Спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною та протизапальною дією з трави гравілату міського

Реферат: Винахід належить до cпособу одержання суми поліфенолів шляхом екстракції рослинної сировини з подальшим упарюванням, фільтрацією та сушінням об'єднаного екстракту. Екстракції піддають траву гравілату міського (Geum urbanum), як екстрагент використовують гарячу воду температурою 95 °C при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10. Проводять екстракцію протягом 2-х годин, після чого сировину додатково промивають екстрагентом у кількості до 40 % від заданого співвідношення, а зливи об'єднують з сумарним екстрактом. UA 110664 C2 (12) UA 110664 C2 UA 110664 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до хіміко-фармацевтичної промисловості, зокрема до способів отримання біологічно активних речовин з рослинної сировини. У сучасній медичній практиці широко використовуються біологічно активні засоби природного походження. Лікарські препарати на основі рослинної сировини виглядають дуже привабливими завдяки низці позитивних властивостей: максимальній спорідненості до організму людини, більшою безпечністю відносно побічної дії, незначною алергійністю і токсичністю, можливістю тривалого використання без формування звикання. Біологічна активність рослинної сировини значною мірою обумовлена кількісним та якісним вмістом поліфенольних сполук. Відомий спосіб одержання комплексу поліфенольних сполук з протизапальною, кардіопротекторною та антиоксидантною дією [1]. Спосіб полягає в екстракції трави чини весняної 50 % спиртом етиловим при співвідношенні сировина: екстрагент 1:7 протягом 47 годин з наступним упарюванням одержаного екстракту до 1/7-1/8 попереднього об'єму, обробкою упареного екстракту спиртом етиловим, відокремленням надосадової рідини, її упарюванням і сушінням. Недоліком наведеного способу можна вважати його відносно високу тривалість. Відомий також спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю [2] шляхом екстракції 70% спиртом етиловим суплідь душекії зеленої (Duschekia viridis) протягом ΠΙ 5 годин при співвідношенні сировина:екстрагент 1:9-1:11 з подальшим упарюванням до водного залишку, фільтрацією, обробкою етилацетатом у співвідношенні сумарний екстракт:етилацетат 1:2. Недоліком наведеного способу можна вважати використання токсичного екстрагенту етилацетату. Найближчим до заявленого є спосіб одержання поліфенольного комплексу «Флавітін» з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною активністю [3] шляхом екстракції 50% спиртом етиловим листя винограду, краще сорту Дабуги, при співвідношенні сировина:екстрагент 1:10 з подальшим упарюванням до водного залишку, фільтрацією, ресорбцією фенольних сполук з осаду водою, об'єднанням фільтрату з одержаним водним розчином, упарюванням і сушінням. Наведений спосіб дозволяє одержати поліфенольний комплекс з широким спектром фармакологічної дії, проте використана рослинна сировина не є загальнодоступною, ареал її розповсюдження обмежений субтропічною зоною і екстрагент спирт етиловий є дорогим. Задачею винаходу є створення способу одержання суми поліфенолів з рослинної сировини, який шляхом екстракції гарячою водою трави гравілату міського Geum urbanum при заданих параметрах способу забезпечує одержання екстракту з вираженою антимікробною та протизапальною активністю. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання суми поліфенолів з антимікробною та протизапальною дією шляхом принаймні трикратної екстракції рослинної сировини гарячою водою (t 95°C) з подальшим упарюванням, фільтрацією та сушінням об'єднаного екстракту. Винаходом передбачено, що екстракції піддають траву гравілату міського Geum urbanum при додатковому співвідношенні сировини до екстрагенту 1:10 протягом 2 години, після чого сировину додатково промивають екстрагентом у кількості до 40 % від заданого співвідношення, а зливи об'єднують з сумарним екстрактом. Як сировину вибрано траву гравілату міського Geum urbanum родини розові, який широко розповсюджений на всій території України. Саме вибір рослинної сировини у поєднанні з параметрами заявленого способу обумовлює одержання кінцевого продукту з необхідним спектром фармакологічних властивостей, дозволяє розширити арсенал існуючих біологічно активних речовин, придатних до одержання лікарських засобів у різних лікарських формах, надаючи тим самим можливість індивідуального підходу до лікування хворих. У народній медицині існують окремі відомості про помірну в'яжучу та заспокійливу дію відварів трави гравілату міського [5]. Авторами вперше було виявлено антимікробну та протизапальну активність суми поліфенолів трави гравілату міського - Geum urbanum, одержаних заявленим способом. Вибір як екстрагент води гарячої було здійснено експериментальним шляхом, виходячи з умов максимальної екстракції поліфенольних сполук з вибраної сировини. У процесі досліджень були визначені температура екстрагенту, також співвідношення сировини до екстрагенту і час екстракції. Дані експериментів наведено у таблицях 1 -3. 1 UA 110664 C2 Таблиця 1 Визначення оптимальної температури екстрагенту при екстракції трави гравілату міського у відповідності з заявленим способом № досліду 1 2 3 4 5 Температура екстрагенту,°С Вихід готового продукту, % Вихід діючих речовин,% 80 17,9 37,15 90 19,2 38,35 95 20,1 40,62 97 20,0 40,52 100 20,0 40,52 Згідно з даними табл. 1 оптимальним екстрагентом для заявленого способу є гаряча вода при температурі 95 °С. 5 Таблиця 2 Визначення оптимального співвідношення сировина:екстрагент при екстракції трави гравілату міського гарячою водою (t 95 °C) у відповідності з заявленим способом № досліду 1 2 3 4 5 10 Співвідношення сировина: екстрагент 1:5 1:9 1:10 1:11 1:12 Вихід готового продукту, Вихід діючих речовин, % % 18,6 38,35 19,1 39,55 20,1 40,62 20,0 40,55 20,0 40,55 Згідно з даними експерименту, ефективним інтервалом співвідношення сировини до екстрагенту є 1:9 - 1:11. При зменшенні цього співвідношення зменшується як вихід готового продукту, так і вихід діючих речовин. Збільшення співвідношення недоцільне, тому що показники виходу практично не змінюються. Оптимальним є співвідношення сировини до екстрагенту 1:10. Таблиця 3 Визначення оптимального часу екстракції трави гравілату міського гарячою водою (t 95 °С) в співвідношенні сировина:екстрагент 1:10 № досліду 1 2 3 4 5 15 20 Час екстракції, години 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0 Вихід готового продукту, % 18,0 18,2 20,1 20,0 20,0 Вихід діючих речовин, % 37,25 39,25 40,62 40,62 40,62 Аналіз даних табл. 3 свідчить, що ефективним інтервалом часу екстракції є 1-3 годин. Зменшення цього часу не дозволяє вичерпно екстрагувати поліфенольні сполуки з сировини. Збільшення - не забезпечує зростання показників виходу готового продукту і діючих речовин, та є економічно недоцільним. Оптимальний час екстракції - 2 години. Експериментальним шляхом визначено, що додаткове промивання сировини (після екстракції та зливу одержаного екстракту) екстрагентом у кількості 40 % від використаного при екстракції дозволяє збільшити відсоток екстрактивних речовин, які обумовлюють фармакологічну дію. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: траву гравілату міського подрібнюють до розміру частин 1,0-3,0 мм, принаймні трикратно екстрагують гарячою водою (t 95 °С) у співвідношенні сировина : екстрагент 1:9 - 1:11 протягом 1-3 години, сировину додатково 2 UA 110664 C2 5 10 15 20 25 промивають екстрагентом, об'єднують всі зливи з подальшим упарюванням одержаного екстракту до видалення екстрагенту, фільтрацією та сушінням. Вихід готового продукту 20,1 %. Одержаний продукт - негігроскопічний аморфний порошок світло-зеленого кольору зі специфічним характерним запахом, розчинний у воді, в 50% етанолі при нагріванні, слаборозчинний у хлороформі, етилацетаті та ефірі. Винахід пояснюється прикладами. Приклад 1 1,5 кг подрібнених (подрібненість 1,0-3,0 мм) трави гравілату міського - Geum urbanum екстрагували 10 л гарячої води з t 95 °C в типовому екстракторі ємністю 15 л з мішалкою та несправжнім дном протягом 2 годин при постійному помішуванні. Екстракт в об'ємі 5 л зливали, а сировину промивали 2 л гарячої води (t 95 °C). Екстрагування проводили за тими ж умовами тричі новими порціями екстрагенту, додаючи кожного разу 5 л гарячої води, зливаючи 5 л екстракту і промиваючи сировину 2 л гарячої води. Усі зливи об'єднували та упарювали. Об'єм кубового залишку становив 3 л. Для вилучення смолистих речовин, які випадають при упарюванні (випадає 60 г, що складає 4 % від ваги завантаженої сировини), сумарний екстракт фільтрували через нутч-фільтр. Очищений екстракт висушували у вакуумному апараті при температурі 35±5 °С і розрідженні 550±5 мм рт. ст. до сухого залишку. Отримали 301,5 г сухого цільового продукту, що у перерахунку на повітряно-суху сировину складає 20,1 %. Дослідження біологічної активності суми поліфенолів, отриманої запропонованим способом, були проведені in vitro та in vivo і довели, що одержані за заявленим способом поліфенольні сполуки мають виражену антимікробну та протизапальну дію. Приклад 2 Для вивчення антимікробної активності суми поліфенолів, одержаної заявленим способом, був використаний метод дифузії в агар. Для оцінювання активності застосовували рекомендовані ВООЗ штами мікроорганізмів: Staphylococcus aureus 25923 АТСС, Escherichia coli 25922 АТСС, Proteus vulgaris 4636 АТСС, Proteus aeruginosa 27853 АТСС та Candida albicans 885/653ATCC. Як препарат порівняння було вибрано "Новоіманін". Результати дослідження наведені в таблиці 4. 30 Таблиця 4 Вивчення антимікробної активності суми поліфенолів трави гравілату міського методом дифузії. Діаметр зон затримки мікроорганізмів в мм±мм Тест-культура мікроорганізмів S. aureus Е.соlі 25922 P.vulgaris P.aeruginosa C.albicans 25923 АТСС АТСС 4636 АТСС 27853 АТСС 885/653 АТСС Сума поліфенолів 20,9±1,5 19,2±1,2 18,7±0,6 16,1±0,5 17,3±0,6 Новоіманін 17,1±1,3 14,3±0,5 13,5±0,8 11,4±1,2 10,3±0,9 Аналіз даних таблиці 4 свідчить про виражену антимікробну дію суми поліфенолів, отриманих з трави гравілату міського заявленим способом, що перевищує дію препарату порівняння. Приклад З Протизапальну активність суми поліфенолів, одержаних заявленим способом, вивчали на моделі гострого запального набряку, викликаного субплантарним введенням у задню лапу щура 0,1 мл 1 % розчину карагеніну. Об'єм лапи вимірювали за допомогою онкометру до початку досліду та у момент максимального розвитку набряку (4 години). Суму поліфенолів у дозі 50 мг/кг та препарат порівняння ортофен у дозі 8 мг/кг вводили у шлунок тварин відповідних дослідних груп за 30 хвилин до введення флогогенного агента. Контрольна група тварин одержувала еквівалентну кількість води. Протизапальну активність [4] розраховували за формулою: Варіант досліду 35 40  45 Уk  Уo  100 , де Уk А - протизапальна активність, % Уk і Уo відповідно об'єм лапи у контролі та у досліді. Результати досліду представлені в табл. 5. 3 UA 110664 C2 Таблиця 5 Протизапальна активність суми поліфенолів у порівнянні з ортофеном (n=7) Показник / група Величина набряку, ум. одиниць Протизапальна активність, % Контроль Ортофен, 8 мг/кг Сума поліфенолів, 50 мг/кг 13,25 ±1,12 3,5 ±0,65* 6,15±0,25*/** 73,6 53,6 Примітка.* - вірогідність розходжень при ρ