Застосування ліпофільного комплексу, одержаного з листя глоду м’якуватого

Реферат: Винахід стосується застосування ліпофільного комплексу листя глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.) як агента з антимікробною дією. UA 113928 C2 (12) UA 113928 C2 UA 113928 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до хіміко-фармацевтичної галузі, а саме до способів одержання з рослинної сировини біологічно активних речовин ліпофільної природи та їх комплексів з антимікробною дією, які можуть бути використані як активні субстанції при створенні лікарських засобів зазначеної фармакологічної активності у різних лікарських формах. У зв'язку з тим, що під дією екологічних факторів з'являються нові, мутуючі мікроорганізми, нечутливі до традиційних препаратів та являються збудниками таких дерматологічних захворювань як дерматози, дерматити, екземи, необхідно вести пошук природних субстанцій для вирішення цієї проблеми. Тому дослідження лікарських рослин з метою виділення та визначення класів біологічно активних речовин (БАР), які мають антимікробну активність, є актуальним завданням сучасної фармацевтичної науки. Ліпофільні комплекси БАР, отримані з рослинної сировини, є перспективними джерелами антимікробних засобів. Відомий спосіб одержання засобу з антимікробною активністю з листя евкаліпту прутовидного [1] шляхом трикратної екстракції рослинної сировини 96 % спиртом етиловим або етилацетатом при співвідношенні сировина:екстрагент 1:3-1:20 протягом доби з подальшими фільтрацією та упарюванням об'єднаного екстракту до 1/20-1/22 попереднього об'єму, очищенням екстракту шляхом розчинення в 3-кратній кількості гексану або бензин-калоші та додавання 4 % розчину сульфату міді. Вихід цільового продукту - 10,5 %. Недоліками наведеного способу є багатостадійність, надмірні витрати токсичних органічних розчинників (гексану) та використання імпортної сировини - листя евкаліпту, що ускладнює одержання засобу, робить більш небезпечним процес отримання екстракту та веде до здороження виробництва. Відомий спосіб одержання двох комплексів БАР - ліпофільного та фенольного, які проявляють антимікробну, протизапальну та репаративну активність із бруньок тополі китайської [2] шляхом послідовного вилучення з рослинної сировини ліпофільного комплексу методом вичерпного екстрагування хлорорганічним розчинником, переважно хлороформом, при співвідношенні сировина:екстрагент 1:9-1:10, подальшим упарюванням витяжки до видалення розчинника при температурі 60-70 °C, з наступним отриманням фенольного комплексу, шляхом трикратної екстракції висушеної знежиреної сировини 50-65 % етанолом при нагріванні до 6080 °C, протягом 30 хвилин, при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:10 з наступним об'єднанням спиртових витягів, упарюванням та сушкою для одержання фенольного комплексу. Недоліком зазначеного способу є багатостадійність, що ускладнює його здійснення у виробничих умовах, та довготривалість технологічного процесу, використання великих об'ємів спирту етилового. Найближчим до заявленого способу за сукупністю ознак є спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії [3], згідно з яким як сировину використовують траву підмаренника справжнього (Galium verum L.), екстракцію здійснюють хлороформом при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:10-1:12, з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі протягом 28-32 годин, з наступним упарюванням та видаленням екстрагенту і отриманням сухого залишку. Ліпофільний комплекс, отриманий із зазначеної сировини, а саме трави підмаренника справжнього (Galium verum L.), має достовірну антимікробну дію. Недоліком зазначеного способу є використання великих об'ємів органічного розчинника, довготривалість технологічного процесу, що веде до збільшення вартості цільового продукту. Задачею винаходу є створення способу одержання засобу рослинного походження, а саме ліпофільного комплексу БАР, який виявляє виражену антимікробну дію. Поставлена задача вирішується таким чином, що у способі одержання ліпофільного комплексу з антимікробною дією шляхом багаторазової екстракції рослинної сировини з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі, з використанням як екстрагенту - хлороформу, та наступним упарюванням до видалення екстрагента і отриманням сухого залишку, згідно з винаходом як сировину використовують листя глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.), екстракцію здійснюють при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:8-1:10 до знебарвлення розчинника при постійно підтримуваній температурі 50-65 °C протягом 25-27 годин. Винаходом передбачено, що як рослинну сировину використовують листя глоду м'якуватого. Глід м'якуватий (Crataegus submollis Sarg.) - належить до родини розові (Rosaceae L.) та використовується в народній медицині як гіпотензивний засіб [4]. На території України рослина інтродукована з 1886 року та є плодовою культурою [5]. Авторами вперше встановлено виражену антимікробну дію ліпофільного комплексу, одержаного з глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.). 1 UA 113928 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Компонентний склад хлороформного екстракту рослини представлено біологічно активними речовинами, що мають виражені антимікробні властивості - хлорофілами, терпеноїдами, жирними кислотами та ароматичними сполуками. Всі ознаки заявленого способу були визначені дослідним шляхом. Вибір хлороформу як хлорорганічного розчинника для здійснення заявленого способу обумовлений його здатністю максимально екстрагувати ліпофільні сполуки з вибраної рослинної сировини. Інші знежирюючі розчинники, наприклад петролейний ефір, діетиловий ефір та інші, не забезпечують повного виділення ліпофільного комплексу з листя глоду м'якуватого. У сучасному фітохімічному виробництві хлороформ широко застосовують як знежирюючий агент, проте найчастіше отримані при цьому ліпофільні фракції не є цільовим продуктом та у подальше виробництво не включаються. Тож заявлений спосіб залишає можливість комплексної переробки такої сировини, як листя глоду м'якуватого, шляхом екстрагування знежиреного шроту іншими розчинниками з метою одержання інших, зокрема фенольних, фракцій. Експериментальним шляхом встановлено, що оптимальним при здійсненні заявленого способу є використання співвідношення сировини до екстрагенту як 1:8-1:10. При цьому, якщо співвідношення менше 1:8, то не забезпечується достатня екстракція БАР, що приводить до зниження фармакологічної активності та виходу цільового продукту. Співвідношення понад 1:10 веде до ускладнення та подовження технологічного процесу, збільшення використання розчинника та енерговитрат. Екстракція протягом 25-27 годин забезпечує максимальне вилучення ліпофільних сполук з сировини. Згідно з заявленим способом упарювання проводять до видалення екстрагенту з подальшим отриманням сухого залишку. Отриманий залишок являє собою темно-зелену масу з різким характерним запахом. Заявлений спосіб здійснюють в умовах рециркуляції екстрагенту у замкненому циклі, що запобігає виходу хлороформу в оточуюче середовище. Спосіб здійснюють за простою технологією, яку можливо відтворити на стандартному заводському обладнанні наступним чином. Заготовлене у фазу плодоносіння подрібнене листя глоду м'якуватого завантажують у циркуляційний екстрактор, заливають хлороформом та вичерпно екстрагують при постійно підтримуваній температурі 50-65 °C протягом 25-27 годин при загальному співвідношенні сировини і екстрагенту 1:8-1:10 з рециркуляцією екстрагенту у замкненому циклі до знебарвлення екстрагенту. Отриманий екстракт упарюють до видалення парів хлороформу у вакуумі до отримання сухого залишку. Одержують субстанцію рослинного походження антимікробної дії, нетоксичну, придатну до тривалого застосування без формування резистентності патогенних мікроорганізмів. Для здійснення заявленого способу існує достатня вітчизняна сировинна база. Винахід ілюструється прикладами. Приклад 1. 1 кг заготовленого у фазу плодоносіння і подрібненого листя глоду м'якуватогозавантажили у циркуляційний екстрактор, залили 8 л хлороформу та вичерпно екстрагували при постійно підтримуваній температурі 65 °C протягом 25 годин при загальному співвідношенні сировина:екстрагент 1:8 з рециркуляцією екстрагента у замкненому циклі до знебарвлення екстрагенту. Отриманий екстракт упарювали до видалення парів хлороформу у вакуумі до отримання сухого залишку. Вихід цільового продукту становив 20 %. Приклад 2. Антибактеріальну активність ліпофільного комплексу з листя глоду м'якуватого, отриманого за заявленим способом, досліджували in vitro методом дифузії в агар (метод "колодязів") [6, 7]. Ступінь чутливості мікроорганізмів оцінювали за розміром зон затримки 7 росту. Мікробне навантаження складало 10 мікробних клітин на 1 мл середовища і визначалось візуально за оптичним стандартом каламутності McFarland. Для оцінки активності ліпофільного комплексу використовували стандартні штами мікроорганізмів, регламентовані ВООЗ для вивчення антимікробної дії препаратів: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 4636, Bacillus subtilis ATCC 6633, Candida albicans 885-663. Для визначення антимікробної дії культури мікроорганізмів вирощували на м'ясо-пептонному агарі при температурі 37 °C. Термін культивування мікроорганізмів складав 24 години. Для кількісної оцінки антимікробної дії ліпофільного комплексу та визначення мінімальної пригнічуючої ріст мікроорганізмів концентрації використовували метод серійних розведень. Ліпофільний комплекс використовували у вигляді 5 % спиртового розчину. Результати проведених досліджень наведені в таблиці. 2 UA 113928 C2 Таблиця Активність ліпофільного комплексу з листя глоду м'якуватого, одержаного за заявленим способом Тест - штами мікроорганізмів S. aureus ATCC 25923 Е. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 P. vulgaris ATCC 4636 B. subtilus ATCC 6633 C. albicans ATCC 885-663 Діаметр зон затримки росту в мм 25,5±0,6 X X 14,0±0,8 29,5±0,8 X *МБсК, мкг/мл **МБцК, мкг/мл 62,5 250 62,5 125 500 125 Примітка: *МБсК - мінімальна бактеріостатична концентрація; **МБцК - мінімальна бактерицидна концентрація; X - зони затримки росту мікроорганізмів не спостерігається. 5 10 15 20 25 30 35 40 Аналіз даних таблиці свідчить про те, що ліпофільний комплекс з листя глоду м'якуватого має виражену протимікробну дію по відношенню до S. aureus, В. subtilis та помірну антимікробну дію по відношенню до P. aeruginosa. Даний спосіб отримання засобу антимікробної дії з листя глоду м'якуватого відрізняється від прототипу тим, що отриманий ліпофільний комплекс має антимікробну активність стосовно Staphylococcus aureus, Bacillus subtilus та Proteus vulgaris. Тобто, ліпофільний комплекс листя глоду м'якуватого має виразну антимікробну дію відносно грампозитивних та помірну до грамнегативних бактерій. Досліджуваний комплекс виявився не активним відносно С. albicans, Е. соlі та Р. aeruginosa. Отже, ліпофільний комплекс листя глоду м'якуватого є новою субстанцією рослинного походження антимікробної дії. Таким чином, заявлено спосіб одержання хлороформної витяжки з листя глоду м'якуватого з антимікробною дією. Заявлений спосіб простий, економічний, передбачає використання доступної сировини, є екологічно безпечним і може бути здійснений на будь-якому фармацевтичному підприємстві зі стандартним обладнанням. Ліпофільний комплекс з листя глоду м'якуватого, одержаний за заявленим способом, може бути використаний як лікарська субстанція при створенні антибактеріальних препаратів відносно S. aureus, В. subtilus та P. vulgaris у різних лікарських формах. Джерела інформації: 1. Пат. 89926 UA, МПК (2009) А61K 36/61 (2006.01), А61Р 31/00. Спосіб одержання засобу з антимікробною активністю з листя евкаліпту / Комісаренко А. М. - № а200903866; заявл. 21.04.2009; опубл. 10.03.2010, Бюл. № 5/2010. 2. Пат. 56037 UA, МПК (2009) А61K 36/76 (2006.01), А61Р 17/00. Спосіб одержання біологічно активних речовин з антимікробною, протизапальною та репаративною активністю / Національний фармацевтичний університет - № u201006279; заявл. 25.05.2010; опубл. 27.12.2010, Бюл. № 5/2006. 3. Пат. 64792 UA, МПК А61K 36/74 (2006.01), А61K 135/00 (2006.01), А61Р 31/04 (2006.01). Спосіб одержання ліпофільного комплексу антимікробної дії. / Національний фармацевтичний університет. - 3. u201102089; заявл. 22.02.2011; опубл. 25.11.2011, Бюл. №. 22/2011. 4. Кархут В.В. Ліки навколо нас. - Київ: Здоров'я, 1993. - с. 47-48. 5. Полетико О.М. Род 26. Боярышник - Crataegus L. //Деревья и кустарники СССР. Дикорастущие, культивируемые и перспективные для интродукции. / Ред. тома С. Я. Соколов. М. - Л.: Изд-во АН СССР, 1954. - Т. III. Покрытосеменные. Семейства Троходендроновые Розоцветные. - С. 559. - 872 с. 6. Вивчення специфічної активності протимікробних лікарських засобів: Метод. Реком. / Волинський Ю.Л., Гриценко І.С., Широбоков В.П. і співавт. - Київ, 2004. - 40 с. 7. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузным методом // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - Т. 3, № 4. - С. 348-355. 3 UA 113928 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 Застосування ліпофільного комплексу листя глоду м'якуватого (Crataegus submollis Sarg.), одержаного із застуванням хлороформу як екстрагенту, при співвідношенні сировина:екстрагент 1:8-1:10, як агента, що проявляє антимікробну дію. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4