Спосіб діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження

Реферат: Спосіб діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють експресію пухлинними клітинами білків. Визначається рівень експресії гліального фібрилярного кислого білка GFAP, рецептора епідермального фактора росту EGFR, білків р53 та MGMT, маркера проліферативної активності Кі-67. UA 113278 U (12) UA 113278 U UA 113278 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до медицини, насамперед до медичних нехірургічних пристосувань та способів для діагностики матеріалів особливими засобами, здебільше до імунологічного аналізу з використанням матеріалів, що включають антитіла, або до хімічного аналізу біологічних матеріалів та може бути використана в онкології, патоморфології та нейрохірургії для підтвердження гістогенезу та з'ясування рівня злоякісності новоутворень головного мозку астроцитарного походження, а отже використання індивідуально скоригованої терапії в залежності від достовірно верифікованого діагнозу. Відомий спосіб (Метод діагностики високо- і низькорівневих астроцитом з використанням біомаркерів, а також їх діагностичний набір, Пат. № 20110027797, США, МПК C12Q 1/68;т C07H 21/00; С07К 16/18; G01N 33/53 / Somasundaram K, Kondaiah P, Santosh V, Hegde S, Hegde AS, Rao MR. (Індія), заявка № 12/935568 від 31.03.2009; опубл. 03.02.2011), в якому шляхом виявлення та аналізу in vitro у фрагменті пухлини маркерів біологічних властивостей проводиться диференційна діагностика низько-та високодиференційованих гліальних пухлин. Таким чином відомий спосіб, використовуючи виявлені зміни у генетичному матеріалі пухлинних клітин, може бути застосований в якості панелі маркерів для діагностики астроцитарних пухлин головного мозку. До причин, які перешкоджають досягненню нижчезазначеного технічного результату при використанні відомого способу, відносяться: по-перше, авторами не проводиться ідентифікація пухлини, а тому заявлений результат цього способу включає в себе лише визначення рівня злоякісності пухлини (високий-низький), що недостатньо для визначення оптимальної тактики лікування, по-друге, використання у даному способі методів генномолекулярного аналізу (полімеразної ланцюгової реакції), а саме визначенні мутацій в генах АР2А2, АРОС3, BDNF, CALU, CXCL14, CXCL9, F11, GNRH1, LAD1, LAMP2, PRL, PSG9, SERPINC1, GPX3, і SPARCL1, має значну вартість, що не дозволить широко використовувати його у практичній діяльності. Відомий спосіб (Методи і набори, придатні для ідентифікації астроцитом, їх рівня і прогнозу гліобластом, Пат. № 8883419 (США); МПК C12Q 1/68; С12Р 19/34 Somasundaram K, Kondaiah P, Santosh V, Balasubramaniam A, Hedge AS, Chandramouli AR, Rao MR (Індія), автори; Council of Scientific & Industrial Research (New Delhi, IN), фірма; заявл. № 12/811976 від 06.01.2009; опубл. 11.11.2014), в якому шляхом виявлення та аналізу in vitro у фрагменті пухлини маркерів біологічних властивостей проводиться верифікація, а також встановлення рівня злоякісності астроцитарних пухлин та визначення прогнозу гліобластом. Таким чином, відомий спосіб, використовуючи виявлені зміни у генетичному матеріалі пухлинних клітин, може бути застосований для діагностики астроцитарних пухлин головного мозку та визначення рівня їх злоякісності. Незважаючи на суттєві вдосконалення, цей спосіб має наступні недоліки, що не дозволяють досягти зазначеного нижче технічного результату: по-перше, не дає можливості відрізнити анапластичну астроцитому від гліобластоми чи дифузної астроцитоми, по-друге, використання дорогих методів дослідження робить неможливим його застосування у практичній охороні здоров'я. Більш наближеним до дійсної корисної моделі серед об'єктів аналогічного призначення за найбільшою кількістю істотних ознак є спосіб (Методи діагностики та прогнозування пухлини головного мозку, Пат. № 8367347 (США); МПК G01N 33/53; С07K 16/00; С12Р 21/08, Hartmann C, Von Deimling A, Zentgraf H, Capper D, Reifenberger G, Weller M, Wick W, автори; Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des Offentlichen Rechts, Ruprecht-Karls-Univeristat Heidelberg, фірма; заявл. № 12/637233 від 14.12.09; опубл. 05.02.13) що включає виявлення експресії певного антигену у біопсійному чи операційному матеріалі новоутворення імуногістохімічним методом з метою діагностики та визначення прогнозу пухлини головного мозку, у відповідності з котрим при виявленні експресії антигену IDH1 у пухлинних клітинах імуногістохімічним методом роблять висновок про наявність пухлини та гірший прогноз, аніж у разі її відсутності. Причиною, що перешкоджає досягненню заявлюваного нижче технічного результату при використанні прототипу треба визнати: по-перше, експресія маркеру IDH1 характерна тільки для незначної частини астроцитарних пухлин (20 %). По-друге, експресія маркеру ІDH1 спостерігається також у 50 % олігодендрогліальних пухлин головного мозку. Таким чином, наведений спосіб не має достатньої специфічності і чутливості. До основи дійсної корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження, застосування якого сприяло би підвищенню точності верифікації діагнозу та збереженню економічності методики шляхом визначення експресії панелі антигенів імуногістохімічним методом з метою покращення точності діагностики астроцитарних пухлин головного мозку, що надасть можливість проведення адекватної терапії. 1 UA 113278 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Поставлена задача вирішується тим, що в способі діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження, який полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють експресію пухлинними клітинами білків, відповідно до корисної моделі визначається рівень експресії гліального фібрилярного кислого білка GFAP, рецептору епідермального фактора росту EGFR, білків р53 та MGMT, маркера проліферативної активності Кі-67. Гліальний фібрилярний кислий білок (GFAP) є проміжним філаментом глії, переважно астроцитів, і тому визначається імуногістохімічним методом у 100 % астроцитом. Інші гліальні пухлини мають незначну або помірну GFAP-позитивність, що не повинна привести до хибнопозитивного висновку про астроцитарне походження пухлини. Таким чином, виявлення експресії цього білка доцільно використовувати для ідентифікації астроцитарного походження клітин. Позитивною реакцією вважалось наявність дифузного та/чи фокального цитоплазматичного та/чи мембранного коричневого забарвлення у більше 5 % неопластичних клітин. Показник проліферативної активності Кі-67 дозволяє підрахувати справжню кількість клітин в стані мітозу на всіх його етапах, а також у підготовчій та завершальній фазах. Наявність ядерного забарвлення до 3 % пухлинних клітин вважається показником пілоцитарної чи дифузної астроцитоми, більше 3 % - анапластичної астроцитоми чи гліобластоми. Білок р53 не виявляється у нормальній тканині головного мозку імуногістохімічним методом, але надекспресія у пухлинних клітинах, особливо у клітинах гліобластом дозволяє використовувати експресію цього білка у диференційній діагностиці астроцитарних пухлин різного ступеня злоякісності. Підрахунку піддають клітини з інтенсивним ядерним забарвленням, обчислюють їх частку. Зі збільшенням рівня злоякісності пухлини збільшується частота високих рівнів експресії білка MGMT. Суттєве значення у лікуванні гліобластом має використання хіміотерапевтичного алкілуючого препарату темозоламіду, чутливість до якого негативно корелює з експресією MGMT, виявленою імуногістохімічним методом. Експресія протешу MGMT ендотеліальними клітинами використовується у якості внутрішнього позитивного контролю. Підраховують відсоток клітин з інтенсивним ядерним забарвленням, обчислюють їх частку. Експресія рецептору епідермального фактору росту EGFR може спостерігатися у всіх астроцитомах, але її частота і рівень прямо пов'язана зі ступенем злоякісності пухлини, особливо важливим є збільшення експресії в інфільтруючи гліомах. Рекомендується підраховувати частку пухлинних клітин з добре забарвленими цитоплазматичними мембранами. Тому сукупність запропонованих відмітних ознак заявленої корисної моделі при вирішенні поставленої задачі та перевершенні технічного результату є суттєвою, характеризує затребуваний обсяг її правового захисту "новим" і поширюється на усі випадки її багаторазової реалізації. У заявленому способі, що ґрунтується на імуногістохімічному виявленні специфічних антигенів у пухлинних клітинах фрагментів, отриманих під час біопсії чи оперативного втручання, для поліпшення якості диференційної діагностики астроцитарних пухлин головного мозку використовують наступний набір первинних антитіл GFAP (DAKOCytomation, Данія), MGMT (ThermoScientific (TS), США), EGFR (TS, США), p53 (TS, США), Ki-67 (TS, США), детальні характеристики яких зазначені у таблиці 1. Парафінові зрізи, товщиною 4 мкм, що насаджені на скельця з адгезивним покриттям, підлягають демаскіровці: кип'ячіння у мікрохвильвій печі протягом 20 хвилин. Система візуалізації - Ultra Vision Quanto (TS, США). Методика постановки імуногістохімічних реакцій згідно протоколів та рекомендацій компанії виробника. Для встановлення діагнозу пілоцитарної астроцитоми використовують позитивний статус (+) GFAP, низький рівень експресії kі-673 %), EGFR75 % або MGMT>75 %. 2 UA 113278 U Таблиця Характеристика первинних, антитіл № 1. 2. 3. 4. 5. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Первинне антитіло GFAP MGMT EGFR p53 Кі-67 Клон ab-1 ab-1 sp-5 sp-6 Розведення RTU 1:50 1:100 1:200 1:400 Виробник DAKOCytomation, Данія TermoScientific, США TermoScientific, США TermoScientific, США TermoScientific, США У дослідження увійшли зразки новоутворень головного мозку 52 пацієнтів. Матеріал був отриманий шляхом біопсії чи оперативного втручання видалення пухлини головного мозку. Отриманий матеріал фіксували у нейтральному формаліні, аби уникнути хибно негативних реакцій з первинними антитілами. Наступним етапом була заливка у парафін з подальшим виготовленням гістологічних препаратів та забарвленням їх за стандартною методикою гематоксиліном та еозином та імуногістохімічним методом з використанням наступної панелі первинних антитіл GFAP, MGMT, EGFR, p53, Ki-67, з наступною верифікацією діагнозу пухлини головного мозку астроцитарного походження та встановлення рівня злоякісності пухлини. Приклад 1 У пацієнта Г., 1993 р. н., у травні 2014 року виявлено солітарне новоутворення потиличної ділянки головного мозку праворуч. Була здійснена біопсія новоутворення. Гістологічний висновок без виконання імуногістохімічного дослідження - "гліобластома?". Імуногістохімічне дослідження підтвердило гліальну природу пухлини (GFAP+), був визначений високий рівень проліферації Кі-67 (39 %), рівень експресії р53 дорівнював 27 %, MGMT-21 %, EGFR-41 %. Імунофенотип відповідав анапластичній астроцитомі, що потребувало подальшого проведення опромінення ложа пухлини, а не усього головного мозку. Приклад 2 Пацієнт К., 1973 р. н., госпіталізований у нейрохірургічне відділення з рецидивом анапластичної астроцитоми скронево-тім'яної ділянки головного мозку. Післяопераційний матеріал був направлений на патогістологічне дослідження. З попереднім діагнозом "гліобластома?” матеріал направлено до імуноморфологічної лабораторії. Проведені дослідження виявили GFAP+ статус, високу проліферативну активність (експресія маркеру проліферації Кі-67 дорівнювала 27 %), рівень експресії білка р53 дорівнював 29 %, MGMT-79 %, EGFR-63 %, що дозволило встановити діагноз "гліобластома". MGMT-позитивність вказала на низьку ефективність хіміотерапії (темозоламідом), що було враховано при визначенні оптимального комбінованого лікування, яке дозволило стабілізувати стан пацієнта. Приклад 3 Отриманий біопсійний матеріал пацієнтки Н., 1964 р. н. дослідили гістологічно, діагностовано гліоз. Через 4 місяці стан погіршився, було рекомендовано перегляд попередньо отриманого матеріалу з наступним імуногістохімічним дослідженням. Виявлені імуноморфологічні властивості пухлинних клітин (GFAP+, індекс проліферації 7 %, рівень експресії р53 дорівнював 48 %, MGMT-66 %, EGFR-37 %) дозволили встановити діагноз анапластичної астроцитоми. Проведене оперативне лікування. Пацієнтка виписана для подальшого проведення променевої терапії, при визначенні параметрів якої спиралися на встановлений діагноз. Вищезазначені приклади практичного використання способу диференційної діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження демонструють використання розширених молекулярно-біологічних характеристик новоутворень головного мозку у діагностиці пухлин астроцитарного походження. Дослідження рівня експресії панелі білків: гліального фібрилярного кислого білка GFAP, рецептора епідермального фактора росту EGFR, білків р53 та MGMT, маркера проліферативної активності Кі-67, збільшило точність діагностики астроцитарних пухлин головного мозку та інформативність кінцевого результату на до- і післяопераційному етапах. 3 UA 113278 U ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 Спосіб діагностики пухлин головного мозку астроцитарного походження, який полягає у тому, що у видаленій пухлині оцінюють експресію пухлинними клітинами білків, який відрізняється тим, що визначають рівень експресії гліального фібрилярного кислого білка GFAP, рецептора епідермального фактора росту EGFR, білків р53 та MGMT, маркера проліферативної активності Кі-67. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4