Спосіб відновлення сполучення конститутивних no-синтаз при артеріальній гіпертензії

Реферат: Спосіб відновлення сполучення конститутивних NO-синтаз при артеріальній гіпертензії, що базується на введенні хімічної сполуки. Ендотеліальний моноцитактивуючий фактор II (ЕМАР II) вводять одноразово внутрішньовенно у концентрації 2.8 мкг/кг. UA 106072 U (12) UA 106072 U UA 106072 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини і кардіології, і може бути використана для лікування і профілактики артеріальної гіпертензії. Артеріальна гіпертензія є основним фактором ризику для серцево-судинних захворювань, в тому числі інсульту, ішемічної хвороби серця та серцевої недостатності, що призводить до ~1,8 мільйона випадків смерті, щорічно в світі. Останніми роками з'явилося достатньо фактів, що свідчать про центральну роль у розвитку артеріальної гіпертензії як оксидативного, так і нітрозативного стресу. Одним із механізмів розвитку порушень редокс-статусу клітин серця і судинної стінки, що зумовлюють дисфункцію цих органів за гіпертензії є індукція роз'єднаного стану конститутивних NO-синтаз (eNOS і/чи nNOS), яка супроводжується зниженням конститутивного синтезу оксиду азоту (NO) і зростанням утворення супероксид - аніону (*O2 ) і їх токсичних похідних - пероксинітриту (ONOO ) та гідроксильного аніон-радикалу (*ОН). В умовах окисного стресу відбувається глутатіонування SH-груп цистеїну в молекулі ендотеліальної NOS (eNOS) окисненим в цих умовах глутатіоном, що і спричиняє її несполучення. Дані останніх досліджень свідчать, що несполучення eNOS може бути також результатом впливу активованих при запаленні моноцитів. Наші дослідження показали що несполучення eNOS в серці і аорті корелює з погіршенням фізіологічних показників кардіогемодинаміки, які вказують на кардіальну і ендотеліальну дисфункцію у щурів зі спонтанною гіпертензією [1]. Тобто, для нормалізації функціональних показників у серцево-судинній системі за гіпертензії потрібний якийсь зовнішній чинник, здатний відмінити несполучений стан eNOS. Тому фармакологічні підходи, які запобігають eNOS роз'єднанню мають значний терапевтичний інтерес. Для відновлення сполученого стану eNOS, тобто відновлення конститутивного de novo синтезу NO, використовували деякі речовини, такі як ресвератрол, ВН4, сепіаптерін [2], але завжди досягалося лише короткочасне відновлення сполучення eNOS. Як прототип виступає використання хімічної сполуки ресвератролу, який призначається для відновлення сполученого стану NOS, здатний зменшувати показники оксидативного і нітрозативного стресу при гіпертензії [2,3]. Ресвератрол - це поліфенол (транс-3', 4', 5тригідроксистілбен), є важливим компонентом червоного вина. Позитивна дія ресвератролу в серцево-судинній системі пов'язана з інгібуванням агрегації тромбоцитів, зниженням формування атеросклеротичних бляшок. Ресвератрол значно покращує NO залежні судинні реакції і збільшує ендотелій залежне розширення судин [3]. Ресвератрол також збільшує експресію eNOS в дослідженнях на клітинних культурах, але ці результати не були підтверджені в дослідженнях у спонтанно гіпертензивних щурів. Даний спосіб використання хімічної сполуки для відновлення сполученого стану NOS є найбільш близьким до запропонованої корисної моделі. Недоліком даного способу є довготривала терапія per os впродовж 10 тижнів в концентрації 5 мг/кг, лише короткочасне відновлення сполучення eNOS, а також відсутність позитивної дії хронічного лікування ресвератролом на зниження артеріального тиску[4]. Задачею корисної моделі, що заявляється, є розробка способу відновлення сполучення конститутивних ізоформ NO-синтаз шляхом застосування ендотеліального моноцит активуючого фактора II (ЕМАР II). Технічним результатом корисної моделі є покращення функціонального стану серця і судин, запобігання ускладнень, профілактика і лікування артеріальної гіпертензії. Запропонований спосіб дозволяє унаслідок відновленню сполученого стану cNOS нормалізувати порушений за гіпертензії конститутивний de novo синтез оксиду азоту (NO) в серці й аорті щурів зі спонтанною гіпертензією. Даний спосіб включає також і позитивний вплив на функцію мітохондрій шляхом запобігання відкривання мітохондріальних пор. Такий підхід, що до відновлення сполученого стану конститутивних ізоформ NO-синтаз (cNOS) використовується вперше і дозволяє отримати позитивний вплив на функціональний стан серця. В способі, що заявляється, ендотеліальний моноцитактивуючий фактор II (ЕМАР II) вводять одноразово внутрішньовенно через 30 хв тварин декапітували, відбирали серце та аорту і на холоді готували їх гомогенати для визначення біохімічних показників. Приклад. Дослідження проводили на 6-місячних щурах-самцях лінії Вістар та зі спонтанною гіпертензією. Всі експериментальні процедури виконано, згідно з Європейською Директивою Ради Громад від 24 листопада 1986р. (86/609/ЕЕС). Щурів наркотизували за допомогою уретану (1,25 г/кг, внутрішньоочеревинно). ЕМАР II вводили одноразово (внутрішньовенно по 10 мкл розчину, що містив 0,85 мкг цього фактора в 0,5 мл 0,9 %-го NaCl). Застосовували стабілізований 1,5 %-м декстраном-70 ліофілізований рекомбінантний білок ЕМАР II людини (169 амінокислотних залишків, молекулярна маса 18535 Да), отриманий у відділі білкової 1 UA 106072 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 інженерії та біоінформатики Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (керівник член-кор. НАН України А. І. Корнелюк) методом бактеріальної експресії [5]. Після введення ЕМАР II через 30 хв тварин декапітували, відбирали серце та аорту і на холоді готували їх гомогенати для визначення біохімічних показників. У цільних свіжоприготовлених гомогенатах серця й аорти щурів визначали біохімічні показники, які тестують наявність комбінованого окисного стресу та (надлишкового синтезу *O 2 , NO і пероксинітриту) нітрозативного стресу 2+ Са -залежну активність cNOS, як суму ендотеліальної (eNOS) і нейрональної (nNOS) NOS, 2+ Са -незалежну активність індуцибельної NOS (iNOS), НАДН-залежну активність нітратредуктази, пули стабільних метаболітів NO - нітрит (NO2 )- і нітрат (NO3 ) -аніонів. Подалі розраховували Індекс сполучення cNOS і Біохімічний індекс функції. Умовне значення індексу сполучення (coupling) cNOS розраховували як відношення активності cNOS до швидкості генерації *O2 за наявності її інгібітора L-NAME. Цей індекс характеризує наявність субстратів (L-аргінін, О2) і кофактора тетрагідробіоптерину (ВН4) для утворення NO, а не *O2 при окисному метаболізмі L-аргініну. Вважається, що будь-яке підвищення генерації *O2 (мітохондріями, ксантиноксидазою чи НАДФН-оксидазою) спричиняє несполучення (uncoupling) eNOS. Більше того, роз'єднана eNOS не лише сама стає потужним генератором *O2 , але одночасно активує інші згадані джерела його утворення, тим самим утворюючи свого роду замкнуте коло взаємопідсилення окисного стресу і сполучення eNOS. Розраховували також умовний біохімічний індекс функції (БІФ) в серці і аорті за формулою: БІФ=[вміст нітриту/(вміст нітрату+вміст нітриту)]*індекс сполучення cNOS. Перший компонент формули відображає частку нітрит-аніону в сумі нітрит+нітрат і, таким чином, відображає рівень оксигенації в органах серцево-судинної системи. Відомо, що NO2 спонтанно утворюється при окисненні NO лише в оксигенованих розчинах, в той час як NO 3 лише в умовах інтегрального окисного стресу при нерадикальному розпаді пероксинітриту. Другий компонент формули відображає рівень сполучення cNOS, який зростає в умовах стресу. Отже, БІФ відображає як ступінь оксидативного і нітрозативного стресу, так і рівень синтезованих cNOS пулів NO, важливих для нормального функціонування серця й аорти. Корисна модель пояснюється за допомогою наступних фігур. Фіг. 1 Відносні значення індексу сполучення cNOS (IС) в серці (1) й аорті (2) контрольних і зі спонтанною гіпертензією щурів за короткочасної дії ЕМАР II.*Р