Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення, причому у середовище додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Bacillus subtilis БТ-2. UA 113271 U (12) UA 113271 U UA 113271 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антимікробні агенти у харчовій промисловості, медицині та сільському господарстві. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., ВільдановаМарцишин Р.І.; опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii 1MB В-7405 [Пат. № 105975 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Мащенко О.Ю., Покора Х.А., Гриценко Н.А.; опубл. 10.07.2014, Бюл. № 13], який включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин об'ємною часткою 3,9-4,1 %. Недоліком цього способу є недостатньо високі антимікробні властивості синтезованих ПАР. В основу корисної моделі покладено задачу створення нового способу одержання ПАР, який покращує антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення. Згідно корисної моделі у середовище для біосинтезу поверхнево-активних речовин додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Bacillus subtilis БТ-2. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення у середовище для біосинтезу ПАР суспензії живих або інактивованих клітин В. subtilis БТ-2 дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3-0,5, MgSO4•7H2O-0,1, СаСl2•2Н2О 0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4•7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного 4 5 складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. В. subtilis БТ-2, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 або 24 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР. Інактивовані стерилізацією в автоклаві при 131 °C упродовж 1 год. клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). Приклад 1. Антимікробні властивості ПАР N. vaccinii 1MB В-7405, синтезованих за внесення у середовище культивування вегетативних клітин В. subtilis БТ-2 Культивування штаму 1MB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3-0,5, MgSO4•7H2O-0,1, СаСl2•2Н2О -0,1, КН2РО4-0,1, FeSO4•7H2O-0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. В. subtilis БТ-2, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР. Інактивовані стерилізацією в автоклаві при 131 °C упродовж 1 год. клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у 1 UA 113271 U 5 10 15 20 25 30 35 циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, воронку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50 °C й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Антимікробні властивості поверхнево-активних речовин аналізують за показником мінімальної інгібуючої концентрації. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють методом двократних серійних розведень у м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ). У стерильних умовах у 10 пробірок вносять по 1 мл середовища, у першу додають 1 мл розчину ПАР певної концентрації, після чого перемішують, відбирають 1 мл і переносять у наступну пробірку. Аналогічно проводять розведення для наступних дев'яти пробірок. З останньої пробірки відбирають 1 мл. Таким чином, кінцевий об'єм у кожній пробірці становить 1 мл (МПБ чи рідке сусло і розчин ПАР), а концентрація ПАР у кожній наступній пробірці знижується у 2 рази. Як контроль використовують 1 мл МПБ без додавання розчину ПАР. Далі у кожну з пробірок 5 6 вносять по 0,1 мл суспензії тест-культур (10 -10 КУО/мл), та перемішують. Пробірки інкубують впродовж 24 год. при 28-30 °C. Результати оцінюють візуально за помутнінням середовища: (+) - пробірки, в яких спостерігають помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) - помутніння немає (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР визначають як середнє значення між концентраціями ПАР в останній пробірці, де ріст відсутній, і в попередній, де він наявний. Як тест-культури під час визначення антимікробних властивостей ПАР використовують штами бактерій (Escherichia coli ІЕМ-1, В. subtilis БТ-2, Pseudomonas sp. MI-2, Proteus vulgaris ПА-12) і дріжджів Candida albicans Д-6 з колекції живих культур кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій. Значення мінімальної інгібуючої концентрації ПАР, синтезованих за наявності у середовищі живих клітин бактерії-індуктора наведено у табл. 1. Наведені дані свідчать, що ПАР, утворювані за внесення у середовище культивування продуцента ПАР суспензії живих клітин В. subtilis БТ2, проявляють вищі антимікробні властивості, ніж синтезовані в аналогічних умовах без індуктора. Приклад 2. Вплив спорових клітин В.subtilis БТ-2 на антимікробні властивостей ПАР N. vaccinii 1MB В-7405 Таблиця 1 Мінімальна інгібуюча концентрація поверхнево-активних речовин N. vacсіnіі 1MB В-7405, синтезованих за присутності живих клітин В. subtilis БТ-2 Індуктор Живі вегетативні клітини В. subtilis БТ-2 Інактивовані вегетативні клітини В. subtilis БТ-2 Контроль (без індуктора) МІК (мкг/мл) щодо В. subtilis БТ- Pseudomonas Candida Proteus Е. соlі ІЕМ-1 2 (спори) sp. MI-2 albicans Д-6 vulgaris ПА-12 8 10 6 6 6 16 16 12 10 21 80 120 80 26 80 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. 40 45 Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють у середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 2 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. В.subtilis БТ-2, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 24 год., суспендують у 100 2 UA 113271 U 5 10 мл стерильної водопровідної води і інактивують стерилізацією в автоклаві при 131 °C протягом 1 год. Інактивовані клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, значення МІК ПАР, синтезованих за наявності спорових клітин В.subtilis БТ-2, є нижчими, ніж показники, встановлені для ПАР, одержаних під час культивування N. vaccinii 1MB В-7405 у середовищі без індуктора. Таблиця 2 Антимікробні властивості ПАР N. vaccinii 1MB В-7405, синтезованих за присутності спорових клітин B.subtilis БТ-2 Індуктор МІК (мкг/мл) щодо B.subtilis БТ-2 Pseudomonas Candida Proteus Е. соlі ІЕМ-1 (спори) sp. MI-2 albicans Д-6 vulgaris ПА-12 Спорові клітини В. subtilis БТ-2 Інактивовані спорові клітини В. subtilis БТ-2 Контроль (без індуктора) 8 28 9 11 12 12 50 12 12 18 80 120 80 26 80 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. 15 20 25 30 Приклад 3. Порівняння антимікробних властивостей ПАР N. vaccinii 1MB В-7405, синтезованих в різних умовах культивування Культивування N. vaccinii 1MB В-7405 здійснюють у середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. B.subtilis БТ-2, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 і 24 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР. Згідно прототипу як джерело вуглецевого живлення використовують технічний гліцерин об'ємною часткою 4 %. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного складу, що містить 0,5 % технічного гліцерину. Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Значення МІК поверхнево-активних речовин, синтезованих під час культивування N. vaccinii 1MB В-7405 в умовах згідно нового способу і прототипу наведено у табл. 3. Таблиця 3 Антимікробні властивості ПАР, синтезованих в різних умовах культивування N. vaccinii 1MB В-7405 МІК (мкг/мл) щодо Умови культивування Згідно запропонованого способу (індуктор - вегетативні клітини B.subtilis БТ-2) Е. соlі ІЕМ-1 Proteus B.subtilis БТ- PseudomoCandida vulgaris ПА2 (спори) nas sp. MI-2 albicans Д-6 12 8 10 3 6 6 6 UA 113271 U Продовження таблиці 3 Антимікробні властивості ПАР, синтезованих в різних умовах культивування N. vaccinii 1MB В-7405 МІК (мкг/мл) щодо Умови культивування Згідно запропонованого способу (індуктор-спорові клітини B.subtilis БТ-2) Згідно прототипу Е. соlі ІЕМ-1 Proteus B.subtilis БТ- PseudomoCandida vulgaris ПА2 (спори) nas sp. MI-2 albicans Д-6 12 8 28 9 11 12 80 120 80 26 80 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. Отже, використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих ПАР порівняно з прототипом у 2,4-13 разів. 5 10 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii 1MB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення, який відрізняється тим, що у середовище додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Bacillus subtilis БТ-2. Комп’ютерна верстка Т. Вахричева Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4