Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Nocardia vaccinii ІМВ В-7405 на рідкому середовищі з технічним гліцерином в концентрації, що становить 3,9−4,1 %. Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин, які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти і нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. UA 105975 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента і наявність у його складі факторів росту. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є штам Rhodococcus erythropolis EK-1 - продуцент поверхнево-активних речовин [Пат. 77345 UA, МПК С 21 N 1/20. Штам Rhodococcus erythropolis EK-1 - продуцент поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Волошина І.М., Ігнатенко С.В. Опубл. 15.11.2006, Бюл. № 11]. В основу винаходу поставлено задачу одержання поверхнево-активних речовин з використанням невідомого раніше штаму бактерій Nocardia vaccinii K-8, який відрізняється від вище згаданих тим, що здатний рости на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей (менше 2 г/л) з використанням як ростового субстрату технічного гліцерину (продукт виробництва біодизелю) у концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка) і синтезувати позаклітинні поверхнево-активні речовини (умовна концентрація ПАР 7,3). Штам N. vaccinii K-8 виділено із забруднених нафтою зразків ґрунту. Штам депоновано в Депозитарії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАН України ім. Д.К. Заболотного за номером IMB В-7405. Штам N. vaccinii IMB В-7405 характеризується такими морфолого-культуральними і фізіолого-біохімічними ознаками. Клітини фарбуються за Грамом позитивно, нерухливі. На 24 год. росту на м'ясо-пептонному агарі (МПА) клітини мають вигляд паличок завдовжки 2-6 мкм, є окремі зігнуті палички та ланцюжки з 4-5 паличок однакової довжини. На 24 год. росту на глюкозо-картопляному агарі (ГКА) клітини паличкоподібні (2-6 мкм), рідко зустрічаються окремі поодинокі коки та дуже рідко - ланцюжки з трьох коків. На 48 год. росту на МПА - в основному палички завдовжки 2-6 мкм, є зігнуті, зустрічаються довгі рівні палички (до 10-15 мкм). Кокових форм немає. На 48 год. росту на ГКА - палички (2-6 мкм), розміщені поодиноко і попарно. Палички в основному рівні, є окремі ледь зігнуті. Багато поодиноких коків, дуже рідко зустрічаються ланцюжки з 4-7 коків. На 72 год. росту на МПА клітини мають вигляд паличок (2-6 мкм), розміщених в основному поодиноко та рідко - попарно. Довгих та зігнутих паличок немає. Рідко зустрічаються моно- та диплококи. На 72 год. росту на ГКА клітини мають вигляд поодиноких паличок завдовжки 2-6 мкм, рідко ланцюжки з трьох паличок. Зустрічаються поодинокі коки. У процесі вирощування на МПА і ГКА на 72 год. штам N. vaccinii K-8 утворює складчасті зморшкуваті колонії (3-5 мм) кремово-білого кольору. Під час культивування N. vaccinii IMB В-7405 у рідкому мінеральному поживному середовищі з гідрофільними субстратами (етанол, глюкоза) утворюється здебільшого гомогенна суспензія, у деяких випадках формуються окремі агрегати клітин, забарвлення культуральної рідини від мутно-білого до мутно-коричневого з рожевим відтінком залежно від умов культивування. У процесі вирощування на рідких мінеральних середовищах з гідрофобними субстратами (гексадекан, рідкі парафіни) спостерігається здебільшого агрегація клітин. Як джерело вуглецю і енергії використовує гліцерин, глюкозу, етанол, гексадекан, рідкі парафіни. Як джерело азотного живлення використовує мінеральний (нітратний, гірше амонійний) та органічний (сечовина) азот. Не потребує факторів росту, проте рівень біомаси і синтезованих поверхнево-активних речовин підвищується за присутності у середовищі дріжджового автолізату. Аероб. Температурний діапазон росту 10-42 °C. Оптимальна температура 24-30 °C. рН 5,58,0. Оптимум рН 6,5-7,5. Умови і середовище для довготривалого зберігання штаму. Штам зберігають при температурі +4 °C на м'ясо-пептонному або глюкозо-картопляному агарі. Пересіви здійснюють через три місяці. Склад середовища для культивування штаму (г/л). NaNO3-1,0; КН2РО4-0,1; MgSO4 × 7H2O0,1; СаСl2 × 2Н2О - 0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001; рН 6,8-7,0. Джерело вуглецю - технічний гліцерин (гліцеринова фракція) у концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка). 1 UA 105975 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Умови культивування штаму для біосинтезу ПАР. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного складу, що містить 0,5 % (об'ємна частка) технічного гліцерину як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв), коефіцієнт масопереносу 0,14 г О2 / л год., температура 28-30 °C, тривалість культивування 168 год. Приклад 1. Синтез поверхнево-активних речовин за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на очищеному і технічному гліцерині N. vaccinii IMB В-7405 вирощують на середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,0; КН2РО4-0,1; MgSO4 × 7H2O-0,1; СаСl2 × 2Н2О - 0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001; рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують очищений гліцерин (1 %, об'ємна частка) і технічний гліцерин (2 %, об'ємна частка). Технічний гліцерин одержано від підприємства-виробника біодизелю (Запорізький біопаливний завод). Очищений і технічний гліцерин еквімолярні за вуглецем. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного складу, що містить 0,5 % (об'ємна частка) очищеного або технічного гліцерину як джерела вуглецю та енергії. Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування здійснюють на качалці (320 об/хв) при 28-30 °C упродовж 168 год. Поверхневий натяг (s) визначають за допомогою напівавтоматичного тензіометра TD1C LAUDA (Німеччина). Для оцінки кількісного вмісту ПАР у культуральній рідині використовують показник "умовної концентрації ПАР" (ПАР*). Цей показник визначають як ступінь розведення культуральної рідини в точці різкого збільшення поверхневого натягу на графіку залежності s від логарифму показника розведення. Абсциса точки перетину дотичних до гілок кривої відповідає значенню умовної концентрації ПАР. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Якісний аналіз поверхнево-активних ліпідів здійснюють методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на пластинках DC-Alufolien Kieselgel 60 ("Merck", Германія) в 4 системах розчинників: полярна система І: хлороформ-метанол-вода (85:15:1); полярна система II: хлороформ-метанол-вода (65:15:2); неполярна система III: гексан-діетиловий ефір (2:1); неполярна система IV: гексан-діетиловий ефір-оцтова кислота (90:10:1). Для ідентифікації ліпідних фракцій використовують специфічні реагенти: пластинки зафарбовують спиртовим розчином фосфомолібденової кислоти і парами йоду (нейтральні ліпіди), розчином нінгідрину (аміноліпіди), анісовим альдегідом і антроновим реактивом (гліколіпіди). Екстракцію поверхнево-активних ліпідів модифікованою сумішшю Фолча здійснюють так. Культуральну рідину, отриману після культивування N. vaccinii IMB В-7405, центрифугують при 5000 g упродовж 20 хв для відділення біомаси. 25 мл супернатанту поміщають в циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1М НСl, лійку закривають пришліфованою пробкою і струшують 3 хв, потім додають ще 4 мл 1М НСl і 16 мл суміші хлороформу і метанолу (2:1) і струшують (з метою екстракції ліпідів) упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу піддають повторній екстракції. При повторній екстракції до водної фази додають 9 мл 1М НСl і 16 мл суміші хлороформу і метанолу (2:1) і здійснюють екстракцію ліпідів упродовж 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію і отримують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу і метанолу (2:1) і здійснюють екстракцію, як описано вище, отримуючи органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторній випарній установці ИР-1М2 (Росія) при температурі 50 °C і абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Показники синтезу ПАР наведено у табл. 1. 2 UA 105975 C2 Таблиця 1 Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на середовищі з різними видами гліцерину Гліцерин Очищений Технічний (відхід виробництва біодизелю) 5 10 15 ПАР* 2,5±0,13 7,1±0,35 Е24, % 60±3 70±4 Встановлено, що за хімічним складом позаклітинні поверхнево-активні речовини штаму К-8 є комплексом нейтральних, аміно- та гліколіпідів. Нейтральні ліпіди представлені міколовими і n-алкановими кислотами, гліколіпіди - трегалозодіацелатами і трегалозоміколатами. Отже, за умов росту штаму IMB В-7405 на технічному гліцерині показники синтезу поверхнево-активних речовин є вищими, ніж на очищеному субстраті. Здатність бактерій роду Nocardia до синтезу позаклітинних трегалозоміколатів встановлено нами вперше. Приклад 2. Вплив різних концентрацій технічного гліцерину на синтез ПАР N. vaccinii IMB В7405 Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють як описано у прикладі 1. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин у концентрації 2-6 % (об'ємна частка). Тривалість культивування 168 і 240 год. Концентрацію синтезованих позаклітинних ПАР визначають ваговим методом після екстракції модифікованою сумішшю Фолча як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР наведено у табл. 2. Таблиця 2 Залежність синтезу ПАР від концентрації технічного гліцерину Концентрація технічного гліцерину, Тривалість культивування, год. % 2 168 3 168 3,5 168 168 3,7 240 168 3,9 240 168 4,1 240 168 43 240 4,5 168 5 168 6 168 20 25 30 ПАР, г/л 3,40±0,17 3,60±0,18 3,65±0,18 3,85±0,19 4,00±0,20 4,78±0,23 4,85±0,25 4,90±0,25 4,90±0,25 4,20±0,21 4,20±0,21 4,10±0,21 3,00±0,15 2,96±0,14 Отже, найвищі показники синтезу ПАР за умов росту штаму IMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином спостерігаються за концентрації субстрату 3,9-4,1 % (об'ємна частка). Підвищення тривалості культивування до 240 год. не супроводжується збільшенням концентрації синтезованих ПАР. Приклад 3. Порівняння здатності штамів N. vaccinii IMB В-7405 і R. erythropolis IMB Ас-5017 до синтезу ПАР N. vaccinii IMB B-7405 культивують упродовж 168 год. в умовах, описаних у прикладі 2. Концентрація технічного гліцерину у середовищі 4 % (об'ємна частка). R. erythropolis IMB Ас5017 вирощують упродовж 168 год. на середовищі такого складу (г/л): NaNO3-1,3; NaCl-1,0; Na2HPO4-0,6; КН2РО4-0,14; MgSO4 × 7H2O-0,1; FeSO4 × 7H2O-0,001. Як джерело вуглецю і енергії використовують гексадекан у концентрації 2 % (об'ємна частка). У табл. 3 наведено основні показники синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 та R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип). 3 UA 105975 C2 Таблиця 3 Основні показники синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 і R. erythropolis IMB Ас-5017 Продуцент Концентрація Вміст солей у позаклітинних ПАР середовищі, г/л (г/л) ПАР* N. vaccinii IMB В-7405 4,90 7,3 R. erythropolis IMB Ас-5017 (прототип) 5 1,3 3,1 3,90 6,0 Хімічний склад ліпідів Гліколіпіди, нейтральні ліпіди, аміноліпіди Гліколіпіди, нейтральні ліпіди, фосфоліпіди Отже, порівняно з прототипом штам N. vaccinii ІMB В-7405 має такі переваги: синтезує поверхнево-активні речовини на простому мінеральному середовищі з низьким вмістом солей 1,3 г/л; синтезує ПАР на відходах виробництва біодизелю; вищі показники синтезу (як умовна концентрація ПАР, так і концентрація позаклітинних поверхнево-активних речовин). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування Nocardia vaccinii ІМВ В-7405 на рідкому середовищі з гліцерином, який відрізняється тим, що як гліцерин використовують технічний гліцерин в концентрації, що становить 3,9-4,1 %. Комп’ютерна верстка М. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4