Штам активних азотфіксувальних бактерій azospirillum brasilense для інокуляції насіння пшениці ярої

Реферат: Штам бактерій Azospirillum brasilense, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером IMB В-7318, призначений для покращення азотного живлення пшениці ярої та активізації біосинтетичних процесів у рослинах. UA 105118 U (12) UA 105118 U UA 105118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сільськогосподарської мікробіології і є активним штамом азотфіксувальних бактерій, призначеним для покращення азотного живлення пшениці ярої, а саме: для посилення фіксації молекулярного азоту в кореневій зоні культури та активізації біосинтетичних процесів у рослинах. Відомі штами асоціативних діазотрофів виду Azospirillum brasilense для підвищення урожайності зернових культур: жита озимого, тритикале ярого та пшениці ярої [1,2,3]. Найбільш близьким аналогом корисної моделі є природний штам Azospirillum brasilense 102, який здатен фіксувати азот атмосфери та сприяти підвищенню стійкості пшениці ярої до збудників кореневих гнилей [3]. В основу корисної моделі поставлено задачу розширити арсенал природних високоактивних штамів-азотфіксаторів, які сприяють покращенню азотного живлення пшениці ярої та поліпшують якість одержаної сільськогосподарської продукції. Новий штам Azospirillum brasilense 77 був одержаний шляхом аналітичної селекції з коренів пшениці ярої сорту Варяг. За морфолого-культуральними і фізіолого-біохімічними ознаками штам віднесено до виду Azospirillum brasilense [4] та депоновано у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Заболотного, 154, м. Київ) 26 травня 2010 року за реєстраційним номером IMB В7318. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам Azospirillum brasilense 11 добре росте за температури 28-30 °C, рН 6,8-7,6 на агаризованому живильному середовищі наступного складу: бурштинова кислота - 2,5 г/л, калію гідроксид - 2 г/л, агар-агар порошковий -14,0 г/л, картопля - 200 г/л, рН = 7,0. Стерилізація - 1 атм. 30 хв. За три доби на картопляному агарі утворюються прозорі круглі колонії діаметром 4-6 мм. При старінні колонії набувають перламутрового блиску і накопичують рожевий пігмент, який не дифундує у середовище. На безазотному напіврідкому середовищі Доберейнер спостерігається ріст у вигляді плівки під поверхнею і активна фіксація молекулярного азоту. Клітини мають форму рухливих зігнутих паличок розміром 1,0-1,2×1,8-2,5 - мкм, грамнегативні. Під час руху форма клітин S-подібна. При старінні клітини містять гранули полі-оксимасляну кислоту. У старій культурі рухливість клітин зберігається. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. Каталазо-оксидазопозитивний. Аероб, але краще росте за мікроаерофільних умов. Молоко з лакмусом не пептонізує, не підлуговує і не підкислює, желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам помірно росте на твердих середовищах з органічними кислотами. Відношення до джерел азоту. Штам помірно росте на середовищах з мінеральними джерелами азоту. Рясно росте і фіксує азот на напіврідкому безазотному живильному середовищі Доберейнер з дріжджовим екстрактом. Відношення до дії антибіотиків. Штам резистентний до поліміксину, ампіцилліну, оксацилліну, амоксициліну. Цефалексин здійснює бактеріостатичний вплив на штам. Чутливий до цефтріаксону, ципрофлоксацину, левоміцитіну, гентаміцину, еритроміцину, канаміцину, фурадоніну. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз на 3 місяці і зберігається в лабораторних умовах на агаризованому картопляному середовищі за температури 4-5 °C. Нітрогеназна (ацетиленвідновлювальна) активність, визначена ацетилен-етиленовим методом, складає 9,59 нмоль етилену на 1 мл напіврідкого безазотного середовища за годину. Нітрогеназну активність визначали на газовому хроматографі "Chrom-4" з полум'яноіонізаційним детектором. Колонка довжиною 370 см була заповнена хромосорбом з -'-оксидипропіонітрилом. Температура термостату 50 °C, газ-носій-азот, витрата газів (у мл/хвилину): водню - 30, азоту - 100, повітря 500. Вплив пропонованого штаму на рослини пшениці ярої перевіряли у вегетаційних та польових дослідах. Штам сприяв підвищенню потенційної нітрогеназної активності у кореневій зоні рослин, підвищенню глутамінсинтетазної активності і вмісту розчинного білка та хлорофілів у листках рослин, збільшенню вмісту білка в зерні пшениці ярої, підвищенню урожайності культури. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1 1 UA 105118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 За умов польового досліду вивчали вплив інокуляції новим штамом A. brasilense 77 пшениці сорту Варяг на процес фіксації молекулярного азоту в кореневій зоні культури. З цією метою визначали потенційну нітрогеназну активність на коренях рослин. Для визначення потенційної 3 нітрогеназної активності корені рослин поміщали у флакони на 40 см , додавали 10 мл напіврідкого середовища Доберейнер. Флакони герметизували, вводили ацетилен (10 % від об'єму газової фази у флаконі) та інкубували упродовж доби за температури 26-28 °C. Після закінчення строку інкубації зразки аналізували на газовому хроматографі. Як видно з табл. 1, інокуляція пшениці ярої новим штамом A. brasilense 77 дозволила підвищити нітрогеназну активність у кореневій зоні культури на 45,6 %. Приклад 2 Згідно сучасних уявлень, молекулярний азот атмосфери, який у процесі функціонування асоціативних систем "діазотрофи - рослина" перетворюється на амоній, асимілюється рослиною у вигляді органічних сполук азоту. Зважаючи на те, що ключовим ферментом азотного обміну для рослин є глутамінсинтетаза, яка каталізує утворення амінокислоти глутаміну з L-глутамату за участю АТФ, визначали вплив бактеризації азоспірилами на активність рослинної глутамінсинтетази. Активність глутамінсинтетази у листках рослин оцінювали фосфатним методом [5]. Інкубаційна суміш (кінцевий об'єм 3,4 мл) містила: 100 мМ трис-НСl, рН 7,2; 150 мМ моноглутамату натрію; 7,5 мМ NH4Cl; 10 мМоль АТР; 10 мМоль MgCl2. Реакцію зупиняли внесенням 0,5 мл 20 % трихлороцтової кислоти. В освітленому центрифугуванням розчині визначали вміст фосфору (Р) молібденовим реактивом за утворенням фосфорномолібденового комплексу [6]. Вміст білка в листках рослин визначали за Лоурі [7]. Одержані результати представлено у табл. 2. Як свідчать дані табл. 2 інокуляція рослин активним штамом A. brasilense 77 приводить до вірогідного підвищення глутамінсинтетазної активності тканин пшениці ярої сорту Варяг на 57 %. Активність зазначеного ферменту, в свою чергу, впливає на синтез білка у листках рослин. Так, за інокуляції азоспірилами вміст білка у листках рослин пшениці ярої підвищився на 9,7 %. Приклад 3 Передпосівна інокуляція пшениці ярої пропонованим штамом позитивно вплинула на вміст хлорофілів в листках рослин, який визначали у фазі цвітіння спектрофотометричним методом [8]. Одержані результати (табл. 3.) свідчать про те, що за сумарним вмістом хлорофілів в листі рослин прибавка від інокуляції A brasilense 77 становила 18 %. Приклад 4 Інокуляція азоспірилами позитивно вплинула і на структурні показники урожаю (табл. 4). Наведені дані показали, що під впливом інокуляції новим штамом азоспірил відбувається збільшення довжини колоса, кількості зерен у колосі, маси зерен з одного колоса і, як наслідок, збільшення урожаю на 27,1 %. Приклад 5 Інокуляція пропонованим штамом не тільки забезпечувала підвищення урожаю зерна пшениці ярої, а й сприяла покращенню його якості, а саме: вміст білка і сирої клейковини збільшився на 6,8 і 9,7 % відповідно, натура зерна підвищилася на 2,9 % (табл. 5). Отже, застосування нового штаму азотфіксувальних бактерій Azospirillum sp. 11 для інокуляції пшениці ярої дозволило сформувати ефективну асоціативну систему діазотроф рослина, що сприяло підвищенню потенційної нітрогеназної активності у кореневій зоні рослин та активізації біосинтетичних процесів, а саме: активність глутамінсинтетази підвищилася на 57 %, вміст білка - на 6,8 %, вміст сирої клейковини на 9,7 %, при цьому відбулося підвищення урожайності культури на 27,1 %. Таблиця 1 Вплив інокуляції A. brasilense 77 пшениці сорту Варяг на нітрогеназну активність у ризоплані даної культури (польовий дослід 2008 p., фаза розвитку рослин - цвітіння) Потенційна нітрогеназна активність, нмоль С2Н4/г коренів за годину 794,41 1156,10 351,99 Варіант досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція A. brasilense 77 HIP05 50 2 UA 105118 U Таблиця 2 Вплив інокуляції A brasilense 77 на активність глутамінсинтетази та вміст розчинного білка у листках рослин пшениці ярої сорту Варяг (вегетаційний дослід) Варіант Пшениця яра (контроль) Пшениця яра, інокульована A. brasilense 77 НІР05 Активність глутамінсинтетази, мкмоль Pi/мг білка/год. 2,42 Вміст розчинного білка, мг/мл 45,76 3,80 50,18 0,57 0,49 Таблиця 3 Вплив інокуляції азоспірилами A. brasilense 77 пшениці ярої сорту Варяг на вміст хлорофілу в листі даної культури (польовий дослід 2008 р., фаза розвитку рослин - цвітіння) Варіант досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція A. brasilense 77 НІР05 Хлорофіл a, мг/100 г сирої речовини 218,13 269,07 24,10 Хлорофіл b, мг/100 г сирої речовини 53,95 51,54 4,46 Сума хлорофілів а+b, мг/100 г сирої речовини 272,08 320,61 Таблиця 4 Вплив інокуляції азоспірилами A. brasilense 77 пшениці ярої сорту Варяг на структурні показники урожаю даної культури (польовий дослід, 2008) Варіант досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція A. brasilense 77 HIP05 Довжина колосу, см 14,00 14,91 0,54 Кількість зерен Маса зерен з 1 в 1 колосі, од. колоса, г 25,05 1,09 27,32 1,27 1,71 0,10 Урожай, т/га 27,30 34,69 0,11 Таблиця 5 Якість зерна пшениці ярої сорту Варяг під впливом інокуляції A. brasilense 77 Варіант досліду Контроль (без інокуляції) Інокуляція A. brasilense 77 Вміст білка, % 12,46±0,37 13,31±0,42 Вміст сирої клейковини, % 31,10±0,87 34,11±1,05 Натура зерна, г/л 776,45±23,34 799,06±25,0 5 10 15 Джерела інформації: 5 1. Пат. 40548 Україна, МПК А01C1/00, C05F11/08. Спосіб передпосівної обробки насіння озимого жита // О.В. Надкернична, В.І. Лохова; заявник і патентовласник: Український науководослідний Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН. - № 4797651; Заявл. 02.01.90; Опубл. 16.07.01, Бюл. № 6-3 с. 2. Пат. 104212 Україна, МПК 2012 С12N1/20, C12R1/01, C05F11/08. Штам бактерій Azospirillum brasilense для інокуляції насіння тритикале ярого / Надкернична О.В., Шаховніна О.О., Ушакова М.А. заявник та патентовласник: Інститут сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН. - № а201203817; Заявл. 29.03.12; Опубл. 10.01.14, Бюл. № 1. - 3 с. 8 3. Пат. 85924 Україна, МПК C05F11/08. Штам бактерій Azospirillum brasilense для виготовлення бактеріального добрива під пшеницю яру / Копилов Є.П.; заявник і патентовласник: Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН. № а200706203; Заявл. 04.06.2007; Опубл. 10.03.2009, Бюл. № 5. - 4 с. 3 UA 105118 U 5 10 4. Bergy's manual of Systematic Bacteriology. Volume Two: The Proteobacteria (Part C) Editor-inchief: Garrity, George Brenner, Don J.; Krieg, Noel R.; Staley, James T. (Eds.) 2005. 5. Евстигнеева З.Г. Определение активности глутаминсинтетазы / З.Г. Евстигнеева, Е.А. Громыко, К.Б. Асеева / Прикладная биохимия и микробиология. - 1972. - Т. 8. - № 1. - С. 251253. 6. Кретович В.Л. Биохимия растений / В.Л. Кретович. - М.: Высшая школа, 1986. - 503 с. 7. Филиппович Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович. - М: Просвещение, 1975. - 318 с. 8. Гродзинский A.M., Гродзинский Д.М. Краткий справочник по физиологии растений. - К.: Наукова думка, 1973. - 398 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Штам бактерій Azospirillum brasilense, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України за реєстраційним номером IMB В-7318, призначений для покращення азотного живлення пшениці ярої та активізації біосинтетичних процесів у рослинах. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4