Спосіб одержання поліфенольного комплексу з антимікробною, протизапальною та антиоксидантною дією

Спосіб одержання поліфенольного комплексу з антимікробною, протизапальною та антиоксидантною дією шляхом екстракції рослинної сировини 50 % спиртом етиловим з подальшим упарюванням, фільтрацією та сушінням, який відрізняється тим, що принаймні трикратній екстракції піддають кореневища гравілату міського Geum urbanum при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:(9 -11) протягом 13-15 годин, після чого сировину додатково промивають екстрагентом у кількості до 40 % від заданого співвідношення, а зливи об'єднують з сумарним екстрактом. (19) (21) a200908921 (22) 27.08.2009 (24) 25.11.2011 (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) КОЗИРА СОФІЯ АНДРІЇВНА, СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ, КУЛАГІНА МАРІЯ АНДРІЇВНА, РАДЬКО ОЛЕНА ВІКТОРІВНА, ВОРОНІНА ЛАРИСА МИКОЛАЇВНА, ОСОЛОДЧЕНКО ТЕТЯНА ПАВЛІВНА (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (56) RU C2 2174011, 27.09.2001 UA U 9940, 17.10.2005 UA A 59681, 15.09.2003 3 96621 гравілату міського Geum urbanum при заданих параметрах способу забезпечує одержання екстракту з вираженою антимікробною, протизапальною та антиоксидантною активністю. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання поліфенольного комплексу з антимікробною, протизапальною та антиоксидантною дією шляхом екстракції рослинної сировини 50 % спиртом етиловим з подальшим упарюванням, фільтрацією та сушінням винаходом передбачено, що принаймні трикратній екстракції піддають кореневища гравілату міського Geum urbanum при співвідношенні сировини до екстрагенту 1:(9-11) протягом 13-15 годин, після чого сировину додатково промивають екстрагентом у кількості до 40 % від заданого співвідношення, а зливи об'єднують з сумарним екстрактом. Як сировину вибрано кореневище гравілату міського Geum urbanum родини розові, який широко розповсюджений на всій території України. Саме вибір рослинної сировини у поєднанні з параметрами заявленого способу обумовлює одержання кінцевого продукту з необхідним спектром 4 фармакологічних властивостей, дозволяє розширити арсенал існуючих біологічно активних речовин, придатних до одержання лікарських засобів у різних лікарських формах, надаючи тим самим можливість індивідуального підходу до лікування хворих. У народній медицині існують окремі відомості про помірну антимікробну або протизапальну активність відварів гравілату міського [4]. Авторами вперше було виявлено антиоксидантну дію суми поліфенолів кореневища Geum urbanum, одержаних заявленим способом. Вибір як екстрагенту спирту етилового було здійснено експериментальним шляхом, виходячи з умов максимальної екстракції поліфенольних сполук з вибраної сировини. Оптимальним екстрагентом для заявленого способу є 50 % спирт етиловий. У процесі досліджень були визначені також співвідношення сировини до екстрагенту і час екстракції. Дані експериментів наведено у таблицях 12. Таблиця 1 Визначення оптимального співвідношення сировина : екстрагент при екстракції кореневищ гравілату міського 50 % спиртом етиловим у відповідності з заявленим способом № досліду 1 2 3 4 5 Співвідношення сировина: екстра- Вихід готового продукгент ту, % 1:5 17,8 1:9 18,1 1:10 19,7 1:11 19,6 1:12 19,6 Згідно з даним експерименту ефективним інтервалом співвідношення сировини до екстрагенту є 1:9 - 1:11. При зменшенні цього співвідношення зменшується як вихід готового продукту, так і вихід діючих речовин. Збільшення Вихід діючих речовин, % 38,45 41,55 42,55 42,45 42,45 співвідношення недоцільне, тому що показники виходу практично не змінюються, а витрати спирту етилового зростають. Оптимальним є співвідношення сировини до екстрагенту як 1:10. Таблиця 2 Визначення оптимального часу екстракції кореневищ гравілату міського 50 % спиртом етиловим в співвідношенні сировина : екстрагент 1:10 № досліду 1 2 3 4 5 Час екстракції, години 12 13 14 15 16 Вихід готового продукту, % Вихід діючих речовин, % 18,0 39,55 18,2 41,35 19,7 42,55 19,6 42,55 19,6 42,55 Аналіз даних табл. 2 свідчить, що ефективним інтервалом часу екстракції є 13-15 годин. Зменшення цього часу не дозволяє вичерпно екстрагувати поліфенольні сполуки з сировини. Збільшення - не забезпечує зростання показників виходу готового продукту і діючих речовин, та є економічно недоцільним. Оптимальний час екстракції - 14 годин. Експериментальним шляхом визначено, що додаткове промивання сировини (після екстракції та зливу одержаного екстракту) екстрагенту у кількості 40 % від використаного при екстракції дозволяє збільшити відсоток екстрактивних речовин, які обумовлюють фармакологічну дію. Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: кореневище гравілату міського подрібнюють до розміру частин 0,5-1,0 мм, принаймні трикратно екстрагують 50 % спиртом етиловим у співвід 5 96621 ношенні сировина : екстрагент 1:9 - 1:11 протягом 13-15 годин, сировину додатково промивають екстрагентом, об'єднують всі зливи з подальшим упарюванням одержаного екстракту до видалення екстрагенту, фільтрацією та сушінням. Вихід готового продукту 19,7 %. Одержаний продукт - негігроскопічний аморфний порошок світло-коричневого кольору зі специфічним характерним запахом, розчинний у воді, в 50 % етанолі при нагріванні, слаборозчинний у хлороформі, етилацетаті та ефірі. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1 2,0 кг подрібнених (подрібненість 0,5-1 мм) кореневищ Geum urbanum екстрагували 10 л 50 % спирту етилового в типовому екстракторі ємністю 15 л з мішалкою та несправжнім дном протягом 14 годин. Екстракт в об'ємі 5 л зливали, а сировину промивали 2 л 50 % етилового спирту. Екстрагування проводили за тими ж умовами ще двічі новими порціями екстрагенту, додаючи кожного разу 5 л 50 % спирту етилового, зливаючи 6 л екстракту і промиваючи сировину 2 л 50 % спирту етилового. Усі зливи об'єднували та упарювали до повного вилучення спирту. Об'єм кубового залишку становив 3 л. Для вилучення смолистих речовин, які випадають при упарюванні (випадає 50 г, що складає 3,3 % від ваги 6 завантаженої сировини), сумарний екстракт фільтрували через нутч-фільтр. Очищений екстракт висушували у вакуумному апараті при температурі 35±5 °С і розрідженні 550±5 мм рт. ст. до сухого залишку. Отримали 295,5 г сухого цільового продукту, що у перерахунку на повітряно-суху сировину складає 19,7 %. Дослідження біологічної активності поліфенольного комплексу, отриманої запропонованим способом, були проведені in vitro та in vivo і довели, що одержані за заявленим способом поліфенольні сполуки мають виражену антимікробну, протизапальну та антиоксидантну дію. Приклад 2 Для вивчення антимікробної активності поліфенольного комплексу, одержаної за заявленим способом, був використаний метод дифузії в агар. Для оцінювання активності застосовували рекомендовані ВООЗ штами мікроорганізмів: Staphylococcus aureus 25923 АТСС, Escherichia coli 25922 АТСС, Proteus vulgaris 4636 АТСС, Proteus aeruginosa 27853 АТСС та Candida albicans 885/653ATCC. Визначення антимікробної активності досліджуваного поліфенольного комплексу проводили методом дифузії в агар. Як препарат порівняння було вибрано "Новоіманін". Результати дослідження наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Вивчення антимікробної активності полі фенольного комплексу кореневища гравілату міського методом дифузії. Варіант досліду Поліфенольний комплекс Новоіманін S.aureus 25923 АТСС 22,8±1,4 16,1±1,2 Діаметр зон затримки мікроорганізмів в мм ± мм Тест-культура мікроорганізмів Е.соlі P.vulgaris P.aeruginosa 25922 4636 27853 АТСС АТСС АТСС 20,3±1,2 19,6±0,7 17,2±0,6 15,2±0,6 14,5±0,8 12,5±1,1 Аналіз даних таблиці 3 свідчить про виражену антимікробну дію поліфенольного комплексу, отриманого з кореневища гравілату міського заявленим способом, що перевищує дію препарату порівняння. Приклад 3 Протизапальну активність поліфенольного комплексу, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі гострого запального набряку, викликаного субплантарним введенням у задню лапу щура 0,1 мл 1 % розчину карагеніну. Об'єм лапи вимірювали за допомогою онкометра до початку досліду та у момент максимального розвитку набряку (4 години). Поліфенольний комплекс та препарат порівняння ортофен у дозі 8 C.albicans 885/653 АТСС 18,2±0,6 11,2±0,8 мг/кг вводили у шлунок тварин відповідних дослідних груп за 30 хвилин до введення флогогенного агента. Контрольна група тварин одержувала еквівалентну кількість води. Протизапальну активність розраховували за формулою, запропонованою Ф.П. Трінусом: Уk  Уo A  100 , де Уk A - протизапальна активність, % Уk і Уo відповідно об'єм лапи у контролі та у досліді. Результати досліду представлені в табл. 4. 7 96621 8 Таблиця 4 Протизапальна активність поліфенольного комплексу у порівнянні з ортофеном (n = 7) Показник / група Величина набряку, ум. одиниць Протизапальна активність, % Контроль 13,75±1,11 Ортофен, 8 мг/кг 3,25±0,75* 76,4 Сума поліфенолів, 50 мг/кг 6,25±0,25*/** 54,5 Примітка. * - вірогідність розходжень при р < 0,05 у порівнянні з контролем ** - вірогідність розходжень при р < 0,05 у порівнянні з ортофеном Таким чином, у досліді сума поліфенолів найбільшу протизапальну активність проявляла у дозі 50 мг/кг, яка викликала пригнічення розвитку експериментального набряку лап у білих щурів на 54,5 % за ступенем протизапальної активності. Приклад 4 Антиоксидантні властивості поліфенольного комплексу з кореневищ гравілату міського, одержаного за заявленим способом, вивчали на моделі спонтанного перекисного окислення ліпідів у залежності від концентрації екстракту. Наважку печінки використовували для приготування 25 % гомогенату на 0,1 М трисхлоридному буфері (рН = 7,0). Досліджуваний поліфенольний комплекс додавали до гомогенату в концентраціях 0,137, 0,279 та 0,548 мг/мл гомогенату. Свіжоотримані суміші по 0,2 мл вносили у пробірки з 3 мл трис-хлоридного буферу (рН = 7,4). Як препарат порівняння використовували силібор, який додавали до середовища інкубації в концентрації 0,137 мг/мл гомогенату. Інкубацію проводили при температурі 37 °С протягом 15 хвилин. Реакцію зупиняли шляхом додавання 1,5 мл 40 % розчину кислоти трихлороцтової, після чого в інкубаційному середовищі проводили визначення ТБК-активних продуктів. Визначення вмісту ТБК-реактантів в інкубаційному середовищі проводили за допомогою реакції з кислотою тіобар-бітурової з подальшим фотокалориметруванням при довжині хвилі 532 нм. Розрахунок концентрації екстракту в інкубаційному середовищі проводили з урахуванням його кількості, яка надходить через систему ворітної вени до печінки при одноразовому введенні досліджуваної суми поліфенолів у дозах 25, 50 та 100 мг/кг. Аналогічним чином розраховували концентрацію препарату порівняння, яка відповідає дозі 25 мг/кг. Результати проведених досліджень наведені у табл. 5. Таблиця 5 Антиоксидантна активність поліфенольного комплексу у порівнянні з силібором (n = 3). Група Контроль Поліфенольний комплекс 0,548 мг/мл Поліфенольний комплекс 0,279мг/мл Поліфенольний комплекс 0,137мг/мл Силібор 0,137 мг/мл Е 0,580 0,640 0,640 0,135 0,115 0,105 0,180 0,190 0,225 0,430 0,450 0,440 0,345 0,315 0,330 С (мкмоль/л) 3,72 4,10 4,10 0,87 0,74 0,67 1,15 1,25 1,44 2,76 2,88 2,82 2,29 2,02 2,12 Cср.знач. (мкмоль/л) АОА (%) 3,97±0,13 0,76±0,06*/** 80,8 1,28±0,09*/** 67,8 2,82±0,03*/** 29,0 2.11±0,03* 46,9 Примітка: * - вірогідність розходжень за відношенням до контролю (р  0,05); ** - вірогідність розходжень за відношенням до силібору (р  0,05); n - кількість проб в кожній серії; Е - оптична густина; С - концентрація ТБК активних продуктів в інкубаційному середовищі, АОА - антиокислювальна активність. Дані, отримані в експерименті, свідчать, що поліфенольний комплекс у формі сухого екстрак ту кореневища гравілату міського, одержана за заявленим способом, має виражені антиоксидан 9 тні властивості. Було встановлено, що при внесенні до інкубаційного середовища у концентрації 0,137 мг/мл досліджуваний екстракт зменшує накопичення ТБК-активних продуктів на 29,0 %. При збільшенні концентрації екстракту до 0,279 мг/мл антиоксидантний ефект посилювався і складав 67,8 %, у концентрації 0,548 мг/мл екстракт кореневища гравілату міського зменшував накопичення ТБК-реактантів на 80,8 %. У той же час силібор, який додавали до інкубаційного середовища в концентрації 0,137 мг/мл, зменшував накопичення продуктів перекисного окислення ліпідів на 46,9 %. Таким чином, за даними експерименту встановлено, що досліджений поліфенольний комплекс, одержаний за заявленим способом, проявляє виражену антиоксидантну дію, що перевищує дію препарату порівняння. Експериментальними дослідженнями гострої токсичності поліфенольного комплексу, одержаного за заявленим способом, доведено, що відповідно до класифікації К. К. Сидорова її можна віднести до практично нетоксичних речовин. Таким чином, заявлено спосіб одержання поліфенольного комплексу з доступної сировини кореневищ гравілату міського з вираженою антимікробною, протизапальною та антиоксидантною активністю. Спосіб може бути здійснений у промислових умовах фармацевтичного підприємства Комп’ютерна верстка Л. Купенко 96621 10 на стандартному обладнанні. Одержаний за заявленим способом продукт відзначається широким спектром фармакологічної дії, нетоксичний, не алергійний, стійкий при зберіганні (термін зберігання 3 роки) і може бути використаний як субстанція для створення лікарських препаратів у різних лікарських формах. Джерела інформації 1. Деклараційний патент 69626А, Україна, МПК7 А61К 35/78. Спосіб одержання комплексу поліфенольних сполук з протизапальною, кардіопротекторною та антиоксидантною дією. Заявка 2003109473, заявл. 21.10.2003, опубл. 15.09.2004, Бюл. № 9. 2. Патент 76063, Україна А 61К36/185. Спосіб одержання суми поліфенолів з антимікробною, протизапальною та діуретичною активністю. Заявка 200500114, заявл. 04.01.2005, опубл. 15.06.2006, Бюл. № 6. 3. Деклараційний патент 59681А, Україна, МПК7 А61К 35/78. Спосіб одержання поліфенольного комплексу «Флавітін» з протизапальною, анальгетичною, противиразковою та антиоксидантною дією. Заявка 2002119121, заявл. 15.11.2002, опубл. 15.09.2003, Бюл. № 9. 4. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / відп. ред. A.M. Гродзінський.- К.: Вид-во «Українська Радянська Енциклопедія» ім. М.П. Бажана, 1992. - С. 276-277. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601