Спосіб отримання рекомбінантного інтерферону альфа-2b людини

Реферат: Спосіб отримання рекомбінантного інтерферону альфа-2b людини включає клонування гена альфа-інтерферону в плазмідний вектор, трансформацію спеціального штаму Е. соlі плазмідним вектором та афінне очищення рекомбінантного альфа інтерферону. Включає дизайн генетичної конструкції pPAL-IFN- in silico, синтез цільового гена in vitro із використанням полімеразної ланцюгової реакції. Модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profmity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. UA 102080 U (12) UA 102080 U UA 102080 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель стосується медичної біотехнології і може бути використана в процесах отримання інтерферонів альфа-2b людини медичного призначення. Інтерферони являють собою білкові молекули з молекулярною масою від 15000 до 21000 дальтон, віднайдені і секретуються клітинами у відповідь на вірусну інфекцію або інші збудники. Виділяють три основні групи інтерферонів: альфа, бета і гамма. Самі по собі ці групи не є однорідними і можуть містити кілька різних молекулярних різновидів інтерферону. Так, виділено понад 14 генетичних різновидів інтерферону альфа, які представляють інтерес і знаходять широке застосування в медицині як противірусні, антипроліферативні та імуномодулюючі засоби. Загальновідомі технології виробництва людського лейкоцитарного інтерферону, включають таку послідовність операцій: виділення лейкоцитів з донорської крові, лейкоцитарної або еритроцитарної маси, суспендування їх в поживному середовищі при температурі переважно (37±0,5)°С, додавання до лейкоцитів культивованого у алантоїсній порожнині курячих ембріонів 15 вірус-індуктора ВХН та інкубування переважно при температурі (30±0,5)°С. Після цього відділяють вірус-індуктор, а до осаду лейкоцитів додають живильне середовище і суспензію витримують переважно при (37±0,5)°С протягом 18-20 г. Таким чином відбувається біосинтез інтерферону в лейкоцитах і накопичення його в живильному середовищі. Відомі способи отримання лейкоцитарного інтерферону людини з лейкоцитів крові людини з вірусною індукцією (авт. Св. СРСР № 297296, 1970, № 1366064, 1983; пат. РФ № 1364343, 1984; № 1709615, 1990; № 1713591, 1986; № 2066188, 1993,). Основними недоліками цього підходу є складність і дорожнеча масштабування, висока ймовірність контамінації кінцевого продукту вірусами людини і невисокий вихід кінцевого продукту. Відомий спосіб отримання людського лейкоцитарного інтерферону (Пат. РФ № 1744811, кл. А61К 38/21, опубл. 10.01.95. Бюл. №1). Недоліком є його здатність розчинятися в культуральній рідині, що не дозволяє використовувати цей індуктор протягом декількох промислових циклів. Технологія рекомбінантних ДНК дозволяє виключити ці обмеження. Важливо відзначити, що білки, для яких посттрансляційні зміни (наприклад гликозування) не є істотними, можуть бути отримані в прокаріотичних системах. В даний час більш перспективним визнаний спосіб отримання інтерферону мікробіологічними синтезом, який забезпечує можливість отримання цільового продукту зі значно вищим виходом з порівняно недорогої вихідної сировини. Використовувані при цьому підходи дозволяють створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також регуляторних елементів, контролюючих його експресію. Як вихідні мікроорганізми використовують різні конструкції штамів Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli. Недоліком використання P. pastoris як продуценту інтерферону (JN Garcia, JA Aguiar et. Al. // High level expression of human IFN-2b in Pichia pastoris.// Biotecnologia Aplicada, 1995. - 12 (3), 152-155) є вкрай складні умови ферментації цього типу дріжджів, необхідність суворо підтримувати концентрацію індуктора, зокрема метанолу, в процесі біосинтезу. Недоліком використання штамів Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) є складність процесу ферментації при низькому рівні експресії (10 мг інтерферону на 1 л культурального середовища). Більш продуктивним є використання штамів Escherichia coli. Відомий спосіб підвищення продукції інтерферону (Патент РФ № 2080873, від 27.12.1993), у якому стадію праймінгу проводять в 40 умовах поступового підвищення температури суспензії з 20 °C до (36,6±0,1)°С протягом 4-6 годин, що дає можливість ще вдвічі підвищити вихід інтерферону. Найбільш близьким до продуценту, що заявляється є (пат. РФ № 2165455, 2001, кл. С12N 15/21), згідно з яким рекомбінантна плазміда pSS5, що кодує синтез рекомбінантного альфа-2bінтерферону під триптофановим промотором, містить ген стійкості до канаміцину. Згідно з прототипом досягається відносно високий (до 800 мкг / мл) рівень експресії при оптичній щільності бактеріальної культури 15-16 ОЕ, тобто приблизно 30 мкг цільового продукту на 1 мг клітинної маси. Одним із суттєвих недоліків даного штаму є практично конститутивний синтез інтерферону протягом всього процесу культивування. Ця обставина може призводити до підвищеного рівня протеолізу кінцевого продукту. Іншим недоліком є невисока стабільність конструкції, що випливає з необхідності проведення всього процесу культивування під селективним тиском високих концентрацій канаміцину, а це значить - невисока пропорція цільового продукту в клітинній біомасі, а саме це визначає технологічність і, в кінцевому рахунку, економіку процесу в цілому. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити технологію отримання активного рекомбінантного альфа інтерферону людини (hrIFN-2b) шляхом використання системи Profinity 1 UA 102080 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 eXact™ (Bio-Rad), яка включає отримання біологічно активного інтерферону альфа 2b людини, що не містить у своєму складі N-термінального метіоніну, розміром 165 а.з. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб отримання рекомбінантного інтерферону альфа-2b людини, включає клонування гена альфа інтерферону в плазмідний вектор, трансформацію спеціального штаму E.coli плазмідним вектором та афінне очищення рекомбінантного альфа інтерферону, згідно з корисною моделлю, включає дизайн генетичної конструкції pPAL-IFN- in silico, синтез цільового гена in vitro із використанням полімеразної ланцюгової реакції, модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profinity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7 Система Profinity eXact включає 3 модулі: для клонування чужорідних генів, бактерійної експресії рекомбінантних протеїнів в кишковій паличці (Е. соlі) та афінного очищення цільового протеїну, вільного від тегів (http://www.bionbefabxom/index.php?paze-shop.product detals&flypage shop.flypage&product_id-83&category_id-4&manufacturer_id-0&optiom com virtuemart&Itemid-I). Модуль для клонування чужорідних генів складається з плазмідної молекули ДНК pPAL-7, яка містить нуклеотидну послідовність, що кодує генетично змінений продомен субтилізину та унікальні сайти для клонування чужорідних генів у єдиній відкритій рамці зчитування із продоменом субтилізину, розміром 75 амінокислотних залишків (а.з.). Плазмідна ДНК pPAL-7 представляє собою кільцеву молекулу ДНК, що складається з 5901 пар нуклеотидних залишків (п.н.з.) та містить наступні генетичні елементи, регуляторну промотерну ділянку з бактеріофагу Т7, ген, що кодує репресор Lad з бактеріофагу лямбда, ColEl початок реплікації та ген беталактамази, що надає стійкість бактеріальному штаму Е. соlі, що містить плазміду pPAL-7, до антибіотика - ампіциліну (Фіг. 1). Модуль для експресії рекомбінантних протеїнів (трансформації спеціального штаму E.coli плазмідним вектором) представлений бактерійним штамом Е. соlі, BL21(DE3). Цей штам широко використовується в лабораторній практиці як спеціальний реципієнт для забезпечення індукованої експресії генів, що транскрибуються під контролем Т7 промотору. Штам BL21(DE3) лізогенний та містить у геномі копію Т7 РНК полімерази під контролем lacUV5 промотору. Індукція експресії за допомогою ІПТГ продукує Т7 РНК полімеразу, що в свою чергу призводе до ініціації транскрипції цільових генів, що знаходяться під контролем Т7 промотору плазміди pPAL-7. Крім того, штам Е. coli BL21(DE3) є дефіцитний на протеази OmpT та Ion, що забезпечує покращення стабільності рекомбінантних протеїнів. Модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profmity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізин протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. Специфічна взаємодія (Kd < 100 рМ) забезпечується через функціональне зв'язування продомену субтилізину у складі рекомбінантного протеїну із субтилізином S189 матриці Profmity eXact resin. Принципова особливість технології Profmity eXact полягає в тому, що субтилізин S189 матриці Profmity eXact resin не тільки специфічно взаємодіє з цільовим протеїном, виділяючи його із суміші бактерійних протеїнів, але і за певних умов, розпізнає і точно розщеплює молекулу рекомбінантного цільового протеїну, залишаючи продомен субтилізину зв'язаним із матрицею, а вільний від тегів рекомбінантний протеїн, виділяється у вільній фракції з протоком буфера для елюції. Розщеплення рекомбінантного протеїну, зв'язаного із матрицею Profmity eXact resin ініціюється наявністю іонів фтору у буфері для елюції. Дизайн генетичної конструкції pPAL-IFN- включає аналіз амінокислотної послідовності зрілої форми референсної послідовності альфа інтерферону GenBank № NP000596 та комп'ютерне моделювання гена, що включає переведення амінокислотної послідовності в нуклеотидну (back translation) з одночасною адаптацією кодонів до генетичного апарату Е. coli. На основі підібраної нуклеотидної послідовності гена альфа інтерферону було вибрано 20 олігонуклеотидних послідовностей (праймерів), що на одну третину перекривалися між собою, та у сукупності перекривали цілий ген альфа інтерферону, розміром 495 п.н. Вибрані праймери були синтезовані на автоматичному ДНК-синтезаторі та використані в полімеразній ланцюговій реакції (в модифікації: overlap-extension PCR) для отримання повноцінного гена альфа інтерферону людини, готового для клонування у плазмідний вектор pPAL-7. Для клонування гена альфа інтерферону у плазмідний вектор pPAL-7 були вибрані сайти ендонуклеазної рестрикції Hindlll та EcoRI, що дало можливість отримати відкриту рамку зчитування гена інтерферону із продоменом субтилізину на 5'-кінці для подальшого очищення рекомбінантного гібридного протеїну за використанням афінної матриці Profmity eXact resin. 2 UA 102080 U 5 10 Таким чином, завдяки корисній моделі, що заявляється, розроблена технологія отримання активного рекомбінантного альфа інтерферону людини (hrIFN-2b), що не містить у своєму складі N-термінального метіоніну, що вирішується клонуванням гена hrlFN-2b у плазмідний вектор pPAL-7. Одержана генетична конструкція названа pPAL-IFN-. Дизайн генетичної конструкції передбачає, що після протеолітичного розщеплення, зв'язаного із матрицею Profinity eXact resin рекомбінантного інтерферону, виділяється вільна від тегу (продомену субтилізину), зріла форма інтерферону альфа 2b людини, що не містить у своєму складі N-термінального метіоніну, розміром 165 а.з. (Фіг. 2). Рекомбінантний альфа-2b (далі альфа-2) інтерферон людини має антивірусну, антипроліферативну, імуномодулюючу активність, він не містить у своєму складі Nтермінального метіоніну, розміром 165 аз. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб отримання рекомбінантного інтерферону альфа-2b людини, що включає клонування гена альфа-інтерферону в плазмідний вектор, трансформацію спеціального штаму Е. соlі плазмідним вектором та афінне очищення рекомбінантного альфа інтерферону, який відрізняється тим, що включає дизайн генетичної конструкції pPAL-IFN- in silico, синтез цільового гена in vitro із використанням полімеразної ланцюгової реакції, модуль для афінного очищення цільових протеїнів представлений спеціальною матрицею Profmity eXact resin, агарозою з ковалентно пришитою мутантною формою субтилізін протеази S189, з якою специфічно взаємодіє цільовий рекомбінантний протеїн, що кодується плазмідою pPAL-7. 3 UA 102080 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4