Спосіб виготовлення бактеріального препарату для бактеризації сої

Реферат: Винахід належить до способу виготовлення бактеріального препарату для бактеризації сої, де бактеріальний препарат містить мікроорганізми виду Bradyrhizobium japonicum IMB-7198 (М-8) та Azospirillum brasilense, які культивуються у поживному середовищі наступного складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) - 0,3, глюкоза - 1,0, меляса - 0,5, (NH4)2SO4 - 0,1, KH2РО4×2Н2О 0,015, K2НРО4 - 0,015, MgSO4×7H2O - 0,01, СаСО3 - 0,05, вода дистильована - решта, посівний матеріал обох бактерій вносять у поживне середовище у співвідношенні 1:1. UA 103966 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до галузі сільськогосподарської мікробіології та біотехнології, а саме до виготовлення бактеріальних препаратів, що можуть бути використані в технологіях вирощування сої. Відомі способи одержання рідких бактеріальних препаратів, що включають культивування бульбочкових бактерій за контрольованих умов у спеціально підготовленому поживному середовищі. Отримані препарати використовують для передпосівної інокуляції насіння сої з метою збільшення її урожайності в результаті формування активного азотфіксувального бобово-ризобіального симбіозу [1, 2, 3, 4]. Недоліками відомих способів можуть бути недостатній рівень ростової активності бульбочкових бактерій, бульбочко утворення та азотфіксувальної активності в ризосфері рослин сої при застосуванні препаратів на основі Bradyrhizobium japonicum. Найбільш близьким до винаходу аналогом, що прийнятий за прототип, є спосіб виготовлення рідкого бактеріального препарату, біоагентом якого є штам бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 [2]. Проте, для підвищення ефективності препарату на основі бульбочкових бактерій необхідно збільшити ростову активність бульбочкових бактерій і забезпечити формування ефективного симбіозу Bradyrhizobium japonicum з рослинами сої. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб виготовлення бактеріального препарату на основі бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8, що забезпечить підвищення ростової активності бульбочкових бактерій, утворення на корінні більшої кількості активних бульбочок, підвищення активності азотфіксації, що сприяє зростанню маси рослин і урожайності сої. Поставлена задача вирішується шляхом розроблення нового способу виготовлення бактеріального препарату, що включає сумісне культивування двох видів мікроорганізмів, а саме: бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8 та асоціативних азотфіксувальних бактерій Azospirillum brasilense у спеціально підібраному поживному середовищі наступного складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) - 0,3; глюкоза - 1,0; меляса - 0,5; (NH4)2SO4 - 0,1; KH2РО4 × 2Н2О - 0,015; K2НРО4 - 0,015; MgSO4 × 7H2O - 0,01; СаСО3 - 0,05; вода дистильована - решта. Штам бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8 депонований у Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України (вул. Заболотного, 154, м. Київ, 03680) 06 вересня 2006 року за реєстраційним номером Bradyrhizobium japonicum 1MB В-7198. Спосіб виготовлення нового бактеріального препарату передбачає виконання наступних етапів:; 1) приготування посівної культури Bradyrhizobium japonicum М-8: бактерії вирощують в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину за температури 28±2 °C упродовж 72 годин у рідкому поживному середовищі наступного складу, мас. %: відвар насіння гороху - 10,0, глюкоза - 1,0, сахароза - 0,5, (NH4)2SO4 - 0,1, KH2РО4 × 2Н2О - 0,05, K2НРО4 - 0,05, MgSO4 × 7H2O - 0,02, СаСО3 - 0,03, вода дистильована - решта; 2) приготування посівної культури Azospirillum brasilense [5, 6]: бактерії вирощують в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину за температури 28±2 °C упродовж 48 годин у рідкому поживному середовищі такого складу, мас. %: кукурудзяний екстракт - 3,0, меляса - 3,0, (NH4)2SO4 - 0,01, KH2РО4 × 2Н2О - 0,025, K2НРО4 0,025, MgSO4 × 7H2O - 0,02, СаСО3 - 0,03, вода дистильована - решта; 3) сумісне культивування двох штамів бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8 і Azospirillum brasilense: бактерії суміщають і вирощують в умовах періодичного культивування на мікробіологічній качалці при 220 об./хвилину за температури 28±2 °C упродовж 72 годин у спеціально підібраному рідкому поживному середовищі такого складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) - 0,3; глюкоза - 1,0; меляса - 0,5; (NH4)2SO4 - 0,1; KH2РО4 × 2Н2О - 0,015; K2НРО4 - 0,015; MgSO4 × 7H2O - 0,01; СаСО3 - 0,05; вода дистильована - решта. При цьому посівний матеріал обох штамів бактерій вносять у поживне середовище у співвідношенні 1:1 (при початковій 3 концентрації клітин - 0,272 млрд. / см ). Використання отриманого бактеріального препарату на основі Bradyrhizobium japonicum М-8 і Azospirillum brasilense у технологіях вирощування сої сприяє збільшенню кількості бульбочок у рослин від 89 % до 95 % і підвищенню врожайності рослин - від 31 % до 37 %. Суть винаходу пояснюється такими прикладами. Приклад 1. Бактерії Bradyrhizobium japonicum М-8 і Azospirillum brasilense культивували при температурі 28±2 °C у рідкому середовищі для сумісного культивування упродовж 72 годин на підвісних мікробіологічних качалках. При сумісному культивуванні посівний матеріал обох штамів бактерій 1 UA 103966 C2 вносили в поживне середовище у співвідношенні 1:1 (початкова концентрація клітин становила 3 0,272 млрд./см ). Встановлено, що при сумісному культивуванні Bradyrhizobium japonicum М-8 із Azospirillum brasilense, ростова активність бульбочкових бактерій збільшується (табл. 1). 5 Таблиця 1 Ростова активність Bradyrhizobiumjaponicum М-8 Варіант В. japonicum М-8 (прототип) В. japonicum М-8 культивовані сумісно з A. brasilense №26 В. japonicum М-8 культивовані сумісно з A. brasilense 410 10 15 20 25 30 Чисельність мікроорганізмів, 3 млрд./см 2,7±0,23 4,1±0,27 3,9±0,20 Приклад 2. Ефективність передпосівної бактеризації сої вивчали в польовому досліді, для порівняння використовували мікробний препарат на основі штаму бактерій Bradyrhizobium japonicum М-8 (прототип). Польовий дослід проводили на лучно-чорноземному вилугуваному легкосуглинковому ґрунті із соєю сорту Легенда. Було закладено наступні варіанти: 1) контроль (без бактеризації); 2) бактеризація В. japonicum М-8 (прототип); 3) бактеризація A. brasilense 410; 4) бактеризація A. brasilense № 26; 5) бактеризація B. japonicum М-8 і A. brasilense 410; 6) бактеризація В. japonicum M-8 і A. brasilense № 26. Насіння сої бактеризували за 2 години перед висівом у ґрунт. Надземну масу рослин, кількість бульбочок, їх масу та азотфіксувальну активність визначали загальноприйнятими методами [7]. У фазі трьох листків надземна маса рослин була найвищою за передпосівної обробки насіння сої бактеріями В. japonicum M-8 культивованими сумісно із A. brasilense 410 та A. brasilense № 26 і перевищувала масу рослин, оброблених прототипом на 21,0 % і 13,0 % відповідно, кількість бульбочок на рослині була більшою у порівнянні з варіантом з прототипом на 82,6 % та 56,5 % відповідно, їх маса - на 140,0 % і 70,0 % відповідно, а азотфіксувальна активність - на 137,0 % та 51,9 % відповідно (табл. 2). Така закономірність простежувалася упродовж усього вегетаційного періоду сої. Зокрема, у фазі цвітіння надземна маса рослин, оброблених перед висівом В. japonicum M-8 культивованими сумісно із A. brasilense 410 та A. brasilense № 26 перевищувала масу рослин, оброблених прототипом на 16,0 % та 9,1 % відповідно, кількість бульбочок на рослині була більшою на 87,5 % та 71,9 % відповідно, їх маса - на 85,7 % і 67,9 % відповідно, а азотфіксувальна активність - на 51,4 % та 43,1 % відповідно. Закономірним є те, що у фазі наливу бобів за передпосівної обробки насіння сої В. japonicum M-8 культивованими сумісно із A. brasilense 410 та A. brasilense № 26 надземна маса рослин перевищувала масу рослин, оброблених прототипом на 8,3 % та 4,4 % відповідно, кількість бульбочок на рослині була більшою на 58,1 % та 51,2 % відповідно, а їх маса - на 38,0 % і 34,0 % відповідно, азотфіксувальна активність - на 113,0 % та 96,9 % відповідно. Таблиця 2 Вплив бактеризації на масу рослин, бульбочкоутворення та азотфіксувальну активність Надземна маса Кількість рослин, бульбочок, г/рослину од./рослину Фаза трьох листків Контроль (без бактеризації) 3,42 0,00 Бактеризація В. japonicum 4,23 5,75 M-8 (прототип) Бактеризація B. japonicum 5,12 10,50 M-8 і A. brasilense 410 Бактеризація В. japonicum 4,78 9,00 M-8 і A. brasilense № 26 HIP05 0,76 1,09 Варіант 35 2 Азотфіксувальна Маса бульбочок, активність, мкг г/рослину N/рослину/год. 0,00 0,00 0,10 0,27 0,24 0,64 0,17 0,41 0,03 0,14 UA 103966 C2 Продовження таблиці 2 Вплив бактеризації на масу рослин, бульбочкоутворення та азотфіксувальну активність Надземна маса Кількість рослин, бульбочок, г/рослину од./рослину Фаза цвітіння Контроль (без бактеризації) 40,33 0,00 Бактеризація В. japonicum 62,58 8,00 M-8 (прототип) Бактеризація В. japonicum 72,58 15,00 M-8 і A. brasilense 410 Бактеризація В. japonicum 68,25 13,75 M-8 і A. brasilense № 26 HIP05 9,70 2,34 Фаза наливу бобів Контроль (без бактеризації) 76,25 0,00 Бактеризація В. japonicum 112,08 10,75 М-8 (прототип) Бактеризація В. japonicum 121,42 17,00 M-8 і A. brasilense 410 Бактеризація В. japonicum 117,00 16,25 M-8 і A. brasilense № 26 HIP05 20,75 2,61 Варіант 5 10 15 Азотфіксувальна Маса бульбочок, активність, мкг г/рослину N/рослину/год. 0,00 0,00 0,28 2,18 0,52 3,30 0,47 3,12 0,07 0,48 0,00 0,00 0,50 1,31 0,69 2,79 0,67 2,58 0,11 0,84 Приклад 3. Вплив бактеризації на врожайність сої вивчали в польовому досліді. Дослід проведено згідно з варіантами, наведених у прикладі 2. У польових дослідах було перевірено ефективність передпосівної бактеризації сої сорту Легенда бактеріями, культивованими в чистих і змішаних культурах. У результаті проведених досліджень встановлено, що за передпосівної обробки рослин ризобіями, вирощеними в чистій культурі, урожайність сої збільшилася на 16,9 % відносно контролю (табл. 3). Проте, найефективнішими виявилися варіанти із передпосівною бактеризацією насіння бульбочковими бактеріями сої, культивованими сумісно з A. brasilense 410 і A. brasilense № 26, оскільки урожайність перевищила контроль на 37,2 % і 31,7 % відповідно. При цьому в зазначених варіантах урожайність сої була на 17,2 % (за обробки ризобіями, культивованими з A. brasilense 410) та на 12,6 % (за обробки бульбочковими бактеріями сої, вирощеними з A. brasilense №. 26) вищою, ніж у варіанті з передпосівною обробкою насіння В. japonicum M-8, культивованими в чистій культурі. Таблиця 3 Вплив передпосівної бактеризації на урожайність зерна сої сорту Легенда, польовий дослід Урожайність, т/га Контроль (без бактеризації) 2,23 Бактеризація В. japonicum M-8 (прототип) 2,61 Бактеризація В. japonicum M-8 і A. brasilense 410 3,06 Бактеризація В. japonicum M-8 і A. brasilense № 26 2,94 HIP05 0,36 Варіанти досліду 20 Приріст урожайності т/га % 0,38, 16,9 0,83 37,2 0,71 31,7 Джерела інформації: 1. Рекомендації з ефективного застосування мікробних препаратів у технологіях вирощування сільськогосподарських культур. - К.: 2007. - 52 с. 2. Пат. 39545 Україна, МПК (2006) 7 С 12 N 1/20, С 05 F 1/08. Штам бульбочкових бактерій Bradyrhizobium japonicum M-8 KIRCHNER, який використовують для приготування бактеріального препарату, що підвищує урожайність сої / Толкачов М. 3., Патика В. П., 3 UA 103966 C2 5 10 15 Каменева І.О., Грітчіна Л.Ю.; заявник і патентовласник Південний філіал Інституту сільськогосподарської мікробіології Української академії аграрних наук. - 2000105680, заявл. 06.10.2000; опубл. 15.06.2001, Бюл. №5. - 5 с. 3. Мікробні препарати у землеробстві. Теорія і практика: [монографія] / [Волкогон В. В., Надкернична О. В., Ковалевська Т. М. та ін.]; за ред. В. В. Волкогона. - К.: Аграрна наука, 2006. 311 с. 4. Іутинська Г. О. Ґрунтова мікробіологія: [навчальний посібник] / Г.О. Іутинська. - К.: Арістей, 2006. - 284 с. 5. Пат. 40542 Україна, МПК (2006) С 12 N 1/20, С 05 F 11/08. Штам бактерій Azospirillum brasilense для виробництва бактеріального добрива під гречку / Лохова Валентина Іванівна; Надкернична Олена Володимирівна; заявник і патентовласник Український науково-дослідний інститут сількогосподарської мікробіології УААН.-4323845/SU, заявл. 02.11.1987. 6. Волкогон В. В. Мікробіологічні аспекти оптимізації азотного удобрення сільськогосподарських культур / В. В. Волкогон. - К.: Аграрна наука, 2007. - 144 с. 7. Способи, приемы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции (методические рекомендации) / [ред. В.А. Тильба]. Благовещенск, 2005. - 71 с. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 Спосіб виготовлення бактеріального препарату для бактеризації сої, що передбачає приготування окремо посівної культури штаму Bradyrhizobium japonicum ІМВ-7198, який відрізняється тим, що додатково готують окремо посівну культуру Azospirillum brasilense, після чого вказані посівні культури сумісно культивують у поживному середовищі наступного складу, мас. %: дріжджі кормові (сухі) - 0,3, глюкоза - 1,0, меляса - 0,5, (NH4)2SO4 - 0,1, KH2РО4×2Н2О 0,015, K2НРО4 - 0,015, MgSO4×7H2O - 0,01, СаСО3 - 0,05, вода дистильована - решта, за початкової концентрації клітин Bradyrhizobium japonicum ІМВ-7198 і Azospirillum brasilense у співвідношенні 1:1. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4