Спосіб контролю епізоотичної ситуації щодо грипу птиці

Спосіб контролю епізоотичної ситуації щодо грипу птиці серед промислового та свійського поголів'я птахів, який відрізняється тим, що для дослідження використовують екстракти жовтків яєць в реакції затримки гемаглютинації з тестнабором ″АвіФлу-Тест″ виробництва Національного наукового центру "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини″. (19) (21) u200809201 (22) 14.07.2008 (24) 10.02.2009 (46) 10.02.2009, Бюл.№ 3, 2009 р. (72) БІЛЯВЦЕВА ОЛЕНА АН АТОЛІЇВН А, U A, ВОРОТІЛОВА НАДІЯ ГРИГОРІВНА, U A (73) КРИМСЬКА ДОСЛІДНА СТАНЦІЯ НАЦІОНАЛЬНОГО НАУКОВОГО ЦЕНТРУ "ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ", UA 3 39117 жовтків яєць і дослідженням на присутність антитіл до вірусу грипу. Методика отримання екстрактів жовтків яєць. Апаратура, матеріали і реактиви. Для проведення досліду застосовують: - центрифугу з частотою обертів 3000об/хв.; - центрифужні стакани ємністю 50см 3; - колби конічні скляні ємністю 100см 3 за ГОСТ 1770-74; - пробірки скляні ємністю 10, 15, 20см 3 за ГОСТ 25336-82; - піпетки пастеровські 1, 2, 5 і 10см 3 за ГОСТ 20292-74; - натрій хлористий за ГОСТ 4233-77 0,87% розчин (фізіологічний з рН 7,2-7,4); - хлороформ; - магнітну мішалку. Підготовка досліду. Відбирають свіжі яйця від птиці промислового або свійського утримання знесені не пізніше 1-3 діб. Після відокремлення жовтка від білку, жовток змішують із фізіологічним розчином рН 7,2-7,4 у співвідношенні 1:1, ретельно перемішують протягом 5-10 хвилин на магнітній мішалці, потім до одержаної суміші додають рівний об'єм хлороформу, струшують до утворення стійкої емульсії 5 хвилин, і центрифугують при 3000об/хв. 15 хвилин. Рідину, що утворилася над осадом, відбирають і досліджують в реакції затримки гемаглютинації з антигеном грипу птиць H5N1. Порядок дослідження сироваток в РЗГА. Матеріали та реактиви: - фосфатно-сольовий буфер (ФСБ); - дистильована вода; - тест-система "АвіФлуТест Н 5N1" для виявлення антитіл до вірусу грипу підтипу H5N1; - піпетки мірні на 1,0-2,5см 3; - плексиглазові панелі або апарат Такачі із панелями V. Петлями на 0,05см 3; - натрій лимоннокислий 3-заміщений за ГОСТ 22280-76,5% розчин; - еритроцити півнів у фізіологічному розчині, 1% завись; готуються наступним чином: кров беруть у півнів або курей у віці старше 6 місяців з підкрильцевої вени колбу з фізіологічним розчином у рівних об'ємах з 5% розчином лимоннокислого натру. Одержану кров відмивають фізіологічним розчином, осаджають центрифугуванням з частотою обертів 1500об/хв впродовж 15 хвилин. З осаду відмитих еритроцитів готують 1% суспензію на фізіологічному розчині [2]. Постановка РЗГА проходить у декілька етапів: 1. Постановка реакції гемаглютинації (РГА). Для постановки РГА готують двократні розведення антигенів (Н1-Н14) від 1:2 до 1:4096. Для цього в усі лунки планшету з V-подібною формою дна розливають ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У першу лунку вносять рівний об'єм антигену, трьохкратно пипетують і переносять по 0,025см 3 у другу лунку і т.д. Із останньої лунки рідину, що титр ується видаляють у дезрозчин. Після цього в кожну лунку вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3, а потім 1% суспензію еритроцитів курей в об'ємі 0,025см 3. планшет обережно струшують і залишають на 20-30 хвилин при кімнатній температурі (20-25°С). 4 Облік реакції: Проводять по наявності гемаглютинації (парасольки) або її відсутності (ґудзика). За титр антигену приймають його найбільше розведення, в якому чітко виражена гемаглютинація (осідання еритроцитів у вигляді "парасольки"). Титр гемаглютинуючої активності не повинен бути нижче 1:32. 2. Приготування робочої дози антигенів (4 ГАО): Робочу доз у антигену готують з урахуванням активності антигену (титру) визначеному в РГ А. Для цього антиген розводять ФСБ у стільки разів, скільки одержують поділенням його титру на 4. Наприклад, якщо титр антигену визначений у РГА, становить 1:128, для реакції його беруть у розведенні 1:32 (128:4=32). Робочу дозу антиген у го тують безпосередньо в день постановки реакції з обов'язковим її контролем (4 ГАО). Для цього у 4 лунки планшета вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У першу лунку додають рівний об'єм робочого розведення антигену (4 ГАО) і після трикратного піпетування 0,025см 3 переносять у другу, третю лунку, а з четвертої видаляють після піпетування 0,025см 3 рідини в дезінфікуючий розчин. Після цього в кожну лунку додають 1% суспензію еритроцитів курей в об'ємі 0,025см 3. При правильному визначенні робочої дози антигену у 1 і 2 лунку, які містять 2 і 1 ГАО, відповідно, повинна бути повна аглютинація еритроцитів (осад у вигляді "парасольки"). У третій та четвертій лунках аглютинація повинна бути відсутня (осад має вигляд "ґудзика"). 3. Постановка РЗГА: в усі лунки V-подібного планшета вносять ФСБ в об'ємі 0,025см 3. У перші лунки додають рівний об'єм піддослідних екстрактів яєць, трьохкратно пипетують і роблять послідовні двократні розведення (від 1:2 до 1:4096). Далі в усі лунки планшета вносять антиген у робочому розведенні в об'ємі 0,025см 3 та витримують при кімнатній температурі 20°С протягом 40 хвилин, після чого додають 1% суспензію еритроцитів курей у об'ємі 0,025см 3. Планшет обережно струшують і для осадження еритроцитів залишають на 20-30 хвилин при кімнатній температурі (20-25°С), після чого проводять облік реакції. Одночасно ставлять контроль еритроцитів на спонтанну аглютинацію (1% суспензія еритроцитів + ФСБ у рівних об'ємах по 0,025см 3). Аглютинація повинна бути відсутня. Облік реакції: Результат дослідження є позитивним, якщо титр антитіл у екстрактів яєць становить 3,0 log (1:8) і вище. Проведено дослід з екстрактами яєць від птиці. Результат приведено у таблиці. Таблиця Вид утримання Наявність щептиці плення Промислова "АвіФлуВак" Свійська Не щеплена Титр антитіл в екстрактах яєць 1:8-1:16 0 Літературні джерела, прийняті до уваги при експертизі. 5 39117 1. Музика Д.В., Стегній Б.Т. Методичні рекомендації. Епізоотологічний моніторинг та діагностика інфекційних хвороб диких птахів. - Харків. - 2006р. 2. ГОСТ 25581-91 "Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики гриппа птиц". Комп’ютерна в ерстка А. Рябко 6 3. Зареєстровано в Україні від 06 червня 2007 рок. № реєстрації 274314030107. 4. Wright H., En-Min Zhou. Development in international standartization. // Vet. Smmunol. And immunopathol. - 1999. - 72 №1-2 - p.243-248. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601