Спосіб прогнозування невиношування вагітності

Реферат: Спосіб прогнозування невиношування вагітності включає дослідження навколоплідних. Методом алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції проводять дослідження генетичного поліморфізму, із зразків периферійної крові виділяють геномну ДНК, виявляють генетичні предиктори тромбофілії, порівнюють з контролем і при зміні показників прогнозують невиношування вагітності. UA 101161 U (54) СПОСІБ ПРОГНОЗУВАННЯ НЕВИНОШУВАННЯ ВАГІТНОСТІ UA 101161 U UA 101161 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме акушерства і гінекології, і може знайти широке застосування у визначенні ризику невиношування вагітності. В даний час питання невиношування вагітності (НВ) має статус одного з найбільш пріоритетних напрямків акушерства у зв'язку зі стабільно високою частотою у світовій популяції і значною поширеністю несприятливих наслідків вагітності для матері та новонародженого. Частота невиношування вагітності коливається від 10 до 25 %, а в І триместрі вона може досягати 50 %. Незважаючи на тривале і всебічне вивчення проблеми невиношування вагітності, етіологічні фактори, патогенетичні механізми самовільного викидня досі повністю не з'ясовані. У клінічній практиці до 20 % повторних викиднів після виключення всіх можливих причин залишаються невідомими. Епідеміологічні дослідження останніх десятиліть показують, що спадкові та набуті тромбофілії матері приводять до розвитку патогенетичних механізмів цього стану [1, 2]. Невиношування вагітності розглядають при цьому як мультифакторіальне захворювання - результат адитивної дії багатьох генів і зовнішніх факторів [3]. У більшості випадків, коли репродуктивні втрати на ранніх термінах вагітності мають рекурентний характер, представляється можливим припустити наявність постійних факторів - генетично детермінованих. Беручи до уваги особливості фізіологічної адаптації системи гемостазу до вагітності, більшість генетичних і набутих форм тромбофілії маніфестують саме під час гестаційного процесу. Тромбофілія - це підвищена схильність організму до розвитку тромбозів, яка обумовлена порушеннями регуляторних механізмів різних компонентів системи гемостазу; різних дефектів (точкових мутацій) одного і того ж компонента, які варіюють за ступенем вираженості залежно від гетеро- або гомозиготної форми мутації; поєднуються з іншими генетичними або набутими дефектами та/або факторами ризику [7]. За сучасними даними, частка спадкових тромбофілій в структурі причин невиношування вагітності становить 30-55 %. Серед яких основними вважають поліморфізм генів ферментів фолатного циклу (5,10-метилентетрагідрофолатредуктаза MTHFR C677T; згортання крові (мутація генів протромбіну FII G20210A, фактора V FV (Leiden) G1691 А); системи фібринолізу (поліморфізм гена інгібітора активатора плазміногена 1 РАІ-1675 5G/4G) [4, 7]. MTHFR - це фермент, групи флавопротеїнів, який відновлює 5,10-метилентетрагідрофолат до 5-метилтетрагідрофолату. Останній є донором метильних груп і основним джерелом тетрагідрофолату, похідні якого, в свою чергу, є специфічними коферментами в синтезі метіоніну з гомоцистеїну. Носійство алеля 677Т призводить до термолабільності ферменту, що надалі призводить до заміни в молекулі ферменту амінокислоти аланіну на валін в каталітичному домені (Ala222Val). В результаті чого відбувається зниження активності ферменту in vitro на 60 % у гомозигот по поліморфному алелю, і на 30 % в гетерозигот, що тягне за собою підвищення рівня гомоцистеїну. Патогенетичні механізми розвитку ускладнень при гіпергомоцистеїнемії наступні: пошкодження ендотеліальної вистилки судин із запуском процесів коагуляції, мікротромбоутворенню, що приводить до порушення інвазії трофобласта, плацентації і фетоплацентарного кровообігу. Зараз гіпергомоцистеїнемія розглядається як одна з причин розвитку АФС. Гомоцистеїн вільно переходить через плаценту і може викликати тератогенну і фетотоксичну дію, призводить до зміни метилювання центромерних районів хромосом, порушення розходження хромосом в оогенезі і підвищує ризик хромосомних аберацій, призводить до підвищеного включенню dUMP замість dTMP в ланцюзі ДНК клітин плоду, що тягне за собою вирізання нуклеотидних пар, розриви ланцюгів ДНК і запуск механізмів апоптозу [5]. Основним ендогенним механізмом, що запобігає тромбоутворенню, є фібриноліз. Центральним компонентом фібринолітичної системи є інгібітор активатора плазміногена 1 (РАІ1), який утворюється в ендотеліальних клітинах, гепатоцитах. Припускають, що активатор плазміногена тканинного типу 1 вивільняються неураженим ендотелієм, але при цьому інактивується активованим білком С. Рівень РАІ-1 в плазмі залежить від поліморфізму делеція/вставка гуанозину (5G/4G) в області промотера гена РАІ-1 49. Пригнічення фібринолізу, викликане поліморфізмом гену РАІ-1 (у більшості випадків гомозиготними формами), як відомо, порушує імплантацію бластоцисти в ендометрії і формування системи мати-плацента-плід, що, з одного боку, є причиною безпліддя і ранніх преембріонічних і ембріонічних втрат, а з іншого, призводить до плацентарних аномалій і є патогенетичним механізмом акушерських ускладнень - мимовільних викиднів (ранніх і пізніх), антенатальної загибелі плода [6]. Однією з мутацій, асоційованих із тромбофіліями, що найбільш часто зустрічається в європейській популяції (4-6 %), є мутація FV Leiden. Внаслідок мутації G1691А відбувається заміна залишку аргініну на гліцин в ділянці 506, що призводить до розвитку нечутливості фактора V до активованого білка С і супроводжується підвищенням рівня цього фактора в плазмі і, відповідно, посиленням утворення тромбіну. Більш того, мутантний фактор V зменшує 1 UA 101161 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кофакторну активність в системі нейтралізації VIII фактора активованим білком С. Обидві ці аномалії призводять до феномену резистентності Va фактора до активованого білка С і патології згортання крові. При цьому не відбувається подовження часу згортання після додавання до плазми активованого білка С. Наявність цієї мутації підвищує ймовірність розвитку цілого ряду ускладнень вагітності: невиношування вагітності (ризик підвищується в 3 рази), відставання розвитку плода, гестоз, фетоплацентарна недостатність [4, 7, 8]. Протромбін (коагуляційний фактор II або F2) синтезується в печінці за участю вітаміну K і є одним з ключових компонентів системи згортання крові. У ході ферментативного розщеплення протромбіну утворюється тромбін. Мутація гена протромбіну G20210A характеризується заміною нуклеотиду гуаніну нуклеотидом аденіну в позиції 20210. При поліморфізмі гена рівень протромбіну в плазмі крові може бути підвищений на 30 % за рахунок більш стабільної мутантної матричної РНК, що провокує появу надмірної кількості фібринових згустків і підвищує ризик розвитку венозних тромбозів, призводить до втрат плода переважно в І триместрі. Підвищене утворення тромбіну, викликане цією мутацією веде до високого споживання білка С і виступає однією з причин резистентності до активованого білка С. Мутація успадковується за аутосомно-домінантним типом. Це означає, що тромбофілія може виникати навіть у гетерозиготного носія зміненого гена (G/А). За даними літератури, гетерозиготное носійство мутації F2 G20210A асоціюється з порушеннями плацентації і зростанням ризику невиношування вагітності до 12 разів і, за даними ряду авторів, є фактором ризику викиднів саме на ранніх термінах вагітності [8]. Таким чином, відкриття низки досить поширених генетично обумовлених форм тромбофілії сприяло появі нових поглядів на причини та патогенез репродуктивних втрат. В даний час вивчення генетичних предикторів на процеси імплантації, інвазії трофобласта, подальше функціонування плаценти і перебіг вагітності набувають особливої актуальності і потребують подальшого дослідження. Найближчим аналогом є спосіб визначення ризику невиношування вагітності, що включає вивчення навколоплідних вод роділь (7). Проте цей спосіб має суттєві недоліки, а саме тривалість виконання, низька інформативність. В основу корисної моделі поставлена задача, що полягає у визначенні ролі тромбофілії у невиношуванні вагітності. Технічним результатом є підвищення точності прогнозування ризику невиношування вагітності. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі, який передбачає дослідження навколоплідних вод, згідно з корисною моделлю, методом алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції проводять дослідження генетичного поліморфізму, із зразків периферійної крові виділяють геномну ДНК, виявляють генетичні предиктори тромбофілії, порівнюють з контролем і при зміні показників прогнозують невиношування вагітності. Робота виконана на кафедрі акушерства та гінекології № 1 Національного медичного університету імені О.О. Богомольця на базі гінекологічного відділення перинатального центру м. Києва. Нами було обстежено 280 жінок, з них 256 з невиношуваною вагітністю, з числа яких у 84 пацієнток з самовільним викиднем (32,8 %) було виявлено наявність спадкової мутації: вони склали основну групу обстежених жінок. Контрольну групу склали 37 вагітних жінок з фізіологічним перебігом вагітності. Всі жінки проходили молекулярно-генетичне тестування мутації генів MTHFR C677T, FV (Leiden) G1691A, FII G20210A і РАІ-1675 5G/4G. Дослідження генетичного поліморфізму проводилося з використанням методу алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції, з подальшим гідролізом ампліконів відповідною рестриктуючою ендонуклеазою. В молекулярно-генетичній лабораторії із зразків периферійної крові проводили виділення геномної ДНК за допомогою комерційного набору "ДНК-сорб-В". Полімеразну ланцюгову реакцію проводили за модифікованими протоколами з олігонуклеотидними праймерами. Стан ампліфікаційних фрагментів аналізували за допомогою електрофорезу в 1,5 % агарозному гелі. Амплікони підлягали гідролітичному розщепленню ендонуклеазами рестрикції, отримані фрагменти аналізували методом поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ). Залежно від наявності або відсутності відповідних сайтів рестрикції у ампліфікованій ділянці ДНК, продукти рестрикції мали різну молекулярну вагу, відповідно до якої визначали генотип. Аналіз розподілу генотипів досліджуваних SNP проводився за допомогою тесту хі-квадрат, а також точного критерію Фішера. З метою ранжування предикторів за значимістю їх впливу і можливої асоціації з ризиком розвитку захворювання використовувалися два непараметричних методи, а саме: метод випадкового лісу (RandomForest) [9] і метод багатофакторного зменшення розмірності (Multifactorial Dimensionality Reduction) [10] для визначення міжгенної 2 UA 101161 U 5 10 15 20 25 взаємодії (епістазу). У параметрах побудови для методу випадкового лісу було вказано 1000 дерев, з можливістю вибору 2 випадкових предикторів для створення кожного з вузлів класифікації. Метод багатофакторного зменшення розмірності був застосований з стандартними налаштуваннями і установкою значення крос-перевірочного параметра, рівного 10. Для фільтрації найбільш важливих факторів ризику використовувався метод, запропонований C. Strobl [9]. Статистично значущими результатами вважалися ті, які досягли рівня статистичної значущості р