Рекомбінантна плазмідна днк pssk inf-a(2b), що кодує синтез людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b

Рекомбінантна плазмідна ДНК pSSK-INFa(2b), що кодує синтез людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b, яка має довжину 5814 п.н. та містить наступні фрагменти: фрагмент ДНК довжиною 501 п.н., який є модифікованим геном людського інтерферону альфа-2b та має послідовність: 2 (19) 1 3 35557 клази). Різні підтипи інтерферонів альфа позначаються цифрами (інтерферон альфа-1, інтерферон альфа-2 і т.д.). Буква наприкінці назви означає певні відмінності у послідовності амінокислот. Наприклад, інтерферон альфа-2а та інтерферон альфа-2b відрізняються одним амінокислотним залишком у положенні 23: альфа-2а містить залишок лізину, а альфа-2b-залишок аргініну (Dorr RT. Interferon-alpha in malignan and viral diseases. A review. Drugs. 1993 Feb; 45(2): 177-211). Було виділено більше 14 генетичних різновидностей інтерферону альфа, кожна з яких має широке застосування у медицині як противірусний, антипроліферативний та імуномодулюючий засіб. Готові лікарські форми на основі рекомбінантного інтерферону (наприклад, Інтрон (Шеринг-Плау), Лаферон (ФармБіоТех), Лаферобіон (Біофарма), Віферон (Ферон), Реальдірон (Біофа) широко використовуються для терапії вірусних гепатитів А, В, С, D та різних онкологічних захворювань. Є відомими способи одержання лейкоцитарного інтерферону з лейкоцитів донорської крові людини, які попередньо індукуються вірусами, дволанцюговими РНК та іншими індукторами (патенти RU1709615, 1990; RU2066188, 1993; GB2111062, 1983; СА1264295, 1990; UA44816, 2002). Недоліком такої технології є складність масштабування, низький вихід інтерферону (максимум до 12тис.МО/мл лейкоцитарної культури) та ризик контамінації гемотрансмісивними вірусами людини: вірусом гепатиту С, В, ВІЛ-1 та 2, та вірусами людини, які передаються контактним шляхом: парвовірус В19, вірус гепатиту А. Тому на сьогоднішній день більш перспективним є отримання інтерферону альфа шля хом мікробіологічного синтезу, який забезпечує можливість одержання цільового продукту з більшим виходом із порівняно більш недорогої сировини. Такий спосіб позбавлений недоліків способу одержання інтерферону із донорської крові, а залучення генно-інженерних підходів при такому синтезі дозволяє створити оптимальні для бактеріальної експресії варіанти структурного гена, а також інших регуляторних елементів, що контролюють експресію. Вказаний спосіб забезпечує вихід інтерферону до 1г і більше з 1л бактеріальної культури (при середній питомій активності 1,4´108МО/мг білка). Як мікроорганізмипродуценти інтерферону використовують штами, трансформовані рекомбінантними конструкціями (плазмідами), що містять кодуючу послідовність гену інтерферону. На сьогоднішній день плазміди, що кодують послідовність інтерферону альфа-2b людини, використовуються у виробництві профілактичних засобів у формі пробіотиків. Так, є відомими клітини Bacilus subtilis штаму ВКПМ В-4759, які містять рекомбінантну плазміду, що кодує амінокислотну послідовність інтерферону. Проте вказаний штам, що містить генетичну конструкцію, характеризується невисоким рівнем експресії цільового білка та не може бути використаним у те хнології одержання фармацевтичного рекомбінантного інтерферону. Є відомим спосіб отримання рекомбінантного інтерферону з використанням продуцента на ос 4 нові дріжджових клітин Pichia pastoris, які є трансформованими плазмідою pHIL-D2, що містить клонований ген інтерферону альфа людини та промотор АОХ1 (РСТ/ІВ00/00339, 2000). Недоліком використання вказаного продуцента є низький вихід цільового білка - 100-150мг з 1л. дріжджової культури. Найбільшого поширення отримали технології на основі бактеріальних клітин Е. соlі. Так, у відповідності з RU2054041 одержують рекомбінантну плазміду pIF16, яка містить тандем двох генів інтерферону, між якими знаходиться синтетичний цистрон довжиною 69п.н. Біосинтез інтерферону клітинами штаму-продуцента E.coli SG 20050, що містить таку плазміду, контролюється тандемом двох м утантних конститутивни х триптофанових промоторів та термінатором транскрипції фага X. Плазміда містить ген стійкості до ампіциліну та реплікон вектора pBR322. Рівень експресії в такій системі знаходиться в межах 200-300мг цільового білка на 1л бактеріальної культури. Недоліком даної плазміди є використання сильних конститутивних нерегульованих промоторів та гену беталактамази як селективного гена. Сукупність цих елементів призводить до дисоціації та елімінації плазміди під час ферментації. Одержаний штампродуцент Escherichia coli ВКПМ В-5809, що містить вказану плазміду, потребує використання дорогих синтетичних середовищ з низьким вмістом триптофану та призводить до збільшення часу ферментації з 6-12 до 15-25 годин. Найбільш близькою до плазміди pSSK-INFa(2b), що заявляється, є плазміда pES4-4 згідно з патентом RU2242516. Вказана плазміда містить 5917п.н. та складається із синтетичного гену інтерферону, Nde I/Ваm НІ-фрагменту плазміди рЕЕ22b(+), що несе як селективний маркер ген стійкості до ампіциліну. Експресія знаходиться під контролем T7/lас-промотора та термінатора транскрипції Т7-РНК полімерази, ген якої несе хромосома клітини-господаря. Така система експресії дозволяє отримати більше 1г цільового білка з 1л бактеріальної культури. Використання сильного регульованого синтетичного промотора Т7/1ас дозволяє позбавитися від використання бідних за вмістом триптофану дорогих поживних середовищ. Недоліком плазміди pES4-4 є використання як селективного маркера гену бета-лактамази, тому при культивуванні штаму E.coli SX50, одержаного в результаті трансформації вказаною плазмідою, продукт секретується бактеріальною клітиною у поживне середовище. В результаті відбувається постійне послаблення селективних умов для клітин, що містять плазміду. Це призводить до накопичення безплазмідних клітин та, відповідно, до зниження рівня експресії цільового білка. Задачею корисної моделі є підвищення рівня експресії цільового білка у поєднанні зі стабільністю вектора шляхом удосконалення системи вектор-хазяїн. Вказана задача вирішується за рахунок створення рекомбінантної плазмідної ДНК pSSK-INFa(2b), що кодує синтез людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b, та штаму Е. соlі BL21(INF 5 35557 a(2B)), який несе вказану рекомбінантну конструкцію та забезпечує продукцію інтерферону альфа2b людини. При цьому рекомбінантна плазмідна ДНК pSSK-INF-a(2b), що кодує синтез людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b, має довжину 5814п.н. та містить наступні фрагменти: фрагмент ДНК довжиною 501п.н., який є модифікованим геном людського інтерферону альфа-2b та має послідовність: регуляторні елементи експресії цільового білка - T7/lас-промотор та T7-термінатор загальною довжиною 62п.н.; оrі - область початку реплікації плазмід СоlЕІтипу (початок реплікації з 3768п.н.), селективний маркер - ген стійкості до канаміцину Каn довжиною 812п.н.; orifl - область початку реплікації бактеріофага fl довжиною 455п.н. Плазміда також містить унікальні сайти рестрикції для Xba I, Bpul 102 І, Pvu I, Cla І, Есо57 І, Dra III. Фрагмент ДНК - продукт гідролізу pSSK-INFa(2b) ендонуклеазами рестрикції Есо57 І та Dra III довжиною 1355п.н. містить генетичний маркер резистентності до канаміцину Кап, ХbаІ та Врu 11021, довжиною 700п.н. - модифіковану кДНК гену інтерферону альфа-2b людини. Стабільність плазміди забезпечується за рахунок селективного маркера - гена стійкості до канаміцину Каn. Штам Е. coli BL21(INF-a(2b)) - продуцент людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b отримують шляхом трансформації плазмідою pSSK-INF-a(2b) клітин Е. coli BL21(DE3) з використанням традиційної генно-інженерної технології. За рахунок того, що продуцент несе структурний ген Т7-РНК полімерази, контрольований lаспромотором, цільовий білок експресується в кількості не менше, ніж 50% від загального вмісту білків клітини-хазяїна. В такій системі вектор-клітина за рахунок інтенсивної експресії інтерферон альфа-2b утворює «тільця включення», які представляють собою нерозчинну, денатуровану форму цільового білка. Цінністю створеної системи також є те, що продуцент Е. coli BL21(INF-a(2b)) має фенотип Lon OmpT, виключаючи тим самим можливість протеолізу цільового білка найбільш активними протеазами клітини-хазяїна. Штам-продуцент Е. coli BL21(INF-a(2b)) характеризується наступними культуральноморфологічними характеристиками: 1. Клітини дрібні, потовщені паличковидної форми, грамнегативні, неспороносні. 2. Клітини добре ростуть на простих поживних середовищах. На агаризованому середовищі 6 утворюють колонії круглі, гладкі, притиснуті, каламутні, блискучі, сірі, з рівними краями. 3. Клітини добре ростуть при температурі 440°С з оптимумом рН середовища 6,8-7,5. Джерелом азоту можуть бути як мінеральні солі амонію, так і органічні речовини, наприклад, пептон, триптон, дріжджовий екстракт. В якості джерела вуглецю клітини використовують вуглеводи, гліцерин, амінокислоти. 4. Клітини проявляють стійкість до канаміцину в концентрації 100мкг/мл. 5. Особливою властивістю клітин є здатність до синтезу поліпептиду з амінокислотною послідовністю, що відповідає інтерферону альфа-b лейкоцитів людини. Інтерферон альфа-2b під час ферментації продуцента Е. coli BL21(INF-a(2b)) накопичується в клітинах у ви гляді «тілець включення». Ця особливість має ряд переваг, зокрема, цільовий білок легко виділяється з клітин у вигляді нерозчинного осаду, після чого очищається від значної кількості білків бактерії шляхом елементарного відмивання буферним розчином з додаванням детергентів. Залишок розчиняють у концентрованому розчині хаотропних агентів та піддають рефолдингу (ренатурації) з наступним хроматографічним очищенням. Опис ккорисної моделі супроводжується наступними фігурами: Фігура 1. Фізична карта рекомбінантноїплазміди pSSK-INF-a(2b) Фігура 2. Модифікована нуклеотидна послідовність гену людського лейкоцитарного інтерферону альфа-2b для використання у корисній моделі. Фігура 3. Ефективність експресії рекомбінантного інтерферона 2b людини клітинами продуцента Е. coli BL21(INF-a(2b)). На Фігурі 3 представлене лектрофоретичне розділення білків, експресованих продуцентом до та після індукції. 1 робочий стандартний зразок культури продуцента після експресії цільового білка 2-4 зразки продуцента під час ферментації: 2 до внесення індуктора 3 через 30хв. після внесення індуктора 4 через 6-8 годин після внесення індуктора (безпосередньо перед збором біомаси) Сутність та переваги експресуючої рекомбінантної плазміди pSSK-INF-a(2b) та продуцента рекомбінантного інтерферону на її основі Е. coli BL21(INF-a(2b)) демонструються з посиланням на наступні приклади. Приклад 1 Конструювання рекомбінантної плазміди pSSK-INF-a(2b). Для проведення процедури конструювання використовували плазміду рЕТ24а(+). Вказана плазміда є доступною комерційно та поставляється на ринок фірмою Novagen (Madison, Wisconsin, USA. T7/lас-промотор (16п.н.) є синтетичним та видозміненим фрагментом ДНК промотора одного з ранніх генів фага Т7, а Г7-термінатор (46п.н.) є синтетичним та видозміненим фрагментом ДНК термінатора одного з ранніх генів фага Т7. кДНК на матриці мРНК, виділеної з індукованих вірусом Нюкасла лейкоцитів, синтезували з використанням в якості праймерів пари олігонук 7 35557 леотидів: 5'-кінець прямого та 3'-кінець зворотного праймерів містить додаткові фрагменти, комплементарні полілінкеру вектора рЕТ24а(+). ПЛРпродукт, синтезований з використанням таких „доважок", фланкували послідовностями вектора, тому він містить додаткові сайти для рестрикції з можливістю клонування у вектор. При конструюванні праймерів також було поставлено за мету заміну найбільш „незручних" для Е. coli кодонів на переважні. Для цього останній нуклеотид декількох кодонів відкритої рамки зчитування замінювали. Всі параметри реакції ЗТ-ПЛР оптимізували до умов, які забезпечують синтез ДНК з мінімальними помилками у послідовності. Ефективність ПЛР оцінювали електрофоретично. Для клонування ПЛР-продукту використовували дві ендонуклеази рестрикції: ВаmНІ та Ndel, сайти для яких фланкують відкриту рамку зчитування. Контроль повноти гідролізу ДНК цими ферментами контролювали електрофоретично, після чого проводили лігування з використанням лігази Т4 з подальшою трансформацією лігазною сумішшю компетентних клітин Е. соїі штаму XL-1. Клі тини висівали на агаризоване середовище LB з канаміцином у концентрації 50мкг/мл. Колонії трансформантів піддавали скринінгу на присутність в них рекомбінантної плазміди методом ПЛР. Для цього замість матричної ДНК вносили слідову кількість клітин-трансформантів стерильним наконечником для автоматичної піпетки. Паралельно з цим колонії трансформантів пересівали у рідке середовище з метою виділення рекомбінантних плазмід з подальшим визначенням їх електрофоретичної рухливості. Рез ультати аналізу рекомбінантних плазмід свідчили про те, що клонування ПЛР-продукту, комплементарного мРНК гену інтерферону альфа-2b людини, пройшло успішно. Рекомбінантна плазміда pSSK-INF-a(2b) містила додатковий фрагмент ДНК, послідовність якого відповідає послідовності, представленій на Фігурі 2. Приклад 2. Трансформація клітин BL-21(DE3) рекомбінантною плазмідою pSSK-INF-a(2b) Для трансформації клітин Е. соlі штаму BL21(DE3) використовують плазміду pSSK-INF-a(2b), яку попередньо було виділено з клітин Е. соlі штам XL-1 після їх трансформації лігазною сумішшю. Виділення плазміди проводили методом лужного лізису. Для цього колонію клітин Е. соlі штам XL-1 з агаризованого селективного середовища висівають у рідке селективне середовище. Склад рідкого середовища (на 1л): пептон - 10г, бактодріжджовий екстракт - 5г, хлорид натрію - 10г, канаміцин - 50мг, вода - до 1л. Колонію мікробіологічною петлею переносили в 3мл рідкого стерильного середовища та проводили інкубацію при температурі 37°С протягом 18-24год. при 100об/хв. 1,5мл суспензії клітин центрифугували, осад ресуспендували в 200мкл розчину для лізису №1, що має наступний склад: глюкоза - 50мМ, Трис-НСl 25мМ (рН 8,0), ЕДТА - 10мМ. С успензію клітини інкубували протягом 5 хв. при кімнатній температурі, після чого додавали 400мкл розчину для лі 8 зису №2, що має наступний склад: гідроксид натрію - 0,2М, SDS - 1%, обережно ресуспендували, додавали 100мкл розчину 10М амонію ацетату (рН 8,0), витримували протягом 5хв. на крижаній бані та центрифугували протягом 5хв. в режимі 10тис. 14тис.об./хв при температурі 0°С. До 200мкл надосаду додавали 400мкл охолодженого етилового спирту, суміш перемішували, витримували протягом 10хв. при температурі мінус 20°С та центрифугували протягом 5хв. в режимі 10тис. 14тис.об./хв. при температурі 0°С. Надосад відкидали, а осад, що являє собою суміш плазмідної ДНК та клітинної РНК, розчиняли у воді та використовували для трансформації клітин Е. соlі штаму BL-21(DE3). Для трансформації клітин Е. coli штаму BL21(DE3) колонію культури, отриману на агаризованому поживному середовищі, переносили в 100мл рідкого поживного середовища, що має наступний склад (на 1л): 20г пептону, 5,5г бактодріжджового екстракту, 10мл розчину 1М хлориду калію, 2мл розчину 5М хлориду натрію. Культуру клітин вирощували до оптичної густини 0,6од (довжина хвилі 600нм). Для отримання компетентних клітин суспензію бактеріальної культури центрифугували протягом 5хв. в режимі 6тис.об./хв. при температурі 4°С та ресуспендували в 15мл охолодженого до 0°С розчину 100мМ хлориду кальцію. Суспензію витримували протягом 30хв. на крижаній бані та повторно центрифугували в аналогічних умовах, ресуспендували в 3мл охолодженого до 0°С розчину 100мМ хлориду кальцію, отримуючи, таким чином, компетентні клітини. До 100мкл суспензії компетентних клітин додавали 1мкл розчину ДНК плазміди pSSK-INF-a(2b) та клітинної РНК у воді та інкубували в наступному режимі: - протягом 20хв. на крижаній бані, - 30сек. - при температурі 42°С, - 30сек. - на крижаній бані. Після цього до клітин додавали 900мкл рідкого селективного середовища, що має наступний склад (на 1л): пептон - 10г, бакто-дріжджовий екстракт - 5г, хлорид натрію - 10г, вода - до 1л. Суспензію клітин в рідкому середовищі інкубували протягом 30хв. при температурі 37°С та наносили на агаризоване середовище на чашці Петрі, що має наступний склад (на 1л): пептон - 10г, бактодріжджовий екстракт - 5г, хлорид натрію - 10г, бактоагар - 15г, канаміцин - 50мг, вода - до 1л. Чашки інкубували протягом 18-24год. при температурі 37°С. Окремі колонії, утворені на чашках, після тестування на ефективність експресії цільового білка, використовували як продуцент рекомбінантного інтерферону альфа-2b-Е. coli штам BL-2l(INFa(2b). Приклад 3. Експресія інтерферону альфа-2b клітинами Е. coli штаму BL-21(/7VF-a(2b) Отримані у Прикладі 2 клітини Е. coli штаму BL-21(DE3), трансформовані плазмідою pSSK-INFa(2b), піддавали культивуванню в середовищі з доданням індуктора експресії ізопропіл-b-Dтіогалактопіранозиду з метою визначення найбільш придатного клону для синтезу цільового білка. Для цього 20 різних колоній трансформантів окремо мікробіологічною петлею переносили в 9 35557 100мл рідкого селективного середовища, яке має наступний склад (на 1л): пептон - 10г, бактодріжджовий екстракт -5г, хлорид натрію -10г, канаміцин - 50мг, вода - до 1л, інкубували при температурі 37°С протягом 18-24год. при 100об./хв. До бактеріальної суспензії кожного з трансформантів додавали гліцерин до 40% за об'ємом та консервували в спеціальних кріопробірках в об'ємі по 100мкл шляхом заморожування при температурі мінус 70°С, отримуючи, таким чином, головний банк культури клітин-продуцента. Головний банк в результаті повинен складатися не менше ніж з 20 кріопробірок, отриманих з окремої колонії трансформантів. Бактеріальні культури головного банку окремого трансформанту, розморожували та відновлювали їх метаболізм шляхом трьох послідовних пасажів на агаризованому селективному середовищі. Окрему колонію з третього пасажу переносили в 50мл рідкого селективного середовища та вирощували при температурі 37°С протягом 18-24год. при 100об./хв. до оптичної густини бактеріальної суспензії А = 0,6 (при довжині хвилі 600нм), додавали індуктор експресії ізопропіл-b-Dтіогалактопіранозиду до концентрації 0,1мМ та продовжували інкубувати протягом 6год. Відбирали аліквоти бактеріальної суспензії та визначали рівень експресії цільового білка в клітинах бактерій методом електрофорезу в поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію. Для цього до 10мкл суспензії додавали 1/4 об'єму денатур уючого буфера наступного складу: Трис-НСl - 200мМ (рН 6,8), 2-меркаптоетанол - 400мМ, SDS - 4%, бромфеноловий синій - 0,01%, гліцерин - 40%, інкубували на киплячій водній бані протягом 5хв. та еле 10 ктрофоретично розділяли в двоступеневій буферній системі в 15%-ному акриламідному гелі. Виявлення білків в гелі проводили методом фарбування сріблом. Визначення молекулярної маси білків та їх процентного вмісту проводили денситометрично методом внутрішньої нормалізації. Відповідно до результатів обробки електрофореграм найбільш ефективний штам цільового білка, отриманий з єдиної колонії трансформантів, залишали в головному банку, використовуючи його для отримання робочого банку клітин продуцента, в той час як інші - менш ефективні - видаляли. Паралельно визначають нуклеотидну послідовність клонованого фрагменту та порівнювали її з такою, що приведена на Фігурі 2, використовуючи для цього той клон продуцента трансформантів, який протягом щонайменше 10 пасажів стабільно експресував цільовий білок в кількості, не меншій 50% від загального вмісту білків клітини-хазяїна. Для цього з клітин Е. coli BL21(INF-a(2b)) виділяли плазміду, як описано в Прикладі 2, та за допомогою праймерів, описаних в Прикладі 1, проводили визначення послідовності нуклеотидів, використовуючи для цього як ланцюг, що кодує білок, так і комплементарний йому ланцюг ДНК. Визначена послідовність нуклеотидів клонованого фрагменту однозначно вказує на те, що вона здатна кодувати амінокислотну послідовність інтерферону альфа2b людини (Фігура 2). На Таблиці 2, що представлена нижче, приведено ефективність продукції інтерферону альфа2b людини одержаними клітинами Е. coli BL21(INFa(2b)). Таблиця 1 Процент експресованого рекомбінантного інтерферону альфа-2b людини від загальної кількості білків клітини Е. coli BL21(INF-a(2b)) протягом десяти пасажів в рідкому селективному середовищі № пасажа Е. coli BL21(INF-a(2b)) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Таким чином, заявлена корисна модель дозволяє одержати рекомбінантну плазміду pSSKINF-a(2b) з підвищеною стабільністю, на основі якої отримують штам клітин-продуцента Е. coli BL21(INF-a(2b), здатний експресувати рекомбінантний інтерферон альфа-2b людини. Культивування Процент інтерферону альфа-2b 65 67 60 63 59 60 62 63 59 56 клітин-продуцента вказаного штаму забезпечує рівень експресії цільового білка - рекомбінантного лейкоцитарного інтерферону-a(2b) людини, не менше ніж 1г/л бактеріальної суспензії, придатного для створення на його основі фармацевтичних та ветеринарних препаратів. 11 Комп’ютерна в ерстка Д. Шев ерун 35557 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601