмісту твердих речовин від приблизно 5 до 100 масових долей. У додаткових варіантах водоростева біомаса, яка має бути використана безпосередньо, складається з водоростей, що додатково містять клітинні стінки, принаймні частково зруйновані для збільшення екстракції і/або біодоступності водоростевої олії в клітинах. Руйнування водоростевих клітин можна проводити відповідно з відомими методами, у тому числі серед іншого обробкою клітин киплячою водою або шляхом механічного розриву, такого як: подрібнення, перетворення на порошок, руйнування ультразвуком, французьким пресом або будь-який іншим методом, відомим звичайному спеціалісту у даній сфері діяльності. У разі використання водоростевої біомаси, вода видаляється з неї для досягнення вмісту твердих речовин приблизно від близько 5 до 100 %. Відповідно, у деяких варіантах вода видаляється з водростевої біомаси для отримання вмісту твердих речовин приблизно у розмірі 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, і т.п… У додаткових варіантах вода видаляється з водоростевої біомаси для отримання вмісту твердих речовин у діапазоні приблизно від 5 % до 50 %, 5 % до 60 %, 5 % до 70 %, 5 % до 80 %, 5 % до 90 %, 5 % до 95 %, 10 % до 30 %, 10 % до 40 %, 10 % до 50 %, 10 % до 60 % 10 % до 65 %, 10 % до 70 %, 10 % до 75 %, 10 % до 80 %, 10 % до 85 %, 10 % до 90 %, 10 % до 95 %, 10 % до 100 %, 15 % до 40 %, 15 % до 50 %, 15 % до 60 %, 15 % до 65 %, 15 % до 70 %, 15 % до 75 %, 15 % до 80 %, 15 % до 85 %, 15 % до 90 %, 15 % до 95 %, 15 % до 100 %, 20 % до 50 %, 20 % до 60 %, 20 % до 65 %, 20 % до 70 %, 20 % до 75 %, 20 % до 80 %, 20 % до 85 %, 20 % до 90 %, 20 % до 95 %, 20 % до 100 %, 25 % до 50 %, 25 % до 60 %, 25 % до 70 %, 25 % до 75 %, 25 % до 80 %, 25 % до 85 %, 25 % до 90 %, 25 % до 95 %, 25 % до 100 %, 30 % до 50 %, 30 % до 60 %, 30 % до 70 %, 30 % до 75 %, 30 % до 80 %, 30 % до 85 %, 30 % до 90 %, 30 % до 95 %, 45 % до 100 %, 50 % до 70 %, 50 % до 75 %, 50 % до 80 %, 50 % до 85 %, 50 % до 90 %, 50 % до 95 %, 50 % до 100 %, 55 % до 75 %, 55 % до 80 %, 55 % до 85 %, 55 % до 90 %, 55 % до 95 %, 55 % до 100 %, 60 % до 75 %, 60 % до 80 %, 60 % до 85 %, 60 % до 90 %, 60 % до 95 %, 60 % до 100 %, 70 % до 80 %, 70 % до 85 %, 70 % до 90 %, 70 % до 95 %, 70 % до 100 %, 75 % до 85 %, 75 % до 90 %, 75 % до 95 %, 75 % до 100 %, 80 % до 85 %, 80 % до 90 %, 80 % до 95 %, 80 % до 100 %, 85 % до 90 %, 85 % до 95 %, 85 % до 100 %, 90 % до 95 %, 95 % до 100 % і т.п. У деяких варіантах клітини водоростевої біомаси руйнуються або піддаються лізису, і здійснюється екстракція водоростевих ліпідів. Водоростеві клітини можуть бути видалені вологими або сухими згідно зі звичайними методикам для отримання композиції, який містить ліпіди/жирні кислоти. Руйнування або лізис клітин водоростей може здійснюватись у відповідності до традиційних методів, у тому числі серед іншого обробкою клітин киплячою водою або шляхом механічного розриву, такого як: подрібнення, перетворення на порошок, руйнування ультразвуком, французьким пресом або будь-який іншим методом. Екстракція ліпідів/жирних кислот підданих лізису клітин проводиться з дотриманням відомих стандартних процедур, які використовуються для водоростевих та інших організмів, у тому числі серед іншого відділення рідкої фази від твердої фази після лізису клітин, екстракція ліпідів/жирних кислот у рідкій фазі шляхом додавання розчинника, випарювання розчинника і виділення ліпідів/жирних кислот, отриманих з рідкої фази підданих лізису клітин. Застосування винаходу не обмежується будь-яким конкретним розчинником, який використовується для екстракції. До розчинників відносять, у тому числі серед іншого гексан, 19 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хлороформ, етанол, метанол, ізопропиловий спирт, діетиловий ефір, діоксан, ізопропиловий ефір, дихлорметан, тетрагідрофуран, петролейний ефір та їх комбінації. У деяких варіантах ліпіди/жирні кислоти, отримані з водоростевої біомаси відповідно до даного винаходу, мають форму вільних жирних кислот, ефірів холестерину, соляних ефірів, ефірів жирних кислот, моногліцеридидів, дигліцеридів, тригліцеридів, діацилгліцеринів, моногріцеринів, сфінгофосфоліпідів сфінгогліколіпідв або будь-якої їх комбінацій (наприклад, для використання в композиціях, біопаливі, харчових продуктах, БАДах, харчових добавках або інших композиціях, описаних у даному документі). Метод приготування водоростевої біомаси У деяких варіантах застосування даний винахід забезпечує метод отримання біомаси водоростей, яка містить підвищені рівні загального жиру (наприклад, більш ніж 67 % ліпідів), передбачає культивування водоростей в культуральних умовах, достатніх для забезпечення водоростевої біомаси з підвищеними рівнями загального жиру (наприклад, більше ніж 67 % ліпідів), де урожай водоростевої біомаси збирають у момент припинення логарифмічної фази росту водоростей (див., наприклад, Приклади 1 і 2). Термін "логарифмічна фаза росту", який використовується у даному документі, відноситься до стадії культивування, що характеризується експоненційним зростаючим числом водоростевих клітин. Загалом, у культутральній системі існує характерна форма росту, яка настає після інокуляції, що складається з фази затримки, експоненційної або "логарифмічної фази" росту, негативної фази прискорення росту і стабилизаційної або "нерухомої фази". Наприклад, на логарифмічній фазі росту, оскільки ріст водоростей триває, клітини можуть досягати максимальної швидкості ділення клітин, а число клітин збільшується у логарифмічному відношенні до часу. Протягом періоду часу після початку логарифмічної фази може початись зниження швидкості поділу клітин і може початись відмирання деяких клітин. Це відображається на кривій росту поступовим вирівнюванням лінії. Зрештою, темпи відмирання клітин по суті дорівнюють темпам поділу клітин, а загальна життєздатна популяція може залишатися однаковою протягом певного періоду часу. Таке явище відоме як стаціонарна або нерухома фаза, і представлене на кривій росту у вигляді вирівнювання лінії, де нахил наближається до нуля. У кращому варіанті водоростева біомаса культивуєься в асептичних умовах (наприклад, для запобігання забрудненню і/або росту забруднюючих мікроорганізмів в культурі (наприклад, дріжджів, бактерій, вірусів і т.д.)). У деяких варіантах умови культивування є достатніми для водоростей для продукування підвищених рівнів загального жиру (наприклад, більш ніж 67 % у розрахунку на основі м/м). Умови культивування передбачають культуральне середовище, придатне для вирощування водоростей, тим самим забезпечуючи отримання водоростевої біомаси, яка містить підвищені рівні загального жиру (наприклад, більше ніж 67 % на основі м/м). У цьому документі описані придатні культуральні середовища. Середовище може також містити солі, вітаміни, мінерали, метали та інші поживні речовини. У кращому варіанті культуральні умови є достатніми для забезпечення відповідного об'єму поживних речовин і температури росту водоростей в умовах, які генерують водоростеву біомасу з підвищеними рівнями загального вмісту жиру. У деяких варіантах культивування не передбачає обмеження поживної речовини (наприклад, азоту, фосфору) протягом відповідного періоду часу, щоб збільшити об'єм загального жиру. Наприклад, культура може відчувати нагальну потребу у певній поживній речовині або перебувати в окремому культуральному середовищі, що не містить певну поживну речовину (наприклад, середовище вільне від фосфору чи азоту або культуральне середовище, що містить більш низькі рівні поживної речовини). У деяких варіантах культуральне середовище містить такий первинний вміст поживної речовини, який дозволяє збіднення цієї речовини у пізніший час під час експоненційного росту, але до моменту виснаження інших поживних речовин. У деяких варіантах культивування не передбачає обмеження поживної речовин (наприклад, азоту, фосфору) протягом процесу культивування. У деяких варіантах культивування єдиної водоростевої біомаси відбувається у двох або більше типах середовища у послідовному порядку. У деяких варіантах культивування єдиної водоростевої біомаси відбувається в трьох або більше типах середовища у послідовному порядку. Подібним чином культивування єдиної водоростевої біомаси може мати місце у двох або більше посудинах, де перша посудина використовували для інокуляції наступної посудини, ця наступна посудина використовується для інокуляції наступної за нею посудини і так далі. Хоча розуміння механізму винаходу не потрібне для його застосування, і даний винахід не обмежений будь-яким конкретним механізмом, у деяких варіантах послідовне культивування єдиної водорестевої біомаси у декількох посудинах, що містять різні типи середовища, дозволяє водоростевій біомасі рости таким чином, що загальний вміст жиру у ній є підвищеним у порівнянні із ростом 20 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 водоростевої біомаси (наприклад, тих же видів водоростей), вирощеної у одній посудині і середовищі для вирощування. Культивування водоростей можна здійснювати у звичайному біореакторі, який підходить для культивування водоростей з метою отримання водоростевої біомаси. Наприклад, водорості можна культивувати за допомогою процесу, який передбачає, у тому числі серед іншого дозування, дозування з підживленням, клітинну регенерацію і безперервну ферментацію. У кращому варіанті водорості культивують у процесі дозування з підживленням. Застосування винаходу не обмежується будь-яким конкретним способом або методом збирання урожаю водоростей з культурального середовища. Різні методи можуть бути використані для збору клітин водоростей з культуральної середовища. В одному варіанті збирання врожаю передбачає виділення водоростевої біомаси з культурального середовища шляхом відокремлення, наприклад, фільтрацією (наприклад, поясна фільтрація, барабанна фільтрація) і/або центрифугуванням. Якщо бажано, зібрані водоростеві клітини далі можна промивати, заморожувати, ліофілізувати, сушити розпиленням і/або зберігати в неокислюючій газовій атмосфері (наприклад, CO2, N2), щоб зменшити або усунути присутність О2. Як варіант, до зібраного врожаю клітин також можуть додаватись синтетичні і/або природні антиоксиданти, у тому числі серед іншого бутилгідрокситолуол (ВНТ), бутилгідроксіанізол (ВНА), третбутілгідрохінон (TBHQ), етоксіквін, бета-каротин, вітамін Е, вітамін С. У деяких варіантах даний винахід передбачає метод приготування водоростевої біомаси з підвищеними рівнями загального жиру. Цей метод полягає у культивуванні водоростей у культуральних умовах, достатніх для отримання водоростевої біомаси, яка містить підвищені рівні загального вмісту жиру і збирання урожаю водоростевої біомаси. Мікроводоростева біомаса У деяких варіантах винахід забезпечує водоростеву біомасу і/або її фракцію і/або екстракт (наприклад, для використання у виробництві біопалива і/або як харчового чи кормового). У деяких варіантах водоростева біомаса має вміст омега-3 жирних кислот щонайменше 10 % сухої ваги біомаси, наприклад, від приблизно 10 % до приблизно 50 %, від приблизно 10 % до приблизно 40 %), від приблизно 10 % до приблизно 30 %, від приблизно 10 % до 20 % сухої ваги біомаси. В одному варіанті водоростева біомаса готується відповідно до методів, передбачених даним винаходом. Наприклад, у деяких варіантах водоростеву біомасу отримують методом, який полягає у культивуванні водоростей у культуральних умовах, достатніх для отримання водоростевої біомаси з підвищенми рівнями загального жиру (наприклад, більш ніж 67 % м/м), у якому водоростева біомаса готується під час негативної фази прискорення зростання або стаціонарної фази. В іншому варіанті, урожай водоростевої біомаси збирають з культури під час експоненційної, логарифмічної фази росту. Ліпідні композиції, підготовлені з водоростевої біомаси У деяких варіантах даний винахід забезпечує метод приготування екстракту з ліпідів, жирних кислот (наприклад, композиція ліпіду/жирної кислоти) з водоростевої біомаси, вирощеної в умовах, потрібних для вмісту підвищених рівнів загального жиру. Цей метод передбачає отримання ліпідів з водоростевої біомаси, яка культивується в культуральних умовах, достатніх для отримання водоростевої біомаси з підвищеним загальним вмістом жиру (наприклад, загальний вміст жиру більше ніж 67 % біомаси), за яким урожай водоростевої біомаси збирають під час фази негативного прискорення росту або стаціонарної фази росту водорості. В іншому варіанті, урожай водоростевої біомаси збирають під час логарифмічної фази росту водоростей. Методи отримання ліпідної композиції з водоростевої біомаси за цим винаходом передбачають, у тому числі серед іншого екстракцію, нагрів, тиск, омилення, обробку ультразвуком, заморожування, подрібнення, іонний обмін, хроматографію, мембранний поділ, електродіаліз, зворотний осмос, дистиляцію, хімічну дериватизацію, кристалізацію тощо. Наприклад, водоростеві ліпіди можуть екстрагуватись з клітин водоростей будь-яким підходящим методом, який передбачає, у тому числі серед іншого екстракцію розчинником, у тому числі серед іншого етанолом, етилацетатом, ізопропиловим спиртом, метанолом, етилацетатом, гексаном, метіленхлоридом, метанолом, нафтою, хлороформом тощо, або під тиском рідких вуглеводнів, таких як: бутан, пентан, пропан або інших (зі спільним розчинником або без нього), або шляхом надкритичної флюїдної екстракції (зі спільним розчинником або без нього). Як варіант, екстраговану олію ліпіду/жирної кислоти випарюють в умовах зниженому тиску, щоб зменшити або видалити розчинник і/або взяти пробу концентрованого ліпідного матеріалу. В інших варіантах клітини руйнуються або лізуються для отримання ліпідної композиції, наприклад, у формі олії (наприклад, для використання як біопалива або прекурсора біопалива). У деяких варіантах екатраговані олії піддають переробці. Застосування даного винаходу не обмежується за типом переробки. У деяких варіантах екстраговані олії піддаються 21 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хімічній переробці. У деяких варіантах – фізичній переробці. У деяких варіантах екстраговані олії піддаються як хімічній, так і фізичній переробці. Екстраговані олії (наприклад, з водоростевої біомаси, вирощеної в умовах для підвищення загального вмісту жиру водоростевої клітини (наприклад, до понад 67 %)), можуть перероблятись за допомогою будьякого звичайного методу переробки. У деяких варіантах процес переробки допомагає видалити деякі або всі домішки з екстрагованих ліпідів/жирних кислот/олій. Процес переробки передбачає один або більше етапів для видалення смоли, відбілення, фільтрації, дезодорації і/або полірування екстрагованих ліпідів/жирних кислот/олій. У деяких варіантах ліпіди/жирні кислоти/олії, які містяться в екстрагованому ліпідній композиції, концентрують шляхом гідролізу ліпідів, щоб отримати концентровану ліпідну фракцію, використовуючи такий метод, як: наприклад сечовинна адукція, фракційна дистиляція, хроматографія і/або надкритичне флюїдне фракціонування. Відповідно, у одному варіанті етап отримання ліпідної композиції з водоростевої біомаси, передбачений даним винаходом, передбачає екстракцію ліпідної композиції з біомаси. У іншому варіанті отримання ліпідної композиції з водоростевої біомаси, передбаченим даним винаходом, передбачає контактування біомаси з полярним розчинником. Наприклад, у деяких варіантах, ліпід/жирну кислоту/олію екстрагують з водоростевої біомаси для отримання ліпідної композиції з використанням розчинника в умовах екстракції, достатніх для вилучення ліпідів і/або жирних кислот, але недостатніх для екстрагування сполук, які не розчиняються у розчиннику. У одному варіанті композиція ліпіду/жирної кислоти екстрагується з водоростевої біомаси, передбаченої винаходом, у якій залишки клітинного розкладу і/або осаджені нерозчинні сполуки відокремлюються від фракції, що містить ліпід/ жирну кислоти і розчинник. У іншому варіанті метод додатково передбачає відділення залишків клітинного розкладу і осаджених сполук з використанням методу відділення, таким як: фільтрування, центрифугування і/або їх комбінація. У деяких варіантах залишки клітинного розкладу і/або осаджених нерозчинних сполук (наприклад, частини водоростевої біомаси, яка не розчиняється у розчиннику (наприклад, білків, клітковини тощо), виділяють і використовують (наприклад, у харчовому або кормовому продукті). У деяких варіантах розчинник є полярним розчинником. До прикладів полярних розчинників відносяться, у тому числі серед іншого етанол, етилацетат, ізопропиловий спирт, метанол, етилацетат та їх суміші. В одному варіанті полярний розчинник є етанолом. Екстракція ліпідної композиції за допомогою розчинника може здійнюватись у різних формах. Наприклад, екстракція може бути дозованим процесом, безперервним процесом або безперервний протитічним процесом. В безперервному протитічному процесі у результаті контакту розчинника з мікроводоростями олія вимивається у розчинник, забезпечуючи отримання розчинно-олійних фракцій. Після екстракції розчинник може бути видалений з використанням методів, відомих у даній сфері діяльності. Наприклад, для видалення розчинника може використовуватись дистляція, обертове випарювання або випарювання у апараті з висхідною плівкою і відпарній колоні, або будь-яким відповідним засобом для видалення. В одному варіанті екстраговані ліпіди/жирні кислоти піддають дії процесу абсорбції (наприклад, відбілюванню) для видалення однієї або більше небажаних сполук, які можуть бути присутніми, таких як, наприклад, кольорових тіл і/або фосфатидів. У деяких варіантах процес абсорбції є процесом відбілювання, який передбачає контактування ліпідного/жирнокислотного екстракту з відбілюючим матеріалом (наприклад, нейтральна земля (наприклад, природна або фулерова глина), активована кислотою земля, активоване вугілля, активований глинозем, силікати і/або їх комбінації). Застосування винаходу не обмежується об'ємом використаного відбілюючого матеріалу. В одному варіанті екстраговані ліпіди/жирні кислоти піддаються в процесу видалення смол. Методи видалення смол, відомі в даній сфері діяльності, передбачають, наприклад, водяне видалення, кислотне видалення, ферментативне видалення і мембранне видалення. У деяких варіантах ліпідний/жирнокислотний екстракт піддається видаленню смол (наприклад, після проведення процесу абсорбції), яке передбачає контактування цього екстракту з сумішшю водних розчинів кислот у об'ємах ефективних для осадження смол і/або сполук хлорофільного типу, що можуть бути присутніми у композиції ліпідного/жирнокислотного екстракту. Застосування винаходу не обмежується типом або об'ємом використовуваних водних розчинів кислот. В одному варіанті суміш водних розчинів кислот містить сірчану кислоту і/або фосфорну кислоту. В іншому варіанті рівні об'єми водних розчинів кислот змішуються з ліпідною композицією. У кращому варіанті, у разі змішування з олією, водні розчини кислоти знаходяться у об'ємі, достатньому для забезпечення кислотного рН. Осади, що формуються після 22 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 змішування кислот, можуть видалятись з ліпідної композиції, наприклад, з допомогою центрифугування і/або фільтрації (наприклад, мембранної фільтрації). У деяких варіантах знесмолений ліпідний/жирнокислотний екстракт піддають сушінню (наприклад, щоб зменшити вміст вологи у композиції). Застосування винаходу не обмежується умовами сушіння (наприклад, тривалістю, температурою і/або в умовах вакууму). Відповідно до даного документу, у деяких варіантах, вміст вологи у висушеному ліпідному/жирнокислотному є меншим, ніж приблизно 10 % м/м (наприклад, менш ніж приблизно 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 %, 0,1 %, 0,05 % або 0,01 % м/м). Ліпідна композиція У деяких варіантах застосування винаходу передбачається отримання ліпідної композиції з водоростей біомаси, передбаченої винаходом. У деяких варіантах ліпідну композицію отримують відповідно до методу, передбаченого винаходом. Наприклад, у деяких варіантах ліпідна композиція є водоростевою біомасою або її частиною/фракцією з водоростей роду Thraustochytrium. У деяких варіантах водоростева біомаса містить водорості, відібрані з Dinophyceae, Cryptophyceae, Trebouxiophyceae, Pinguiophyceae і/або їх комбінацій. У інших варіантах водоростева біомаса містить водорості, відібрані з Thraustochytrium striatum, Thrausiochytrium roseum, Thrausiochylrium аureum, Crypthecodinium cohnii, Parietochloris spp., Rhodomonas spp., Cryptomonas Cryptomonas spp., Parietochloris spp., Hemisebnis spp., Porphyridium spp., Glossomastix spp. і/або їх комбінації. У інших варіантах водоростева біомаса містить водорості, відібрані з Parietochloris incise, Rhodomonas salina, Hemiselmis brunescens, Porphyridium cruentum і Glossomastix chrysoplasta та їх комбінації. У кращому варіанті водоростева біомаса складається з Schizochytrium limacinum. Харчові продукти і кормові добавки для тварин У деяких варіантах суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт використовуються для споживання (наприклад, ссавцями (наприклад, споживання людиною або твариною)) або як харчова добавка (наприклад, для підвищення ліпідного вмісту і/або споживних компонентів у їжі). Наприклад, у деяких варіантах, у разі використання як корму для тварин (наприклад, корму для великої рогатої худоби, молочної худоби, рибництва, домашньої птиці і т.д.), ліпіди/жирні кислоти, отримані з водоростевої біомаси, передбаченої даним винаходом, вводять у харчовий продукт (наприклад, корм для тварин). У деяких варіантах суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт використовується для фармацевтичних або харчових цілей і/або для застосування у промисловості. Суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт можуть мати будь-яку одну із різноманітних форм/ композицій, придатних для конкретного застосування або використання. У деяких варіантах виробляється власне суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт. В іншому варіанті суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт має вигляд порошку або вільної олії у рідкій формі (наприклад, ліпідної композиції або фракції або її концентрату). Суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт може використовуватись для споживання людиною і/або твариною. Наприклад, у деяких варіантах, суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт має вигляд корму або входить до нього, форму біологічно активної добавки, харчового продукту, фармацевтичного препарату, молочного продукту і/або дитячої суміші. Наприклад, у одному варіанті суцільноклітинна водоростева біомаса, фракція і/або її екстракт висушується (наприклад, сушіння розпилюванням, тунельне сушіння, вакуумне сушіння) і використовується як кормова або харчова добавка для будь-якої тварини або аквакультурного організму (наприклад, риб, креветок, крабів, омарів тощо), м'ясо і/або продукти, які споживаються людьми або тваринами (наприклад, домашні тварини, свійська худоба). У іншому варіанті суцільноклітинну водоростеву біомасу, фракцію і/або її екстракт змішують з сухим агентом для зменшення вологості (наприклад, меленим зерном, таким як мелена кукурудза). Описані у даному документі композиції можуть використовуватись як готовий харчовий продукт, як компонент харчового продукту, як біологічно активна добавка або як частина біологічно активної добавки, як кормова добавка, і також можуть мати рідку, напівтверду або тверду формі. Композиції, передбачені даним винаходом, також можуть мати форму фармацевтичної композиції. Композиції, біологічно активні добавки, продукти харчування, дитячі продукти харчування, кормові добавки і/або фармацевтичні композиції, передбачені винаходом, можуть використовуатись у засобах для зміцнення здоров'я індивідууму. Композиції можуть мати рідку, напівтверду або тверду форму. Наприклад, композиції можуть споживатись у вигляді таблеток, гелевих пакетів, капсул, желатинових капсул, ароматизованих напоїв, 23 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порошку, який можна розчиняти у напої, рослинній олії, салатній олії або приправі, соусі, сиропі, майонезі, маргарині тощо. Крім того, до харчового продукту, біологічно активних добавок і т.п., передбачених даним винаходом, можуть відноситись, у тому числі серед іншого молочні продукти, дитяче харчування, дитячі суміші, напої, закуски, порошок, харчовий інгредієнт, мюслі, морозиво, цукерки, складні закуски, випічка і смажені харчові продукти. До напоїв, передбачених даним винаходом, відносяться, у тому числі серед іншого енергетичні напої, поживні напої, коктейлі, спортивні напої, апельсиновий сік та інші фруктові напої. До закусок, передбачених даним винаходом, відносяться серед іншого, замінники їжі, поживні батончики, закусочні батончики і енергетичні батончики, екструдовані батончики тощо. До молочних продуктів, передбачених даним винаходом, відносяться, у тому числі серед іншого йогурт, йогуртові напої, сир і молоко. Призначені для перорального вжитку композиції можна приготувати відповідно до будь-яких відомих методів для виготовлення біологічно активних добавок або фармацевтичних препаратів, і такі композиції можуть містити щонайменше одну добавку, вибрану з групи, що складається зі речовин для поліпшення смаку, таких як: підсолоджуючі агенти або ароматизуючі агенти, стабілізатори, емульгатори, барвники і консерванти для того, щоб отримати препарат з приємним дієтичним або фармацевтичим смаком. До композиції, передбаченої даним винаходом, можуть додаватись вітаміни, мінерали та мікроелементи з будь-якого фізіологічно прийнятного джерела. У деяких варіантах фармацевтичния композиція, передбачена даним винаходом, містить композиції відповідно до неї у терапевтично ефективному об'ємі. Композиції, передбачені винаходом, можна приготувати для вживання у відповідності з відомими фармацевтичними методиками (див., наприклад, Remington, The Science And Practice of Pharmacy (9th Ed. 1995). У виробництві фармацевтичних композицій відповідно до винаходу ліпідні композиції (у тому числі їх фізіологічно прийнятні солі) зазвичай змішують, серед іншого, з прийнятним носієм. Носій має бути сумісним з будь-якими іншими інгредієнтами композиції і не повинен бути шкідливим для суб'єкта. Біопаливо Багато з існуючих технологій виробництва біопалива з водоростей є дорогими, неефективними і нестійкими при роботі в масштабі, який необхідний для витіснення якої-небудь значимої частки дизельного палива на ринку. Витрати на постачання і енергію для збирання врожаю і переробку водоростей часто недооцінюються. Для отримання біодизелю з водоростей звичайним способом урожай морських водоростей, як правило, збирають з культури при концентрації у воді приблизно 0,2 г/л. Зібрані водорості потім зневоднюють, що збільшує концентрацію водоростей з утворенням водоростевої пасти, що містить 15 % твердих речовин. Потім пасту повністю висушують шляхом випаровування води. Далі з висушених водоростей екстрагують олію за допомогою органічного розчинника, такого як гексан, який видаляють з водорестової олії дистиляцією. Такий звичайний метод для отримання біодизелю з водоростей є недозволено дорогим. Наприклад, коли водорості вирощуються у природній водоймі, водоростева біомаса є відносно розбавленою, враховуючи об'єм води. Виробництво одного галону олії вимагає переробки приблизно від 20000 до 40000 галонів води. Вартість енергетичних затрат на транспортування і переробку такого великого об'єму води є високою. Наприклад, можна отримати 2500 галонів олії з одного акру в рік, якщо виробляти водорості з 25 % їх маси у формі ліпідів при 25 г/м2 на день. Відповідно до цього прикладу потрібно переробити 50000000 галонів води, щоб виробити 2500 галонів олії. Стандартний підхід до постачання води насосами в централізовану систему зневоднення є занадто енергоємною і непомірно витратною. Як приклад, відносно невеликий об'єкт для виробництва водоростевої олії, який дає 20 мільйонів галонів / рік, має витрачати більше енергії на перекачування води зі ставка у центральну систему, ніж її міститься у олійному продукті, внаслідок чого енергетичний баланс є негативним. Відповідно, у деяких варіантах використання даного винаходу передбачається метод отримання водоростевої біомаси і/або ліпідного/ жирнокислотного екстракту (наприклад, композиції ліпід/жирна кислота) з водоростевої біомаси, вирощеної в умовах, які дозволяють отримувати підвищені рівні загального жиру. Цей метод полягає у отриманні ліпідів з водоростевої біомаси, яка культивується у культуральному середовищі, достатньому для виробництва водоростевої біомаси з підвищеним загальним вмістом жиру (наприклад, загальний вміст жиру вище ніж 67 % біомаси), де урожай водоростевої біомаси збирають під час фази прискореного негативного зростання або стаціонарної фази. У іншому варіанті урожай водоростевої біомаси збирають під час логарифмічної фази росту водоростей. У данному документі наведені методи отримання ліпідної композиції з водоростевої біомаси відповідно до даного винаходу. 24 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно, у деяких варіантах застосування даного винаходу передбачається отримання вихідної сировини біопалива або біопалива, яке містить, ліпіди, вуглеводні або їх поєданання, отримані з водоростевої культури і/або водоростевої біомаси, що генерується відповідно до методів з даного винаходу. У деяких варіантах ліпідні або водоростеві композиції, які мають той же самий вміст, поділяються відповідно до полярності на нейтральні ліпіди і полярні ліпіди. Основними нейтральними ліпідами є тригліцериди і вільні насичені та ненасичені жирні кислоти. Основними полярними ліпідами є ацильні ліпіди, такі як: фосфоліпіди та гліколіпіди. У деяких варіантах композиція, яка містить ліпіди і вуглеводні, передбачені винаходом, має характеристики і розрізняється за типами і відносними об'ємами жирних кислот і/або вуглеводнів, присутніх у ньому. У деяких варіантах вуглеводні, присутні у водоростевих композиціях, передбачених винаходом, є головним чином прямі алкани і алкени з нерозгалуженим ланцюгом, і можуть містити парафіни і їм подібні речовими, які мають до 36 атомів вуглецю. У деяких варіантах даний винахід передбачає метод отримання рідкого палива, який полягає у переробці ліпідів, отриманих з водоростевої культури і/або водоростевої біомаси або ліпідної фракції з них, які наведені у цьому документі. Продукти, передбачені даним винаходом, виготовлені шляхом переробки водоростевої вихідної паливної сировини, можуть додаватись або використовуватись в різних видах рідкого пального, у тому числі серед іншого дизельного, біодизельного, гасі, авіаційному пальному, бензині, JP-1, JP-4, JP-5, JP-6, JP-7, JP-8, термічно стійкому пальному для реактивних двигунів (JPTS), рідинах Фішера-Тропша, пальному на спиртовій основі, у тому числі етанолі, рідкому паливі на основі біомаси, іншому рідкому пальному основі біомаси, у тому числі целюлозному транспортному пальному на основі біомаси. У деяких варіантах тріацигліцериди в водоростевій олії перетворюються на метилові ефіри жирних кислот (МЕЖК або біодизель), наприклад, з використанням основно-каталізованого процесу переетерифікації (для огляду див., наприклад, К. Шейн Тайсон, Джозеф Бозелл, Роберт Уоллес, Юджин Петерсен і Люк Moенс, "Аналіз олії з біомаси: Потреби і рекомендації для дослідження", NREL/TP-510-34796, червень 2004 р., включений у цей документ з посиланням у повному обсязі). У деяких варіантах триацилгліцериди взаємодіють з метанолом за наявності NaOH при 60ºС протягом 2 годин для отримання метилового ефіру жирної кислоти (біодизелю) і гліцерину. У додаткових варіантах побічні продукти біодизелю та гліцерину не змішуються і, як правило, відокремлюються щляхом декантування або центрифугування з наступним промиванням та очищенням. Вільні жирні кислоти (ВЖК) є натуральним гідролізним продуктом тригліцериду, і формуються внаслідок взаємодії тріацигліцериду і води. У деяких варіантах методи, передбачені цим винаходом, додатково передбачають етап швидкого і значного сушіння водоростевої олії відомими у даній галузі методами, щоб обмежити продукування вільних жирних кислот, краще менше 1 %. У іншому варіанті застосування даного винаходу методи можуть також додатково передбачати етап перетворення або видалення вільних жирних кислот відомими в даній галузі методами. У деяких варіантах тріацигліцериди в водоростевій олії перетворюються на метилові ефіри жирних кислот (МЕЖК або біодизель) з використанням кислотно-каталізованої переетирифікації, ферментно-каталізованої переетирифікації або надтокритичної метилової переетирифікації. Надтокритична метилова переетирифікація не потребує каталізатора (Див., наприклад, Кусдіана Д. і Сака С. "Вплив води на виробництво біодизельного пального шляхом обробки надкритичним метанолом" Біоресурсна технологія 91 (2004 р.), стр. 289-295; Кусдіана Д. і Сака С. "Кінетика переетирифікації у рапсовій олії для біодизельного пального у формі обробки у переетирифікації метанолу" Пальне 80 (2001 р.), стр. 693-698; Сака С. і Кусдіана Д. "Біодизельне пальне з распосової олії, отримане у надкритичному метанолі" Пальне 80 (2001 р.), стр. 225-231). Реакція у надкритичному метанолі зменшує період реакції з 2 годин до 5 хвилин. Крім того, відсутність основного каталізатора NaOH значно спрощує очищення, зменшує вартість сировини, а також виключає проблему омилювання з вільних жирних кислот. Замість створення проблем, вільні жирні кислоти стають цінною вихідною сировиною, яка перетворюється на біодизель у надкритичному метанолі. У деяких варіантах триацилгліцериди зменшуються з використанням водню для отримання парафінів, пропану, двоокису вуглецю і води, продукту загалом відомого як зелене дизельне пальне. Парафін можна або ізомерувати для виробництва дизельного пального або змішувати безпосередньо з ним. У деяких варіантах перевага віддається гідрогенізації аніж звичайній основно-каталізованій переетерифікації. Наприклад, процес гідрогенізації (також згадується як гідрокрекінг) є термохімічним, а отже, набагато стабільнішим, щоб сканувати домішки у порівнянні з біохімічними процесами (наприклад, гідрокрекінг є відносно нечутливим до вільних 25 UA 112080 C2 5 10 15 20 25 30 жирних кислот і води). Вільні жирні кислоти легко перетворюються на парафіни, а вода просто зменшує загальну теплову ефективність процесу, але не змінює істотно власне хімію. В іншому не обмежуючому прикладі продукт парафіну є чистим вуглеводнем і, таким чином, не відрізняється від вуглеводнів на нафтовій основі. На відміну від біодизелю, який має на 15 % нижчий енергетичний вміст і може замерзати в холодних погодних умовах, зелене дизельне пальне має енергетичний вміст та характеристики плинності (наприклад, в'язкість), подібні до дизельного палива на нафтовій основі. У різних варіантах методи, передбачені цим винаходом, передбачають етапи гідрокрекінгу та ізомеризації, які добре відомі у даній галузі для виробництва рідкого пального, такого як: авіаційне пальне, дизельне пальне, гас, бензин, JP-1, JP-4, JP-5, JP-6, JP-7, JP-8 і JPTS. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИЙ РОЗДІЛ Наступні приклади наведені з метою демонстрації і додаткової ілюстрації деяких кращих варіантів застосування, а також аспекти даного винаходу, і не повинні тлумачитись як обмежуючі обсяг його застосування. ПРИКЛАД 1 Вирощування біомаси з високим вмістом жиру Експерименти проводились під час розробки варіантів застосування даного винаходу для того, щоб дати характеристику і встановити методи виробництва гетеротрофних водоростей і, зокрема, методів культивування водоростей для отримання водоростевої біомаси, яка містить високі рівні ліпіду/жирної кислоти. Була виконана і проведена у дозованому режимі серія досліджень виробництва звичайних гетеротрофних водоростей. Культура Schizochytrium limacinum була отримана і зберігалась в кріопробірках місткістю 1,5 мл при температурі -80ºС. Під час проведення кожного експерименту робота починалась з відтавання кріопробірки і асептичного додавання у колбу з середовищем місткістю 1,0л, яка струшується. Середовище у колбах місткістю 1 л містило 50 г/л цукру, 10 г/л дріжджового екстракту і 4 г/л морської солі. Три літри культури, вирощені протягом від 3 до 6 днів у струшуваній колбі, використовували для інокуляції 250-літрової посудини, що містить носій, вирощували протягом 24-48 годин, а потім переносили в основний резервуар (місткістю від 17000 до 28000 л) і вирощували як дозуючий процес протягом 36-72 годин. Температура дози підтримувалась між 25 °C і 30 °C. Застосовувся великий температурний діапазон у зв'язку з відсутністю точного контролю у системі. Середовище, яке використовувалось в посіві (250 л) і дозованих об'ємах (від 17000 до 28000 л) було наступним: Таблиця 1А Засоби, використані у традиційних дозах Сировина Цукор Дріжджовий екстракт MgSO4 Aмід вугільної кислоти CaCl2 MgCl2 Протипінистий засіб 35 40 45 Доза 50 7,5 0,1538 2 0,1538 0,1538 0,3 г/л г/л г/л г/л г/л г/л мл Загальний вміст жиру у водоростевій біомасі з дозованих культур визначався за допомогою газової хроматографії (Див. AOAC гравіметричний метод 922.06), кислотним гідролізом (Див. Визначення загального жиру кислотним гідролізом, технологія Анком, Метод 1, 02-10-09), і екстракцією розчинником високої температури (Див. Техгологія Анком, МЕтод 2, 01-30-09 і Метод AOCS 5-04). Коротче кажучи, типова процедура аналізу для ферментаційного бульйону була наступною: зразки бульйону були доведені до концентрації центрифугуванням. Після декантації проводилось їх сушіння виморожуванням протягом 24 годин, внаслідок чого вміст вологи складав менше одного відсотка. Перед кислотним гідролізом зразки зважували, промивали і сушили в печі. Далі проводився процес екстракції у градієнтних термічних умовах з петролейним ефіром. Процес гідролізу і екстрації виконувався з використанням автоматизованих інструментів. Після додаткового сушіння результати були визначені на основі втрати маси. Як відображено у нижченаведеній Tаблиці 1B, загальні рівні жиру/ліпіду (м/м), досягнуті при дозованому виробництві при температурі у межах від 25 °C до 30 °C, склали 8 %-38 %. 26 UA 112080 C2 Таблиця 1B Загальний вміст жиру у водоростевій біомасі, вирощеній у дозі при температурі 25 °C - 30 °C Журнал трасування А-1-10 А-2-10 А-3-10 А-4-10 А-5-10 А-7-10 А-8-10 А-9-10 5 10 Загальний вміст жирів (%) 33,75 38,59 27,30 38,51 7,82 33,33 34,85 27,21 Була проведена робота для збільшення обсягів рівнів жиру/ліпідів, оскільки дані об'єми розглядались як занадто низькі, щоб бути корисними. Щоб зробити рівень ліпідів, отриманих у водорості, вирощеній в культуральному середовищі, вищим були проведені додаткові експерименти. Під час розробки варіантів застосування даного винаходу були проведені експерименти, щоб визначити, чи можуть зміни в тих же складових і/або об'ємах або співвідношеннях у середовищі забезпечити різні характеристики росту водоростей. Крім того, були проведені експерименти, щоб визначити можливість зміни характеристик росту водоростей шляхом лінійного збільшення водоростевої культуральної системи. Зокрема, щоб спробувати підвищити рівень ліпідів, вироблений у культивованих водоростях, були внесені зміни у об'єми і співвідношення MgSO4, сечовини, CaCl2,MgCl2 і KH2PO4. Результати ферментації, отримані у дозі об'ємом 10 л відображені нижче: 15 Таблиця 2 Умови і результати ферментації у 10 л. Експериментальні лабораторні роботи 10л Інгредієнти/журнал № (г/л) Цукор Дріжджовий екстракт MgSO4 NaCl Сечовина ZnSO4 CaCl2 MgCl2 KH2PO4 Домішок (рідина) - мл Хлорид заліза Сульфат цинку Сульфта магнію Борна кислота Сульфат міді Підживлення Сечовина: KH2PO4 Встановлена точка температури % жиру Примітки NB4-030311 NB6-030311 NB4032311 NB6032311 NB3032811 NB4032811 50 7,5 0,1538 0 2 0,1538 0,1538 0,1538 10 50 7,5 0,1538 0 2 0,1538 0,1538 0,1538 10 50 7,5 0,1538 0 2 0,1538 0,1538 0,1538 1,5 10 50 7,5 0,1538 0 2 0,1538 0,1538 0,1538 1,5 10 50 7,5 0,5 0 1 0,1538 1 0,5 0,5 20 50 7,5 1 0 1 0,1538 2 1 1 20 Сечовина 200 г/л Сечовина 200 г/л 2:1 2:1,5 2:0,5 2:0,5 30 30 30 30 30 30 8,13 Сильний запах NH3 ph результат виділення піни 6,89 Сильний запах NH3 ph результат виділення піни 88,98 84,28 56,1 64,3 27 UA 112080 C2 Таблиця 3 Умови і результати ферментації у додаткових 10 л Інгредієнти (г/л) Цукор Дріжджовий екстракт MgSO4 NaCl Aмід вугільної кислоти ZnSO4 CaCl2 MgCl2 KH2PO4 Рідина мл Хлорид заліза Сульфат цинку Сульфат марганцю Борна кислота Сульфат міді Вихідна реакційна суміш Встановлена точка температури % жиру NB6032811 NB3040711 NB4040711 NB6040711 NB3041911 NB4041911 NB6041911 50 7,5 2 0 1 0,1538 4 2 2 20 50 7,5 2 0 1 0,1538 4 2 0,25 20 50 7,5 2 0 1 0,1538 4 2 0,25 20 50 7,5 2 0 1 0,1538 4 2 0,25 20 50 7,5 2 0 1 0 4 2 0,25 20 50 7,5 2 0 1 0 4 2 0,25 20 50 6,25 2 0 1 0 4 2 0,25 20 30 30 30 30 30 30 30 73,7 71,16 73,49 73,88 68,69 76,56 72,56 Таблиця 4 Умови і результати ферментації у додаткових 10 л. Інгредієнти/журнал № (г/л) Цукор Дріжджовий екстракт MgSO4 NaCl Aмід вугільної кислоти ZnSO4 CaCl2 MgCl2 KH2PO4 Рідина мл Хлорид заліза Сульфат цинку Сульфат марганцю Борна кислота Сульфат міді Вихідна реакційна суміш Aмід вугільної кислоти: KН2РО4 Задана температура Вміст жирів (%) NB30 61411 NB40 61411 NB60 61411 NB30 62111 NB40 62111 NB60 32111 NB30 67811 NB40 62811 NB60 32811 50 7,5 0,1538 0 50 7,5 2 0 50 7,5 2 0 50 7,5 22 4 50 7,5 2 8 50 7,5 2 0 50 7,5 0,1538 0 50 7,5 2 0 50 7,5 2 0 2 1 1 1 1 1 1 1 1 0,1538 0,1538 0,1538 2 10 0,1538 4 2 0,25 10 0 4 2 0,25 0 0 4 2 0,25 0 0 4 2 0,25 0 0 4 2 0,25 0 0 4 2 0,25 0 0 0,1538 2 0,25 0 0 4 0,1538 0,25 0 2:05 2:05 2:05 2:05 2:05 2:05 2:05 2:05 2:05 30 46,52 30 65,04 67,61 61,28 62,95 68,53 Підтвердження формули 5 10 Ефект NaCl 49,25 54,41 64,97 Співвідношення сольового ефекту Результати цих експериментів, проведених під час розробки варіантів застосування винаходу, показали, що певні об'єми/співвідношення субстратів, присутні у середовищі, мали безпосередній вплив на характеристики росту водоростей (наприклад, загальний об'єм досягнутої біомаси, а також об'єм жиру і/або вміст іншого компоненту у власне біомасі). Параметри, які забезпечили високий вміст жиру в біомасі в об'ємах 10 л, були потім використані для визначення можливості їх успішного застосування у великомасштабному виробництві біомаси з високим вмістом жиру. ПРИКЛАД 2 Великомасштабне виробництво біомаси з високим вмістом жиру 28