Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: UA 93174 U UA 93174 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані для очищення довкілля від нафти та нафтових забруднень, а також у нафтовидобувній, хімічній, фармацевтичній, харчовій промисловості. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру / Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4.]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii IMB В-7405 [Пат. 81803 UA, Штам Nocardia vaccinii IMB В7405 як продуцент поверхнево-активних речовин / Пирог Т.П., Мащенко О.Ю., Покора Х.А., Гриценко Н.А. Опубл. 10.07.2013, Бюл. № 13], який включає культивування N. vaccinii IMB В7405 на мінеральному середовищі з низьким вмістом солей (менше 2 г/л) з використанням як ростового субстрату технічного гліцерину у концентрації 3,9-4,1 % (об'ємна частка). Недоліком цього способу є недостатньо висока концентрація синтезованих поверхневоактивних речовин (4,9 г/л), а також недостатньо висока концентрація технічного гліцерину у середовищі, який є відходом виробництва біодизелю. Враховуючи об'єми виробництва біодизелю у світі, - понад 11 млн т у 2008 році з щорічним наступним збільшенням на 8-10 % [Appl. Biochem. Biotechnol. 2012. 166, N 3. P. 680-699], а також кількість утворюваного як побічного продукту технічного гліцерину - 10 % від одержуваного біодизелю [Appl. Biochem. Biotechnol. 2013. 169, N 1. P. 110-122], стає зрозумілим, що для ефективного використання такого відходу як субстрату у біотехнологічних процесах його вміст у середовищі культивування продуцентів практично важливих метаболітів повинен бути якомога вищим. В основу корисної моделі поставлено задачу створення нового способу одержання поверхнево-активних речовин, який підвищує концентрацію синтезованих ПАР і вміст технічного гліцерину у середовищі культивування. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту нітрат натрію і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин, згідно з корисною моделлю, концентрація нітрату натрію становить 1,1-1,3 г/л, а посівного матеріалу - 15-20 % від об'єму середовища. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Підвищення у середовищі культивування N. vaccinii IMB В7405 концентрації нітрату натрію до 1,1-1,3 г/л, а посівного матеріалу до 15-20 % від об'єму середовища дає змогу підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л) і вміст технічного гліцерину до 6-8 % (об'ємна частка). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 1,2, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, KН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин (побічний продукт виробництва біодизелю) у концентрації 7 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 15 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 168 год. Використання нового способу дає змогу підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л) і вміст технічного гліцерину у середовищі до 6-8 % (об'ємна частка). Приклад 1. Синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином залежно від концентрації інокуляту Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють на рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNО3 - 0,5, MgSO4·7H2O - 0,1, СаСl2·2Н2О - 0,1, KН2РО4 - 0,1, FeSO4·7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю та енергії використовують технічний гліцерин у концентрації 5 і 6 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту (48 год.), вирощену на середовищі 1 UA 93174 U 5 10 15 20 наведеного складу, що містить як джерело вуглецю та енергії 0,5 % технічного гліцерину (об'ємна частка). Кількість інокуляту - 5-25 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 168 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають так. Культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну лійку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСl, лійку закривають пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв, далі додають ще 4 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у лійці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1 М НСl й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. У табл. 1 наведено дані про синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 залежно від концентрації посівного матеріалу. Як видно з наведених у табл. 1 даних, підвищення концентрації інокуляту до 15-20 % у середовищі з 5 і 6 % технічного гліцерину супроводжується збільшенням концентрації синтезованих ПАР на 20-30 % порівняно з використанням 5 % посівного матеріалу. Таблиця 1 Вплив концентрації інокуляту на синтез ПАР за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на технічному гліцерині Концентрація гліцерину, % 5 6 Концентрація інокуляту, % 10 15 20 25 10 15 20 25 ПАР (г/л), % від контролю 115 130 130 120 110 120 120 115 Примітка. Контроль (100 %) - концентрація ПАР за використання 5 % посівного матеріалу. 25 30 Приклад 2. Залежність синтезу ПАР N. vaccinii IMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином від концентрації джерела азотного живлення Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних у прикладі 1. Концентрація нітрату натрію у середовищі становить 0,5-1,5 г/л, посівного матеріалу - 5 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 168 год. Концентрацію синтезованих ПАР визначають як описано у прикладі 1. Показники синтезу ПАР залежно від концентрації джерела азоту наведено у табл. 2. 2 UA 93174 U Таблиця 2 Вплив концентрації нітрату натрію на синтез ПАР за умов росту N. vaccinii IMB В-7405 на середовищі з технічним гліцерином Концентрація гліцерину, % 5 6 Концентрація нітрату натрію, г/л 0,75 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 0,75 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 ПАР (г/л), % від контролю 130 135 140 145 140 130 135 140 145 150 145 135 Примітка. Контроль (100 %) - концентрація ПАР на середовищі з 0,5 г/л нітрату натрію. 5 10 15 Отже, підвищення концентрації джерела азотного живлення до 1,1-1,3 г/л у середовищі з 5 і 6 % технічного гліцерину супроводжується збільшенням концентрації синтезованих ПАР на 4050 % порівняно з показниками на базовому середовищі з 0,5 г/л нітрату натрію. Приклад 3. Вплив концентрації джерела азотного живлення та інокуляту на синтез ПАР N. vaccinii IMB В-7405 Культивування бактерій здійснюють в умовах, описаних у прикладі 1. Концентрація технічного гліцерину у середовищі становить 6-9 %, нітрату натрію - 0,5 і 1,2 г/л, посівного матеріалу - 15 %. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об./хв) при 28 °C упродовж 168 год. Кількість синтезованих ПАР (г/л) визначають як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 3 даних, у разі підвищення концентрації посівного матеріалу до 15 % і вмісту нітрату натрію до 1,2 г/л концентрація синтезованих ПАР досягає 5,9-6,1 г/л на середовищі з 6-8 % технічного гліцерину. Таблиця 3 Синтез ПАР залежно від тривалості культивування N. vaccinii IMB В-7405 Концентрація гліцерину, (%, об'ємна частка) Концентрація нітрату натрію, г/л ПАР, г/л 0,5 1,2 0,5 1,2 0,5 1,2 0,5 1,2 3,0±0,15 5,9±0,29 2,9±0,14 6,1±0,30 2,0±0,10 6,0±0,30 1,1±0,05 3,0±0,15 6 7 8 9 20 Підвищення у середовищі культивування N. vaccinii IMB В-7405 концентрації нітрату натрію до 1,1-1,3 г/л, а посівного матеріалу до 15-20 % від об'єму середовища дає змогу підвищити на 20-25 % концентрацію синтезованих ПАР (до 5,9-6,1 г/л) і вміст технічного гліцерину до 6-8 % (об'ємна частка). 3 UA 93174 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело азоту нітрат натрію і як джерело вуглецевого живлення технічний гліцерин, який відрізняється тим, що концентрація нітрату натрію становить 1,1-1,3 г/л, а посівного матеріалу - 15-20 % від об'єму середовища. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4