Спосіб вимірювання морфометричних показників інтактних ядерних еритроцитів риб

Реферат: Винахід належить до способу вимірювання морфометричних показників інтактних ядерних еритроцитів риб, який передбачає отримання для фотозйомки двох варіантів зображень забарвлених вітальним барвником ядер еритроцитів риб: на освітленому і затемненому полях мікроскопа, які обробляють в редакторі растрової графіки (наприклад Adobe Photoshop) шляхом накладення, й вимірюють лінійні параметри клітин з використанням програми Image J. UA 109805 C2 (12) UA 109805 C2 UA 109805 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біології, а точніше до морфометрії клітин, і може бути використаний для виміру лінійних розмірних показників ядерних еритроцитів риб. Швидкість і точність реакції крові на зміни внутрішнього і зовнішнього середовища створили визначення її показників придатним для оцінки фізіологічного стану організмів. Дослідження морфометрії ядерних еритроцитів надзвичайно актуально для вивчення біології нижчих хребетних. Відомі два основних методичних підходи до визначення морфометричних показників ядерних еритроцитів: вимір за допомогою окуляр-мікрометра на мікроскопі і аналіз цифрових фотографій еритроцитів у комп'ютерних програмах. Обидва методи засновані на вивченні морфометричних показників фіксованих клітин. Вимірювання лінійних розмірів клітин за допомогою окуляр-мікрометра мікроскопа застарілий метод (1979 p.), який, проте, як і раніше широко застосовується для оцінки стану клітин [3, 4]. Вимірюванню морфометричних показників еритроцитів передує підготування мазків крові, фіксація клітин та їх фарбування за різними методиками [1]. Оцінка морфометричних показників проводиться із застосуванням імерсійної системи мікроскопа. Відомий спосіб не позбавлений деяких суттєвих недоліків: вимірам на мікроскопі притаманна певна апаратна похибка, метод вимагає значних витрат часу, дослідження мікроскопічних об'єктів на окулярмікрометрі носить суб'єктивний характер, морфометричні показники оцінюються по фіксованих еритроцитах. Найбільш близьким за технічною суттю і досягнутому технічному результату є дослідження морфометричних показників ядерних еритроцитів по цифрових фотографіях мазків крові. Застосування цифрової мікрофотографії дозволило в значній мірі спростити процес вивчення морфометрії еритроцитів. Зйомку фіксованих мазків крові проводять на мікроскопі, який обладнаний камерою, і подальша оцінка лінійних параметрів клітин йде за цифровими зображеннями [2]. На даний момент існує безліч спеціалізованих програм для автоматизованого і ручного вимірювання кількісних показників клітин. Головний недолік методу пов'язаний з вимірюванням показників на фіксованому матеріалі, обробленому хімічними реактивами, що впливають, часто, на стан клітин та їх морфометрію. Вимірювання, що проводяться на мазках крові, виключають можливість прижиттєвої оцінки стану еритроцитів. В основу винаходу Спосіб вимірювання морфометричних показників інтактних ядерних еритроцитів риб поставлена задача збільшення об'єктивності дослідження шляхом прижиттєвого вимірювання морфометричних показників ядерних еритроцитів риб. Поставлена задача вирішується тим, що для забарвлених перед фотозйомкою вітальним барвником ядер еритроцитів риб отримують два варіанти зображень: на освітленому і затемненому полях мікроскопа, які обробляють в редакторі растрової графіки (наприклад Adobe Photoshop) шляхом накладення, й вимірюють лінійні параметри клітин з використанням програми Image J. Як вітальний барвник ядер еритроцитів риб застосовують барвник SYBR Green І, який здатний зв'язуватися з дволанцюгової ДНК і викликати її флуоресценцію у видимій частині спектру, притому, що в ході фарбування клітини залишаються інтактними. Таким чином, ядра стають візуально розпізнаваними від решти вмісту клітини. Заявлений спосіб має ряд переваг: - вимірювання морфометричних показників проводиться на живих еритроцитах, виключаючи вплив додаткових факторів на клітини; - для візуалізації ядер використовується сучасний маркер ДНК - SYBR Green І, який не впливає на функціональну активність клітин; - застосування комп'ютерних програм дозволяє зменшити похибку вимірювань і прискорити обробку результатів, в порівнянні з візуальним методом за допомогою окуляр-мікрометра на мікроскопі. Винахід пояснюється ілюстраціями. Фіг. 1. - Мікрофотографії ядерних еритроцитів Scorpaena porcus L. - Освітлене поле мікроскопа (А), затемнене поле мікроскопа (Б), поєднаний знімок (В); Фіг. 2. - Накладення знімків еритроцитів в редакторі Adobe Photoshop; Фіг. 3 - установка необхідного рівня прозорості верхнього знімка клітин в редакторі Adobe Photoshop. Спосіб реалізується наступним чином. 1. Отримання ядерних еритроцитів риб здійснюється за стандартними методами, які передбачені для цих цілей. 2. Фарбування SYBR Green I (Molecular Probes, США). 3. Мікрофотозйомка еритроцитів в товстій краплі. Фотографування еритроцитів ведеться цифровою камерою в кольоровому режимі. Зйомку проводять після осідання клітин на поверхню предметного скла. Необхідно отримати два варіанти зображень: на освітленому і 1 UA 109805 C2 5 10 15 20 25 30 затемненому полях мікроскопа: в першому випадку помітні границі еритроцитів, а в другому пофарбовані ядра. 4. Редагування мікрофотографій еритроцитів в графічному редакторі. Для обробки зображень клітин застосовується редактор растрової графіки, що дозволяє накладати зображення одне на одного. Для цих цілей може бути використаний Adobe Photoshop, або будьяка інша програма, призначена для роботи з графічними об'єктами. Освітлену і затінену фотографії поєднують в графічному редакторі шляхом накладення світлого знімка на темний і установкою прозорості верхнього шару (зображення) на рівні 2040 %. В результаті на знімках помітні клітини з пофарбованими ядрами, що дозволяє проводити будь-які вимірювання еритроцитів риб. 4. Оцінка морфометричних характеристик клітин на цифрових фотографіях. Вимірювання розмірів клітин, а також, якщо це необхідно, їх підрахунок ведеться в ручному і автоматичному режимі в програмах аналізу зображень. Такі комп'ютерні програми, наприклад, ImageJ 1.44p, дозволяють відкалібрувати вимірювання, зводячи дані в таблицю для подальших розрахунків. Приклад Дослідження морфометрії ядерних еритроцитів Scorpaena porcus L. Еритроцити одержували і обробляли SYBR Green І, протягом 20 хвилин. Сумарне розведення флюорохромами склало 10000 разів. В результаті ядра клітин, пофарбовані SYBR Green І, флуоресціровали яскраво-зеленим кольором при їх візуалізації в люмінесцентному режимі. Мікрофотозйомку проводили на лабораторному інвертованому мікроскопі Nikon Eclipse TS100, який обладнаний камерою Ikegami ICD-848P, у світловому (світле і темне поле) і люмінесцентному режимах (набір світлофільтрів для збудження у синій області спектру для SYBR Green І). Відповідно, для кожної клітини було отримано два зображення (границі клітин - в світловому режимі; ядро - в люмінесцентному режимі). Поєднання фотографій проводили в графічному редакторі Adobe ® Photoshop ® CS3 EXTENDED version 10.0. Вимірювання морфометричних показників ядерних еритроцитів проводили в програмі ImageJ 1.44р. Враховували наступні лінійні характеристики еритроцитів: довжина великої і малої осі клітини (С1 і С2 відповідно), довжина великої і малої осі ядра (N1 і N2 відповідно). Кількість вимірювань становила 100 клітин на пробу. Значення довжин С1, С2, N1, N2 були усереднені. Усереднені величини були співставленні з даними з літератури [5], отриманими шляхом вимірювання вищевказаних показників на мазках крові за допомогою окуляр-мікрометра (табл.). Таблиця Морфометричні показники ядерних еритроцитів S. porcus. L. Дані В.М. Новіцкої, І.О. Парфьонової [5] Показники n С1, мкм 800 С2, мкм 800 N1, мкм 800 N2, мкм 800 Приміток: * - вірогідно при р≤0,02 x  Sx Дані, одержані згідно з винаходом x  Sx n 13,99±0,15 8,64±0,20 5,31±0,13 3,73±0,13 100 100 100 100 15,00±0,14* 9,68±0,09* 6,37±0,07* 4,08±0,06* 35 40 45 В ході порівняння результатів були виявлені достовірні статистичні відмінності в показниках, однак, розбіжність даних становить не більше 2 %. Літературні джерела, прийняті до уваги: 1. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник. Под ред. В.В. Меньшикова, Москва: "Медицина". - 1987. - 368 с. 2. Е. Gering and С.Т. Atkinson (2004) A Rapid Method for Counting Nucleated Erythrocytes on Stained Blood Smears by Digital Image Analysis // Journal of Parasitology. - 2004. - 90, № 4. - P. 879881. 3. С.A. Normann, J.C. Moreira and V.V. Cardoso. Micronuclei in red blood cells of armored catfish Hypostomus plecotomus exposed to potassium dichromate // African Journal of Biotechnology. 2008. - 3, № 7. - P. 893-896. 2 UA 109805 C2 5 4. A.A. Oliveira-Junior M. Tavares-Dias, J.L. Marcon. Biochemical and hematological reference ranges for Amazon freshwater turtle, Podocnemis expansa (Reptilia: Pelomedusidae), with morphologic assessment of blood cells // Research in Veterinary Science. - 2009. - 86. - P. 146-151. 5. Новицкая В.Н., Парфенова И.А… Гематологические и морфометрические характеристики зрелых эритроцитов S. porcus в условиях экспериментальной гипоксии // Водные биоресурсы и аквакультура: тезисы докладов, Киев, 2010. - Киев: ДИА. - С. 290-292. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 10 15 Спосіб вимірювання морфометричних показників інтактних ядерних еритроцитів риб, що включає мікрофотозйомку досліджуваних еритроцитів на мікроскопі, обладнаному цифровою камерою, і оцінку лінійних параметрів клітин по цифрових зображеннях, який відрізняється тим, що для забарвлених перед фотозйомкою вітальним барвником ядер еритроцитів риб отримують два варіанти зображень: на освітленому і затемненому полях мікроскопа, які обробляють в редакторі растрової графіки (наприклад Adobe Photoshop) шляхом накладення, й вимірюють лінійні параметри клітин з використанням програми Image J. 3 UA 109805 C2 Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4