Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин (4 %, об'ємна частка). У стаціонарній фазі росту у середовище вносять соняшникову олію у концентрації 0,07-0,09 % (об'ємна частка). UA 109074 C2 (12) UA 109074 C2 UA 109074 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхневоактивних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.] Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii IMB В-7405 [Пат. 81803 UA, Штам Nocardia vaccinii IMB В7405 як продуцент поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Мащенко О.Ю., Покора Х.А., Гриценко Н.А. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13], який включає культивування N. vaccinii IMB В7405 на мінеральному середовищі з низьким вмістом солей (менше 2 г/л) з використанням як ростового субстрату технічного гліцерину (побічний продукт виробництва біодизелю) у концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка). Недоліком цього способу є велика тривалість культивування (168 год.) і недостатньо висока концентрація синтезованих поверхнево-активних речовин (4,9 г/л). В основу винаходу поставлено задачу створення нового способу одержання поверхневоактивних речовин, який скорочує тривалість культивування і підвищує концентрацію ПАР. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин (4 %, об'ємна частка). Згідно винаходу у стаціонарній фазі росту у середовище вносять соняшникову олію у концентрації 0,07-0,09 % (об'ємна частка). Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення 0,07-0,09 % (об'ємна частка) соняшникової олії у стаціонарній фазі росту штаму N. vaccinii IMB В-7405 на середовищі з 4 % (об'ємна частка) технічного гліцерину дає змогу скоротити тривалість культивування в 1,4 рази (до 120 год.) і підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3 - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, КН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин (побічний продукт виробництва біодизелю) у концентрації 4 % (об'ємна частка). У стаціонарній фазі росту (72 год.) у середовище вносять 0,07-0,09 % соняшникової олії (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу скоротити тривалість культивування в 1,4 рази (до 120 год.) і підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л). Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 залежно від моменту внесення соняшникової олії у середовище з технічним гліцерином Культивування штаму ІMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, КН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин (побічний продукт виробництва біодизелю) у концентрації 4 % (об'ємна частка). На початку процесу (лаг-фаза), в експоненційній (48 год.) і стаціонарній (72 год.) фазі росту у середовище вносять соняшникову олію у концентрації 0,05 і 0,10 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу, що містить як джерело вуглецю та енергії 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 168 год. 1 UA 109074 C2 5 10 15 Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1М НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 залежно від моменту внесення соняшникової олії у середовищі з технічним гліцерином. Як видно з наведених у табл. 1 даних, найвищі показники синтезу ПАР досягаються за внесення олії на початку стаціонарної фази росту. Таблиця 1 Вплив моменту внесення соняшникової олії у середовище з технічним гліцерином на синтез ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 Концентрація олії, % (об'ємна частка) 0 0,05 0,10 20 25 30 Момент внесення олії (фаза росту) (без олії, прототип) Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна Лаг-фаза Експоненційна Стаціонарна ПАР, г/л 4,9±0,24 5,0±0,25 5,1±0,25 5,5±0,27 5,0±0,25 5,2±0,26 5,6±0,28 Приклад 2. Залежність синтезу ПАР N. vaccinii ІMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином від концентрації соняшникової олії Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,03-0,10 % (об'ємна частка) соняшникової олії. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв) при 28 °C упродовж 168 год. Концентрацію синтезованих ПАР визначають як описано у прикладі 1. Емульгувальну здатність (індекс емульгування) культуральної рідини визначають так. До 2 мл культуральної рідини додають 2 мл субстрату для емульгування та струшують упродовж 2 хв. Вимірювання індексу емульгування (Е24) проводять через 24 год. як величину відношення висоти шару емульсії до загальної висоти рідини в пробірці і виражають у відсотках. Як субстрат для емульгування використовують соняшникову олію. Показники синтезу ПАР залежно від концентрації соняшникової олії наведено у табл. 2. Таблиця 2 Вплив концентрації соняшникової олії на біосинтез ПАР за умов росту N. vaccinii ІMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином Концентрація олії (%, об'ємна частка) 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,10 ПАР, г/л 5,3±0,30 5,4±0,30 5,5±0,27 5,6±0,28 5,9±0,29 6,1±0,30 6,0±0,30 5,6±0,28 2 Е24, % 59±2,9 59±2,9 60±3,0 60±3,0 65±3,2 65±3,2 65±3,2 60±3,0 UA 109074 C2 5 10 Отже, за внесення 0,07-0,09 % соняшникової олії у середовище з 4 % технічного гліцерину концентрація синтезованих ПАР досягає 5,9-6,1 г/л. Приклад 3. Вплив тривалості культивування N. vaccinii ІMB В-7405 на синтез ПАР Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних у прикладі 1. На початку стаціонарної фази росту (72 год.) у середовище вносять 0,07-0,09 % (об'ємна частка) соняшникової олії. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 і 168 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, у разі культивування N. vaccinii ІMB В-7405 згідно запропонованого способу концентрація синтезованих ПАР становить 5,9-6,1 г/л на 120 год. культивування. Таблиця 3 Синтез ПАР залежно від тривалості культивування N. vaccinii ІMB В-7405 Концентрація олії, (%, об'ємна частка) Без олії (прототип) 0,07 0,08 0,09 15 20 25 Тривалість культивування, год. 120 168 120 168 120 168 120 168 ПАР, г/л 4,0±0,20 4,9±0,24 5,9±0,29 5,9±0,29 6,1±0,30 6,1±0,30 6,0±0,30 6,0±0,30 Отже, внесення 0,07-0,09 % олії у стаціонарній фазі росту N. vaccinii ІMB В-7405 на середовищі з 4 % (об'ємна частка) технічного гліцерину дає змогу скоротити тривалість культивування в 1,4 рази (до 120 год.) і підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii ІMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин (4 %, об'ємна частка), який відрізняється тим, що у стаціонарній фазі росту у середовище вносять соняшникову олію у концентрації 0,07-0,09 % (об'ємна частка). Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3