Спосіб одержання поверхнево-активних речовин

Реферат: Винахід належить до способу одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення. Згідно винаходу у середовище додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Escherichia coli IEM-1. UA 114383 C2 (12) UA 114383 C2 Технічний результат полягає в тому, що запропонований спосіб дає змогу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). UA 114383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнологічної промисловості і стосується одержання мікробних поверхнево-активних речовин (ПАР), які можуть бути використані як антимікробні агенти у харчовій промисловості, медицині та сільському господарстві. Відомий спосіб одержання ПАР за допомогою штаму Pseudomonas sp. PS-17 [Пат. 10467 UA, МПК С 21 N 1/02. Штам Pseudomonas sp. SP-17 - продуцент позаклітинних біоПАР і біополімеру /Шульга О.М., Карпенко О.В., Елісєєв С.А., Щеглова Р.А., Вільданова-Марцишин Р.І.; Опубл. 25.12.96, Бюл. № 4]. Його недоліком є використання складного мінерального середовища з високим вмістом солей (12 г/л) для культивування продуцента, наявність у його складі факторів росту, а також невисокий вихід ПАР від субстрату. Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення (прототип) є спосіб одержання ПАР за допомогою Nocardia vaccinii IMB В-7405 [Пат. № 111045 UA, Спосіб одержання поверхнево-активних речовин /Пирог Т.П., Берегова Х.А., Никитюк Л.В. Опубл. 10.03.2016, Бюл. № 5], який включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі, як джерело вуглецевого живлення суміш глюкози масовою часткою 0,49-0,51 % і гліцерину об'ємною часткою 0,49-0,51 %. Недоліком цього способу є недостатньо високі антимікробні властивості синтезованих ПАР. В основу винаходу покладено задачу створення нового способу одержання ПАР, який покращує антимікробні властивості поверхнево-активних речовин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб одержання поверхнево-активних речовин включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 на рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого живлення. Згідно винаходу у середовище для біосинтезу поверхнево-активних речовин додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Escherichia соli IЕМ-1. Причинно-наслідковий зв'язок між запропонованими ознаками і очікуваним технічним результатом полягає в наступному. Внесення у середовище для біосинтезу ПАР суспензії живих або інактивованих клітин Е. coli IEM-1 дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). Спосіб здійснюється наступним чином. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO 3 - 0,5, MgSO4•7H2O - 0,1, СаСl2•2Н2О - 0,1, KН2РО4 - 0,1, FeSO4•7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Е. coli ІЕМ-1, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР. Інактивовані стерилізацією в автоклаві при 131°°С упродовж 1 год. клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) синтезованих ПАР у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). Приклад 1. Антимікробні властивості ПАР N vaccinii IMB В-7405 залежно від моменту внесення у середовище культивування живих клітин Е. coli ІЕМ-1 Культивування штаму IMB В-7405 здійснюють у рідкому мінеральному середовищі такого складу (г/л): NaNO3 - 0,5, MgSO4•7H2O - 0,1, СаСl2•2Н2О - 0,1, KН2РО4 - 0,1, FeSO4•7H2O - 0,001, дріжджовий автолізат - 0,5 % (об'ємна частка); рН 6,8-7,0. Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Е. coli IEM-1, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 год., суспендують у100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР на початку процесу і в кінці експоненційної фази росту. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Позаклітинні поверхнево-активні речовини виділяють так: культуральну рідину центрифугують (5000 g, 20 хв.) для відділення біомаси. 25 мл супернатанту переносять у циліндричну ділильну воронку об'ємом 100 мл, додають 5 мл 1 М НСІ, воронку закривають 1 UA 114383 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 пришліфованим корком і струшують упродовж 3 хв., далі додають ще 4 мл 1 М НСІ й 16 мл суміші хлороформу й метанолу (2:1) й струшують упродовж 5 хв. Отриману після екстракції суміш залишають у воронці для розділення фаз, після чого нижню фракцію збирають (органічний екстракт 1), а водну фазу ще раз екстрагують. При повторній екстракції у водну фазу додають 9 мл 1М НСІ й 16 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію ліпідів протягом 5 хв. Після розділення фаз збирають нижню фракцію, одержують органічний екстракт 2. На третьому етапі до водної фази додають 25 мл суміші хлороформу з метанолом (2:1) й проводять екстракцію як описано вище, при цьому одержують органічний екстракт 3. Екстракти 1-3 об'єднують і упарюють на роторному випарнику ИР-ІМ2 (Росія) при температурі 50° й абсолютному тиску 0,4 атм до постійної маси. Антимікробні властивості поверхнево-активних речовин аналізують за показником мінімальної інгібуючої концентрації. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють методом двократних серійних розведень у м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ). У стерильних умовах у 10 пробірок вносять по 1 мл середовища, у першу додають 1 мл розчину ПАР певної концентрації, після чого перемішують, відбирають 1 мл і переносять у наступну пробірку. Аналогічно проводять розведення для наступних дев'яти пробірок. З останньої пробірки відбирають 1 мл. Таким чином, кінцевий об'єм у кожній пробірці становить 1 мл (МПБ чи рідке сусло і розчин ПАР), а концентрація ПАР у кожній наступній пробірці знижується у 2 рази. Як контроль використовують 1 мл МПБ без додавання розчину ПАР. Далі у кожну з пробірок 5 6 вносять по 0,1 мл суспензії тест-культур (10 -10 КУО/мл), та перемішують. Пробірки інкубують впродовж 24 год. при 28-30 °C. Результати оцінюють візуально за помутнінням середовища: (+) - пробірки, в яких спостерігають помутніння середовища (ріст тест-культури), (-) - помутніння немає (ріст відсутній). Мінімальну інгібуючу концентрацію розчину ПАР визначають як середнє значення між концентраціями ПАР в останній пробірці, де ріст відсутній, і в попередній, де він наявний. Як тест-культури під час визначення антимікробних властивостей ПАР використовують штами бактерій (Escherichia coli IEM-1 і Bacillus subtilis БТ-2) з колекції живих культур кафедри біотехнології і мікробіології Національного університету харчових технологій. Значення мінімальної інгібуючої концентрації ПАР залежно від моменту внесення у середовище клітин бактерії-індуктора наведено у табл. 1. Наведені дані свідчать, що ПАР, синтезовані за внесення у середовище культивування продуцента ПАР суспензії живих клітин Е. coli IEM-1, проявляють вищі антимікробні властивості, ніж утворювані в аналогічних умовах без індуктора. Приклад 2. Вплив інактивованих клітин Е. coli IEM-1 на антимікробні властивостей ПАР N. vaccinii IMB В-7405. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють у середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Е. coli IEM-1, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і інактивують стерилізацією в автоклаві при 131°°С протягом 1 год. Інактивовані клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища у лаг-фазі (на початку процесу біосинтезу ПАР). 45 Таблиця 1 Мінімальна інгібуюча концентрація поверхнево-активних речовин N. vacсіnіі IMB В-7405, синтезованих за присутності живих клітин Е. coli IEM-1 Момент внесення клітин індуктора Лаг-фаза Кінець експоненційної Контроль (без індуктора) МІК (мкг/мл) щодо В. subtilis БТ-2 В. subtilis БТ-2 (спори) (вегетативні клітини) 15 30 80 60 80 120 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. 2 Е. coli IEM-1 6 40 80 UA 114383 C2 5 Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Як видно з наведених у табл. 2 даних, значення МІК ПАР, синтезованих за наявності інактивованих клітин Е. coli IEM-1, є в 2,4-5,7 разів нижчими, ніж показники, встановлені для ПАР, одержаних під час культивування N. vaccinii IMB В-7405 у середовищі без індуктора. Таблиця 2 Антимікробні властивості ПАР N. vaccinii IMB В-7405, синтезованих за присутності інактивованих клітин Е. coli IEM-1 Наявність клітин індуктора Інактивовані клітини Е. coli IEM-1 Контроль (без індуктора) МІК (мкг/мл) щодо В. subtilis БТ-2 В. subtilis БТ-2 (спори) Е.соlі ІЕМ-1 (вегетативні клітини) 30 50 14 80 120 80 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. 10 15 20 25 30 Приклад 3. Порівняння антимікробних властивостей ПАР N. vaccinii IMB В-7405, синтезованих в різних умовах культивування. Культивування N. vaccinii IMB В-7405 здійснюють у середовищі наведеного вище складу (див. приклад 1). Як джерело вуглецю використовують гліцерин у концентрації 1 % (об'ємна частка). Як посівний матеріал використовують культуру в експоненційній фазі, вирощену на середовищі наведеного складу з 0,5 % гліцерину. Інокулят, в якому чисельність бактерій 4 5 становить 10 -10 кл/мл, вносять у кількості 10 % від об'єму середовища. Е. coli IEM-1, вирощену на м'ясо-пептонному агаризованому середовищі упродовж 14 год., суспендують у 100 мл стерильної водопровідної води і вносять 2,5 мл суспензії на 100 мл середовища культивування продуцента ПАР на початку процесу. Інактивовані стерилізацією в автоклаві при 131°°С упродовж 1 год. клітини вносять з розрахунку 10 мл суспензії на 100 мл поживного середовища. Згідно прототипу як джерело вуглецевого живлення використовують суміш глюкози масовою часткою 0,5 % і гліцерину об'ємною часткою 0,5 %. Як посівний матеріал використовують культуру з експоненційної фази росту, вирощену на середовищі наведеного складу, що містить суміш гліцерину (0,25 %, об'ємна частка) і глюкози (0,25 %, масова частка). Кількість інокуляту 5 % від об'єму середовища. Культивування бактерій здійснюють в колбах об'ємом 750 мл із 100 мл середовища на качалці (320 об/хв.) при 28 °C упродовж 120 год. Виділення ПАР і визначення мінімальної інгібуючої концентрації здійснюють як описано у прикладі 1. Значення МІК поверхнево-активних речовин, синтезованих під час культивування N. vaccinii IMB В-7405 в умовах згідно нового способу і прототипу наведено у табл. 3. 3 UA 114383 C2 Таблиця 3 Антимікробні властивості ПАР, синтезованих в різних умовах культивування N. vaccinii IMB В-7405 МІК (мкг/мл) щодо В. subtilis БТ-2 В. subtilis БТ-2 (вегетативні клітини) (спори) Умови культивування Згідно запропонованого способу (індуктор живі клітини Е. coli IEM-1) Згідно запропонованого способу (індуктор інактивовані клітини Е. coli IEM-1) Згідно прототипу Е. coli IEM-1 15 30 6 30 50 14 80 120 80 Примітка: Під час визначення МІК похибка не перевищувала 5 %. Отже, використання нового способу дає змогу знизити мінімальну інгібуючу концентрацію синтезованих ПАР порівняно з прототипом у 2,4-13 разів (до 6-50 мкг/мл). 5 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб одержання поверхнево-активних речовин, що включає культивування штаму Nocardia vaccinii IMB В-7405 у рідкому середовищі, що містить мінеральні солі і джерело вуглецевого 10 живлення, який відрізняється тим, що у середовище додатково вносять суспензію живих або інактивованих клітин Escherichia coli IEM-1. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4