Спосіб біотестування токсичності вод природного походження, питного водопостачання та сільськогосподарського призначення

Реферат: Спосіб біотестування токсичності вод за допомогою рослинної і тваринної форм тест-організмів - листків валіснерії від однієї материнської рослини та 24-годинних дафній, причому для проведення експрес-оцінки вод використовуються чутливі до низьких рівнів їх забруднень тестознаки частота серцевих скорочень (ЧСС) дафній і швидкість руху хлоропластів (ШРХ) у клітинах листків валіснерії. UA 115502 U (12) UA 115502 U UA 115502 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до сфери біологічних методів тестування об'єктів навколишнього середовища і може бути застосована у таких галузях як екологія, охорона довкілля, сільське та комунальне господарство для експрес-оцінки вод (поверхневих, підземних, питних, для напування тварин і поливу рослин) та обґрунтування можливості їх використання за основним призначенням. Забруднення природних та питних вод в наш час є однією з глобальних проблем суспільства [1]. Тому пріоритет необхідно надавати заходам, спрямованим на підвищення ефективності контролю, здатного своєчасно виявляти основні негативні впливи та відтворювати реальний стан щодо безпеки використання природної води та вживання питної води споживачами. При здійсненні такого контролю доцільно посилити роль біологічного тестування методу, який має ряд переваг порівняно з іншими: є доступним і простим у виконанні, не вимагає складного обладнання, належить до найдієвіших та найшвидших способів визначення сукупної дії токсичних речовин, що містяться у воді [2]. За тест-об'єкти можуть бути взяті істоти практично всіх таксономічних груп від бактерій до ссавців. Проте у існуючих дослідженнях перевага завжди надається уніфікованим організмам, за участю яких розроблено стандартні досліди. Серед них найчастіше використовуються водорості, інфузорії, дафнії, церіодафнії, гуппі, форель, цибуля звичайна, салат посівний тощо [2-5]. Протягом тривалого часу зазначені тест-об'єкти застосовувалися для визначення токсичності природних та стічних вод, а з розробкою ДСанПіНу 2.2.4-171-10 їх використання було "перенесено" і на питну воду [3]. Однак для біотестування якості води з джерел водопостачання та питної води, що є значно чистішими порівняно з іншими водами, традиційні тест-ознаки організмів (іммобілізація дафній і церіодафній), довжина кореневого пучка рослин, показники проростання насіння тощо) виявилися недостатньо інформативними. При цьому був визначений ряд недоліків, що не дозволяють з високою ефективністю здійснювати за їх допомогою експрес-оцінку токсичності малозабруднених вод: - недостатня чутливість організмів при застосуванні традиційних тест-реакцій до відносно малих концентрацій забруднюючих речовин у воді; - використання поодиноких видів уніфікованих організмів, у той час, коли відомо, що різні види істот можуть неоднаково реагувати на одні і ті ж самі забруднюючі речовини; - проведення досліджень протягом відносно тривалого часу у декілька етапів (наприклад, за іммобілізацією дафній, яку визначають через кожні 6 год. з 6-ої по 96-ту год.). Враховуючи вказані особливості та існуючі в літературі дані про суттєве підвищення ефективності біотестування за рахунок використання одночасно тваринної і рослинної форм організмів [2,4,5,9], вважаємо за необхідне створити набір тест-об'єктів, які були б більш чутливими до забруднюючих речовин у воді, ніж загальноприйняті, і дозволили за короткий термін часу визначати рівень токсичності води. Запропонована нами корисна модель призначена для дослідження вод, які не повинні бути занадто токсичними, проте можуть у певні періоди зазнавати впливу забруднюючих речовин. Для виявлення їх сумарної дії доцільно застосувати тест-набір з рослинної і тваринної форм, який до того ж, завдяки підвищеній чутливості вибраних показників, буде швидко реагувати навіть на незначні рівні забруднення води. За прототип корисної моделі нами вибрано стандарт підприємства СТП 17-08, затверджений на КП "Житомирводоканал", який складається з двох методів [9]. Метод № 1, у якому як тест-організм використано Vallisneria spiral is L., полягає у проведенні цитофізіологічної експрес-оцінки токсичності води (біотестування) протягом 1,5-2 год. і ґрунтується на способі визначення токсичності водного середовища, запропонованого Н.М. Смірновою та Л.Я. Сіренко [10]. Метод № 2, у якому як тест-організм використано Daphnia magna S., є уніфікованим і розрахований на визначення іммобілізації істот протягом 24 та 48 годин [3,6,9]. Недоліками даного стандарту є неузгодженість між вказаними методами: велика різниця у часі експозиції організмів, більш висока чутливість валіснерії за показником швидкості руху протоплазми (ШРП) клітин її листків до токсичних компонентів води порівняно з показником іммобілізації Daphnia magna S., незручність у виготовленні мікропрепаратів із спірально закручених листків Vallisneria spiralis L., оцінка токсичності води за різними шкалами. Виходячи з цього, ми розробили корисну модель, у якій вдалося оптимізувати процес біотестування на рослинній і тваринній формах, та запропонували оригінальну шкалу, яка узгоджується з ДСанПіН 2.2.4-171-10. Задачею корисної моделі є розробка способу біотестування для експрес-оцінки потенційної небезпеки вод природного походження, питного водопостачання та сільськогосподарського призначення через використання набору тест-об'єктів, що складається з уніфікованої тваринної (Daphnia magna S.) та додаткової рослинної {Vallisneria gigantea Graeb.) форм. 1 UA 115502 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Поставлена задача вирішується шляхом визначення ознак, що характеризують тест-реакцію організмів: у дафній - частоти серцевих скорочень (ЧСС), у валіснерії - швидкості руху хлоропластів (ШРХ) у клітинах її листків. На основі зазначених показників згідно вимог ДСанПіНу 2.2.4-171-10 розраховується індекс токсичності води (Т) і виводиться для обох форм як середнє арифметичне інтегральний індекс токсичності (ІТ). Для вирішення поставленої задачі нами проведено лабораторний дослід з біотестування токсичності води, проби якої були відібрані у підготовлений посуд, згідно із ГОСТ Р 51592-2000 [11] з водосховищ р. Тетерів, резервуарів чистої води (РЧВ) та водопровідної мережі на КП "Житомирводоканал". Для дослідження проби води переливали у хімічні скляночки (100 мл) і формували контрольну та дослідні групи за наступною схемою: - контрольна група - проби відстояної (24 год.) водопровідної води; - дослідна група Д-1: проби води - з водосховища Денишівського; - дослідна група Д-2: проби води - з водозабору Відсічне; - дослідна група Д-3: проби води - з РЧВ 5 000 м; - дослідна група Д-4: проби води - з РЧВ 20 000 м. Тест-об'єкти: 24-годинна молодь дафній (аналоги за віком та розміром) та листки валіснерії (аналоги за походженням та довжиною). Тест-ознаки: ЧСС у активних дафній (Daphnia magna S.) та ШРХ у клітинах листків валіснерії (Vallisneria gigantea G.). Біотестування - включаючи експонування тест-організмів (3 год.), підготовку до мікроскопіювання дафній in vivo (протягом 0,75 год.) та виготовлення мікропрепаратів з листків валіснерії (протягом 1,2 год.) Дослід проводили у трикратній повторності при температурі води +20 °C±2 °C та інших ідентичних умовах. Кожну особину дафній піпеткою виймали з проби води, що тестувалась, розміщували на предметному склі у краплі тої самої води і під мікроскопом підраховували ЧСС протягом 30 с з подальшим перерахунком на 1 хв. і визначенням середньої арифметичної. Паралельно з цим, за таких самих умов, готували мікропрепарати з листків валіснерії, медіальна частина кожного з яких слугувала поверхнею для отримання п'яти зрізів із подальшим розміщенням їх на предметному склі у краплі протестованої води. Для розрахунку ШРХ за допомогою секундоміра під мікроскопом фіксували час проходження хлоропластом однієї або декількох поділок окуляр-мікрометра. ШРХ розраховували за такою формулою: V=l/t, де V - швидкість руху хлоропласту, мкм/с; l - шлях, який пройшов хлоропласт, мкм; t - час проходження хлоропластом однієї чи декількох поділок окуляр-мікрометра, с Отримані дані порівнювали з контролем. Для кожної дослідної проби води розраховували індекс токсичності (%) за ДСанПіН 2.2.4-171-10 [3], використовуючи наступну формулу: Τ=(Ικ-Ιο)·100/Ικ, де: Τ - індекс токсичності, %; Ік - величина тест-реакції дафній та валіснерії у контролі; Іо - величина тест-реакції дафній та валіснерії у досліді. Порівняльний аналіз екологічної ефективності способів біотестування проб води, відібраних у водосховищах р. Тетерів та резервуарах чистої води на КП "Житомирводоканал" представлений у табл.: 45 Таблиця Порівняльний аналіз способів біотестування проб води, відібраних з водосховищ р. Тетерів та резервуарів чистої води на КП "Житомирводоканал" Дослідні групи та показники Тест-ознаки Д-1 (водосховище Денишівське) Д-2 (водозабір Відсічне) Базовий спосіб (прототип), Т (%) Daphnia Vallisneria magna S. spiralis L. IМ ШРХ відсутня 22,1 відсутня 15,9 2 ІТ, % 22,1 ДРТ 15,9 ДРТ Запропонований спосіб, Т (%) ІТ, % Daphnia Vallisneria magna S. gigantea G. ЧСС ШРХ 31,8 35,4 28,3 HPT 26,1 27,6 24,5 HPT UA 115502 U Таблиця Порівняльний аналіз способів біотестування проб води, відібраних з водосховищ р. Тетерів та резервуарів чистої води на КП "Житомирводоканал" Дослідні групи та показники Базовий спосіб (прототип), Т (%) Daphnia Vallisneria magna S. spiralis L. ІТ, % Запропонований спосіб, Т (%) ІТ, % Daphnia Vallisneria magna S. gigantea G. 21,8 24,1 19,4 ДРТ 26,1 26,2 25,9 HPT 3 3 Д-3 (РЧВ 5 000) відсутня 12,5 Д-4 (РЧВ 20 000) відсутня 16,1 48 2 12,5 ДРТ 16,1 ДРТ 0,5 1 0,75 1,2 10 10 15 15 Тривалість експозиції, год. Підготовка до біотестів та визначення ЧСС і ШРХ, год. Кількість дослідних об'єктів (n) Умовні позначення: Τ - індекс токсичності води (по відношенню до контролю); ΙΤ - інтегральний індекс токсичності води; ІМ - іммобілізація (стан нерухомості) дафній; ШРХ - швидкість руху хлоропластів у клітинах листків валіснерії; ЧСС - число серцевих скорочень у дафній; рівні токсичності води: ДРТ - допустимий, НРТ - низький 5 10 15 20 25 30 Дані таблиці свідчать про те, що запропонована корисна модель є більш ефективною порівняно з прототипом як за визначенням токсичності води, так і технікою виконання, включаючи час проведення досліду та вірогідність отриманих результатів. За даними біотестування нами розроблено шкалу рівнів токсичності води, що є більш зручною, ніж у прототипі [10], і яка повністю узгоджується з ДСанПіН 2.2.4-171-10. При її створенні було враховано, що індекс токсичності води не повинен перевищувати 50 % незалежно від тест-об'єктів, що використовуються [3-5]: 1-25 % - допустимий рівень токсичності; 26-50 % - низький рівень токсичності; 51-75 % - середній рівень токсичності; 76-100 % - високий рівень токсичності. Таким чином, запропонований нами спосіб біотестування у порівнянні з аналогічними є більш чутливим, швидким і точним у визначенні, простішим у виконанні і дозволяє адекватно оцінювати впливи антропогенних факторів на води різного походження за наявності невисоких рівнів їх забруднення. Джерела інформації: 1. Запольський А.К. Охорона питних вод від виснаження і забруднення / А.К. Запольський, І.В. Шумигай // Агроекологічний журнал. - 2015. - №3, - С. 6-15. 2. Скок С.В. Оцінювання якості питної води м. Херсона методом біотестування / С.В. Скок // Агроекологічний журнал. - 2015. - № 2. - С. 26-30. 3. ДСанПіН 2.2.4-171-10. "Гігієнічні вимоги до води питної, призначеної для споживання людиною" / № 452 / 17747. - Міністерство охорони здоров'я України. Державні стандартні норми та правила / [чинний від 1.07.2010 p.]. - 50 с. 4. Пат. № 67315 А Україна, МПК G01N 33/18. Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища / В.В. Архипчук, Н.М. Гаранько, В.В. Гончарук; заявник та патентовласник Інститут колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАНУ. - № 2003088029; заявл. 28.08.2003, опубл. 15.02.2006. 5. Стецюк Л.М. Використання методів біоіндикації та біотестування для оцінки стану водних екосистем / Л.М. Стецюк // Вісник Національного університету водного господарства та природокористування. - Вип. 2 (62). "Сільськогосподарські науки", 2013. - С. 175-181. 6. ДСТУ 4173-2003. Якість води. Визначання гострої летальної токсичності на Daphnia magna Straus та Ceriodaphnia affinis Lilljeborg (Cladocera, Crustacea) (ISO 6341:1996, MOD). 3 UA 115502 U 5 10 7. Кулагина К.В. Исследование зависимости частоты сердечных сокращений Daphnia magna от концентрации пестицидов // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 3 - С. 191-197. 8. Пат. № 20031211812 Україна A01G 7/00 (2006.01). Спосіб визначення впливу хімічних речовин на функціональний стан рослин / B.C. Стружко, B.C. Феденко. - опубл. 15.11.2004. 9. СТП 17-08 Методика. Цитофізіологічна експрес-оцінка токсичності води (Біотестування) / Комунальне підприємство Житомирське виробниче управління водопровідно-каналізаційного господарства / Житомир: [дійсний від 10.09.2008 р.]. - 2008. - 15 с. 10. Пат. № 3918 Україна. Спосіб визначення токсичності водного середовища / Н.М. Смірнова, Л.Я Сіренко. - опубл. 27.12.1994. 11. Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов. - М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002. 118 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 25 30 35 1. Спосіб біотестування токсичності вод за допомогою рослинної і тваринної форм тесторганізмів - листків валіснерії від однієї материнської рослини та 24-годинних дафній, який відрізняється тим, що для проведення експрес-оцінки вод використовуються чутливі до низьких рівнів їх забруднень тест-ознаки частота серцевих скорочень (ЧСС) дафній і швидкість руху хлоропластів (ШРХ) у клітинах листків валіснерії. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що біотестування вод за тест-ознакою ШРХ здійснюється під час мікроскопіювання препаратів, отриманих шляхом зрізання п'яти пластин з медіальної частини листків Vallisneria gigantea Graebner і розміщених на предметному склі у краплі тої самої води, у якій листки попередньо експонувались протягом 1 год. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що біотестування вод за тест-ознакою ЧСС Daphnia magna Straus здійснюється протягом 30 с під часмікроскопіювання кожної особини, розміщеної на предметному склі у краплі тої самої води, у якій дафнії попередньо експонувались 3 год. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що крім визначення за обома тестознаками загальноприйнятих при біотестуванні індексів токсичності вод за ДСанПіН 2.2.4-17110, як їх середньоарифметичне значення розраховано також інтегральний індекс токсичності, що дає можливість враховувати одночасно реакції рослинних і тваринних організмів на дію вод однакової якості. 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що для оцінювання результатів біотестування вод розроблено шкалу рівнів токсичності, яка враховує величини індексів токсичності, відповідно до ДСанПіН 2.2.4-171-10, і за якою небезпечним є рівень токсичності вод понад 50 % незалежно від тест-об'єктів, що використовуються. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4