Штам бактерій rhizobium phaseoli для інокуляції насіння спаржевої квасолі

Реферат: Винахід належить до штаму бактерій Rhizobium phaseoli B-7319 призначеного для виробництва бактеріальних добрив для інокуляції насіння спаржевої квасолі. UA 104211 C2 (12) UA 104211 C2 UA 104211 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до сільськогосподарської мікробіології, а саме до мікробних засобів підвищення врожайності бобових культур. Це активний штам бульбочкових бактерій Rhizobium phaseoli B-7319, призначений для підвищення урожайності спаржевої квасолі та захисту рослин від збудників кореневих гнилей. Квасоля овочева (спаржева) займає одне з перших місць за поживними якостями порівняно з продуктами рослинного походження і серед овочевих бобових культур відрізняється підвищеною цінністю. Надійним шляхом одержання високоякісних продуктів переробки спаржевої квасолі є впровадження у виробництво екологічно безпечної технології, яка передбачає підсилення функціонування симбіотичної системи за рахунок використання біопрепаратів на основі високоефективних штамів бульбочкових бактерій виду Rhizobium phaseoli [1-3]. Відомі колекційні штами Rhizobium phaseoli 2624, Rhizobium phaseoli 2625, Rhizobium phaseoli 2631, застосування яких для передпосівної обробки насіння квасолі звичайної (зернової) забезпечувало підвищення урожайності культури на 0,13-0,20 т/га порівняно до контролю (без інокуляції). Штами Rhizobium phaseoli ФК 6, Rhizobium phaseoli Ф 13, отримані методом відбору з природної популяції, також підвищували урожайність квасолі на 0,18-0,19 т/га у порівнянні зі штамом-еталоном Rhizobium phaseoli 2627. Ефективність цих штамів перевірялася в зоні Лісостепу України [3]. Однак при визначенні азотфіксувальної активності зазначених штамів не враховувалася щільності ґрунтових популяцій ризобій квасолі. Не виявлено даних щодо впливу цих штамів на продуктивність спаржевої квасолі, зокрема на врожайність бобів-лопаток. Найбільш близьким до запропонованого винаходу є штам-прототип Rhizobium phaseoli 700 (ВКМ 2624). Він активно фіксує молекулярний азот у симбіозі з квасолею, сприяє підвищенню її урожайності, використовується як стандартний штам у наукових дослідженнях [4]. Проте цей штам поступається пропонованому штаму за активністю азотфіксації, здатністю конкурувати з представниками численних місцевих популяцій бульбочкових бактерій Rhizobium phaseoli (конкурентоспроможністю) та за здатністю підвищувати урожайність надземної маси, зерна, а також лопаток спаржевої квасолі. В основу винаходу поставлена задача отримати новий високоефективний штам бульбочкових бактерій квасолі, який характеризувався би комплексом господарсько-цінних ознак і як біоагент бактеріальних препаратів, забезпечував стабільно високий врожай бобівлопаток спаржевої квасолі. Поставлена задача вирішується шляхом отримання нового штаму Rhizobium phaseoli B-7319 методом аналітичної селекції. Новий штам вступає в активний симбіоз із спаржевою квасолею, посилює фіксацію молекулярного азоту повітря, проявляє високу захисну дію проти кореневих гнилей та суттєво підвищує продуктивність цієї культури. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 виділений з численної популяції ризобій квасолі, пристосований до ґрунтово-кліматичних умов України та спроможний витримувати конкуренцію з представниками місцевих популяцій Rhizobium phaseoli. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 виділений з бульбочок квасолі сорту Мавка, яку вирощували на дерново-підзолистому ґрунті в зоні Полісся України (м. Чернігів). рН водне ґрунту - 6,0; вміст гумусу 1,2 %; азоту, що легко гідролізується (за Тюріним і Кононовою) - 57,058,0 мг; Р2О5 - 160,0-165,0 мг і К2О (за Кірсановим) - 100,0-112,0 мг на 1 кг ґрунту. Пропонований штам ідентифікований за визначником Берджі [5] та депонований у Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології НАН України (вул. Академіка Заболотного 154, м. Київ) 26 травня 2010 року за реєстраційним номером Rhizobium phaseoli B-7319. Він також зберігається в колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології та агропромислового виробництва НААН. Морфолого-культуральні властивості штаму. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 добре росте на твердому поживному середовищі (гороховий агар) такого складу, г/л: К2НРО4 - 0,5; КН2РО4 - 0,5; MgSO4- 0,2; NaCl - 0,2; CaSO40,1; (NH4)2MoO4 - сліди; сахароза (цукор) -20,0; відвар гороху - 1 л (100 г гороху на 1 л води, прокип'ятити 40 хв., профільтрувати), агар-агар - 20,0 г, рН = 6,8-7,0. Стерилізація середовища 1,0 атм 30 хв. Культура бактерій швидкоросла (на твердому середовищі колонії з'являються на 2 добу), аеробна. Спор не утворює. Клітини рухомі, мають форму злегка зігнутих паличок, грамнегативні. Штрих на гороховому середовищі слизистий, напівпрозорий, стікає. На чашках Петрі колонії на 3-4 добу росту округлої форми, великі, слизисті, напівпрозорі, діаметр колоній перевищує 2-3 мм. Оптимальна температура росту – 28 °C, рН = 6,8-7,0. Фізіолого-біохімічні властивості штаму. 1 UA 104211 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Аероб. Молоко з лакмусом не пептонізує, знижує рН середовища до кислого. На поверхні молока утворює прозору слизисту зону. Желатину не розріджує. Відношення до джерел вуглецю. Штам добре росте на середовищах з сахарозою, глюкозою, лактозою, мальтозою, фруктозою та манітом, помірно використовує сорбіт. На рідкому середовищі Нориса рН змінюється до 6,0. Відношення до джерел азоту. Штам добре росте на середовищах з амонійними солями, азотнокислим калієм. Переважно використовує відновлені форми азоту. На м'ясо-пептонному агарі та м'ясо-пептонному бульйоні не росте. Штам чутливий до більшості досліджених антибіотиків (левоміцетину, амоксициліну, ампіциліну, цефотаксиму, цефтріаксону, цефалексину, цефазоліну, гентаміцину, амікацину, канаміцину, еритроміцину, ципрофлоксацину, норфлоксацину, поліміксину), резистентний до оксациліну та фурадоніну. Ознаки штаму стійкі. Штам патогенних властивостей не має (належить до групи авірулентних мікроорганізмів, не здатних до інвазії у внутрішні органи теплокровних тварин). Штам пересівається один раз в 6 місяців і зберігається в лабораторних умовах на твердому бобовому (гороховому) середовищі за температури 4-5 °C. Штам Rhizobium phaseoli B-7319 забезпечує підвищення урожайності бобів-лопаток спаржевої квасолі на 27,2 % порівняно до референтного штаму Rhizobium phaseoli 700 і на 42,6 % відносно контролю (без інокуляції). Ефективність та конкурентоспроможність штаму Rhizobium phaseoli B-7319 перевіряли у вегетаційному та польових дослідах. Приклади конкретного застосування штаму. Приклад 1. У вегетаційному досліді вивчали вплив бактеризації насіння спаржевої квасолі сорту Amazone (наданий Національним центром генетичних ресурсів рослин України) новим штамом Rhizobium phaseoli B-7319 на симбіотичні показники рослинно-мікробної системи. Насіння квасолі інокулювали штамом-прототипом Rhizobium phaseoli 700 та новим штамом ризобій квасолі у розрахунку 200-300 клітин на насінину. Абсолютним контролем слугували рослини не інокульовані бульбочковими бактеріями. Рослини вирощували до фази цвітіння і визначали масу бульбочок, їхню нітрогеназну активність та вміст сухої речовини в надземній масі рослин. Наведені в таблиці 1 дані свідчать, що новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 за впливом на показники активності симбіозу переважає штам-прототип Rhizobium phaseoli 700. Інокуляція насіння квасолі штамом Rhizobium phaseoli B-7319 активізує процеси бульбочкоутворення та фіксації молекулярного азоту. Так, у варіанті з бактеризацією цим штамом маса сформованих бульбочок була на 22,5 % вищою, ніж у варіанті із референтним штамом Rhizobium phaseoli 700. За використання штаму Rhizobium phaseoli B-7319 істотно підвищувалася нітрогеназна активність бульбочок порівняно до штаму-прототипу (на 23,4 %). Вміст сухої речовини в надземній масі рослин зростав відповідно на 22,4 % і 11,7 % порівняно до контролю та штамупрототипу. Приклад 2. Польові досліди було проведено у 2009-2011 роках на дерново-підзолистому супіщаному ґрунті на фоні численної популяції бульбочкових бактерій квасолі (дослідна ділянка Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН, м. Чернігів). У досліді використовували спаржеву квасолю сорту Amazone. Насіння квасолі інокулювали штамом-прототипом Rhizobium phaseoli 700 та пропонованим штамом Rhizobium phaseoli B-7319 у розрахунку 200-300 клітин на насінину. Абсолютним контролем слугували рослини не інокульовані бульбочковими бактеріями. Протягом вегетації визначали кількість бульбочок, їхню нітрогеназну активність та урожайність. У таблиці 2 наведені трирічні дані щодо утворення бульбочок на коренях спаржевої квасолі сорту Amazone у фазі цвітіння за інокуляції насіння штамом-прототипом Rhizobium phaseoli 700 та пропонованим штамом Rhizobium phaseoli B-7319. Незважаючи на спонтанне інфікування рослин представниками місцевої популяції Rhizobium phaseoli, штучна передпосівна інокуляція насіння досліджуваними штамами сприяла інтенсивній нодуляції. Аналіз динаміки бульбочкоутворення показав, що в середньому за три роки кращим мікросимбіонтом для квасолі сорту Amazone виявився новий штам Rhizobium phaseoli B-7319, який сприяв достовірному збільшенню кількості бульбочок порівняно із референтним штамом Rhizobium phaseoli 700 у 1,3-1,7 рази. Пропонований штам Rhizobium phaseoli В-7319 характеризується високою здатністю конкурувати з представниками численних місцевих популяцій бульбочкових бактерій квасолі, що доведено серологічними методами. Із застосуванням модифікованої схеми імунізації кролів до цього штаму була отримана специфічна імунна антисироватка. За допомогою реакції аглютинації встановлено, що за інокуляції насіння спаржевої квасолі новим штамом переважна 2 UA 104211 C2 5 10 15 20 25 30 35 більшість бульбочок (66,7 %) сформована саме штамом Rhizobium phaseoli B-7319 і це свідчить про його високу конкурентоспроможність. Важливим критерієм бобово-ризобіальних взаємовідносин є активність симбіотичної азотфіксації. Як видно з даних таблиці 3, новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 активно фіксує азот з повітря при взаємодії з рослинами спаржевої квасолі. Так, у фазі цвітіння протягом трьох років нітрогеназна активність бульбочок у варіанті з інокуляцією пропонованим штамом була достовірно більшою у 1,3-1,7 рази порівняно до штаму прототипу Rhizobium phaseoli 700 і в 2,13,1 рази порівняно до контролю. Приклад 3. Основне призначення спаржевої квасолі це отримання молодих бобів з недозрілим насінням - лопаток. Здатність штаму Rhizobium phaseoli B-7319 підвищувати урожайність бобів-лопаток спаржевої квасолі досліджували у польових дослідах в ґрунтовокліматичних умовах Полісся (2009-2011 pp., дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН, м. Чернігів). Тип ґрунту -дерново-підзолистий супіщаний. Сорт квасолі Amazone. Результати досліду наведені в таблиці 4. Встановлено суттєвий вплив досліджуваного штаму на урожайність лопаток спаржевої квасолі сорту Amazone. Так, у польових дослідах за інокуляції насіння штамом Rhizobium phaseoli B-7319 урожайність лопаток в середньому за три роки збільшилася на 27,2 % порівняно до референтного штаму Rhizobium phaseoli 700 і на 42,6 % відносно контролю (без інокуляції). Приклад 4. Здатність штаму Rhizobium phaseoli B-7319 обмежувати розвиток кореневих гнилей спаржевої квасолі досліджували у польовому досліді в ґрунтово-кліматичних умовах Полісся (2008 p., дослідне поле Інституту сільськогосподарської мікробіології НААН, м. Чернігів). Тип ґрунту -дерново-підзолистий супіщаний. Сорт квасолі - Amazone. Результати досліду наведені в таблиці 5. Встановлено, що штам Rhizobium phaseoli B-7319 проявляє високу захисну дію проти збудників кореневих гнилей. За інокуляції насіння спаржевої квасолі новим пропонованим штамом кількість уражених рослин на початкових етапах онтогенезу (фаза стеблування) зменшувалася на 53,3 %, тоді як за інокуляції штамом прототипом вона була меншою на 26,7 % при 100,0 % ураженні рослин у контрольному варіанті. Захисна дія нового штаму проявлялася також у фазі цвітіння (поширення хвороби 86,7 %), коли поширення кореневих гнилей у не бактеризованих рослин і за інокуляції штамом Rhizobium phaseoli 700 сягало 100,0 %. Пропонований штам Rhizobium phaseoli B-7319 значно стримує розвиток кореневих гнилей. Біологічна ефективність зазначеного штаму становила 26,8,4-36,7 %, тоді як ефективність штаму-прототипу Rhizobium phaseoli 700 не перевищувала 8,9-10,3 %. Таким чином, штам Rhizobium phaseoli B-7319 є активним симбіотичним азотфіксатором, спроможним активно колонізувати кореневу систему спаржевої квасолі за умов наявності у ґрунті численних популяцій ризобій квасолі. Він здатний інтенсифікувати процеси біологічної азотфіксації, підвищувати стійкість рослин щодо збудників кореневих гнилей і відрізняється більш високою ефективністю у порівнянні зі штамом-прототипом. Таблиця 1 Вплив інокуляції спаржевої квасолі штамами Rhizobium phaseoli на симбіотичні показники (вегетаційний дослід, 2010 p., дерново-підзолистий ґрунт) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 HIP05 Маса бульбочок, г/рослину 0,65 Нітрогеназна активність, мкг N/рослину/год. 3,88 Вміст сухої речовини в надземній масі рослин, г/рослину 1,25 0,89 7,56 1,37 1,09 9,33 1,53 0,13 1,38 0,06 40 3 UA 104211 C2 Таблиця 2 Вплив штамів Rhizobium phaseoli на формування бульбочок на коренях спаржевої квасолі сорту Amazone (польові досліди, 2009-2011 pp., дерново-підзолистий ґрунт) Кількість бульбочок, од./рослину 2009 2010 2011 81,00 24,50 26,13 84,75 31,88 39,00 108,25 54,25 54,38 8,42 5,31 4,55 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B-7319 HIP05 Таблиця 3 Вплив інокуляції спаржевої квасолі штамами Rhizobium phaseoli на активність симбіотичної азотфіксації (польові досліди, 2009-2011 pp., дерново-підзолистий ґрунт) Активність азотфіксації, мкг N/рослину/год. 2009 2010 2011 24,07 4,49 2,89 Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B7319 HIP05 48,80 7,82 4,82 74,19 13,54 6,16 8,87 1,68 1,53 Таблиця 4 Вплив інокуляції R. phaseoli на урожайність лопаток спаржевої квасолі (польові досліди, Чернігів, 2009-2011 pp.) Варіанти досліду Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Rhizobium phaseoli 700 Новий штам Rhizobium phaseoli B7319 HIP05 2009 7,23 Урожайність лопаток, т/га 2010 2011 Середнє 3,88 9,30 6,80 Приріст урожаю, % 100,0 7,68 4,73 10,47 7,63 112,1 9,92 6,27 12,92 9,70 142,6 0,34 0,23 0,41 Таблиця 5 Вплив інокуляції на ураженість спаржевої квасолі сорту Amazone кореневими гнилями (польовий дослід, 2008 р. дерново-підзолистий ґрунт) Варіанти досліду Стеблування 1 2 3 73,3 25,0 Контроль (без інокуляції) Штам-прототип Rhizobium 73,3 phaseoli 700 Новий штам Rhizobium 46,7 phaseoli B-7319 HIP05 23,1 1 100,0 Цвітіння 2 48,3 3 Налив бобів 1 2 3 100,0 46,7 25,0 0,0 100,0 43,3 10,3 100,0 42,5 8,9 15,8 36,7 86,7 31,7 34,5 100,0 34,2 26,8 6,7 Fф