Спосіб укорінення in vitro рослин видів carlina cirsioides klok. та carlina onopordifolia bess. ex szaf., kulcz. et pawl.

Реферат: Спосіб укорінення in vitro рослин видів Carlina cirsioides та Carlina onopordifolia включає вкорінення рослин in vitro з використанням регулятора росту рослин - індол-3-масляної кислоти (ІМК). Насіння рослин відкасників замочують у розчині ІМК концентрацією 100-1000 мг/л, витримують у ньому протягом 2-4 год.; після чого насіння стерилізують у 15 %-му розчині Н2О2 і висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з половинним вмістом макро- та мікросолей (МС/2) без регуляторів росту для проростання та тримання рослин. UA 116640 U (12) UA 116640 U UA 116640 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології та екології і може бути використана для покращення укорінення отриманих in vitro рослин видів роду Відкасник (Carlina L.), а також у дослідженнях з фізіології, ембріології, морфогенезу рослин цього роду. Відкасник татарниколистий (Carlina onopordifolia Bess, ex Szaf., Kulcz. et Pawl.) та відкасник осотоподібний (Carlina cirsioides Klok.) - ендемічні реліктові види, занесені до Червоного списку МСОП, Європейського червоного списку та Додатку І Бернської конвенції [2], а також занесені у Червону книгу України (2009 р.) під статусом "вразливі" [6]. Представники роду Carlina мають значний практичний інтерес, оскільки є цінною лікарською сировиною [4]. Причиною порушення структури та зникнення популяцій відкасників є заготівля кореневищ для потреб народної медицини, випас худоби, заліснення схилів, часті випалювання травостою та низька екологічна пластичність видів. Тому етап введення рослин відкасника в культуру in vitro є одним із початкових при проведенні біотехнологічних робіт з культивування та збереження цих рідкісних, ендемічних та зникаючих видів рослин. Відомо, що процес коренеутворення (ризогенез) і подальша адаптація до ґрунтових умов є найбільш складними етапами при культивуванні рослин в умовах in vitro для будь-якого рослинного матеріалу. Ця проблема стосується і рослин роду Carlina, проростки та регенеранти яких характеризуються особливо низьким ризогенезом та адаптаційною здатністю, у зв'язку із особливостями будови кореня [1]. Відомий спосіб вкорінення С. acaulis in vitro з використанням регуляторів росту індол-3масляної кислоти (ІМК), індол-3-оцтової кислоти (IOК) або 1-нафтилоцтової кислоти (НОК), які вносять у живильне середовище Мурасіге і Скуга з повним або з половинним вмістом макро- та мікросолей (скорочена назва МС/2) [7]. Використання цього способу вкорінення для видів С. onopordifolia та С. cirsioides не дало позитивних результатів. Відсоток вкорінення рослин цих видів становив 33,3 % та 28,6 % відповідно. При довготривалому культивуванні рослин на живильних середовищах погано формувалася коренева система, а у окремих випадках вона була відсутня; натомість на висаджених пагонах утворювався калюс та відбувалося поступове накопичення речовин токсичної дії (фенольних сполук) [3]. Найбільш близьким аналогом є спосіб стимулювання коренеутворення у С. onopordifolia [8]. Стерильні проростки відкасників обробляли розчином ІМК концентраціями 10 мг/л, 100 мг/л або 1000 мг/л протягом 60 с. При замочуванні проростків у різних концентраціях ІМК, відсоток формування коренів становив 70 %, 52,7 % і 84,8 % відповідно [8]. Даний спосіб вибрано як найближчий аналог. До недоліків найближчого аналога слід віднести наступні: для кожного виду рослин необхідно підбирати свій режим замочування (концентрацію розчину ІМК та час витримування у ньому), що значно ускладнює процес вирощування рослин з живців; значне травмування проростків під час цієї процедури; необхідна наявність стерильного розчину ІМК у достатній кількості та асептичні умови; неможливість багаторазового використання стерильного розчину регулятора росту, оскільки він швидко інфікується та при повторній стерилізації при високих температурах як термолабільна сполука розкладається; трудомісткість процесу отримання та вкорінення рослин відкасників, що значно збільшує собівартість такого способу. В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу створити спосіб стимуляції коренеутворення у проростків відкасників шляхом замочування насіння цих видів у розчинах регуляторів росту, які забезпечать покращення основних параметрів вкорінення рослин, прискорять розвиток кореневої системи і спростять процес пересаджування та вирощування рослин in vitro. Як результат, значно зменшиться травмування рослинного матеріалу, а також скоротяться матеріальні та трудові витрати на проведення цих робіт. Поставлена задача вирішується тим, що у способі укорінення in vitro рослин видів Carlina cirsioides та Carlina onopordifolia, що включає вкорінення рослин in vitro з використанням регулятора росту рослин - індол-3-масляної кислоти, відповідно до корисної моделі, насіння рослин відкасників замочують у розчині ІМК концентрацією 100-1000 мг/л, стерилізують у 15 %му розчині Н2О2 і висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з половинним вмістом макро- та мікросолей (МС/2) без регуляторів росту для проростання та отримання рослин. Спосіб здійснюють таким чином. - приготувати нестерильний розчин ІМК концентрацією 100-1000 мг/л. Зважити необхідну кількість ІМК, розчинити у 1 мл 50 % С2Н5ОН та довести розчин дистильованою водою до необхідної концентрації. - насіння відкасників, поміщене у "мішечки" із тканини, замочити у приготовленому розчині ІМК і витримувати у ньому протягом 2-4 год. - насіння, що знаходиться у "мішечках" із тканини, відмити від регулятора росту рослин у стерильній дистильованій воді протягом 30-40 хв. 1 UA 116640 U 5 10 15 20 25 30 - здійснити поверхневу стерилізацію насіння 96 %-им етанолом протягом 10-15 с та витримати у 15 %-му розчині Н2О2 протягом 20 хв. - насіння, що знаходиться у "мішечках" із тканин, відмити від стерилізуючого розчину у стерильній дистильованій воді протягом 30-40 хв. - приготувати живильне середовище Мурасіге і Скуга з половинним вмістом макро- та мікросолей (МС/2) без регуляторів росту. У приготованому середовищі довести рН до 5,7. Колби із середовищем автоклавувати протягом 15 хв при тиску в одну атмосферу. В асептичних умовах розлити приготоване середовище у чашки Петрі по 20-25 мл. - простерилізоване насіння висадити у стерильні чашки Петрі на стерильне живильне середовище МС/2 без регуляторів росту та пророщувати його за умови 16-годинного світлового періоду при інтенсивності освітлення 1500-2000 лк, температурі 20-22 °C та вологості повітря 70-80 %. Експериментально оцінено ефективність використання регуляторів росту рослин (гіберелової кислоти (ГК3), ІМК) у різних концентраціях для проведення вкорінення проростків in vitro рослин роду Відкасник. Використання ІМК на етапі підготовки насіння до висаджування дасть змогу отримати значну кількість вкорінених рослин цього виду. Застосування інших регуляторів росту чи їх відсутність не забезпечить позитивного результату. Приклади конкретного використання запропонованого способу. Приклад 1. Вкорінення in vitro проростків відкасників, отриманих із насіння, попередньо не обробленого регуляторами росту рослин. Насіння відкасників замочували у дистильованій воді протягом 24 год., далі поверхнево стерилізували 96 %-им етанолом протягом 10-15 с; витримували у 15 %-му розчині Н2О2 протягом 20 хв, промивали стерильною дистильованою водою протягом 30-40 хв. Простерилізоване насіння висаджували у стерильні чашки Петрі на стерильне агаризоване живильне середовище МС/2 без регуляторів росту та пророщували його за умови 16-годинного світлового періоду при інтенсивності освітлення 1500-2000 лк, температурі 20-22 °C та вологості повітря 70-80 %. Схожість насіння для обох видів - С. cirsioides та С. onopordifolia - при цьому становила 100 %. Відсоток формування коренів для них також був однаковим і складав 33,3 % (таблиця). Таблиця Результати схожості насіння та вкорінення рослин видів роду Carlina Вид С. cirsioides С. onopordifolia 35 40 45 Відсутня обробка Обробка ГК3, 1000 мг/л Обробка ІМК, 1000 мг/л стимуляторами формування формування формування схожість схожість схожість коренів у коренів у коренів у насіння, % насіння, % насіння, % проростків, % проростків, % проростків, % 33,3 100 33,3 100 100 85,7 33,3 100 22,2 100 100 100 Приклад 2. Вкорінення in vitro проростків відкасників, отриманих із насіння, попередньо обробленого ГК 3 концентрацією 100-1000 мг/л. Готували нестерильний розчин ГК3 концентрацією 100-1000 мг/л та замочували поміщене у "мішечки" насіння відкасників у приготовленому розчині протягом 16-24 год. Відмивали поміщене у "мішечки" насіння у стерильній дистильованій воді, далі поверхнево стерилізували 96 %-им етанолом протягом 10-15 с; витримували у 15 %-му розчині Н2О2 протягом 20 хв, промивали стерильною дистильованою водою протягом 30-40 хв. Простерилізоване насіння висаджували у стерильні чашки Петрі на стерильне агаризоване живильне середовище МС/2 без регуляторів росту та пророщували його за умови 16-годинного світлового періоду при інтенсивності освітлення 1500-2000 лк, температурі 20-22 °C та вологості повітря 70-80 %. Схожість насіння як для С. cirsioides, так і для С. onopordifolia становила 100 %. Відсоток формування коренів у проростків С. cirsioides дорівнював 33,3 %, у С. onopordifolia-22 % (таблиця). Приклад 3. Вкорінення in vitro проростків відкасників, отриманих із насіння, попередньо обробленого ІМК концентрацією 100-1000 мг/л. 2 UA 116640 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Готували нестерильний розчин ІМК концентрацією 100-1000 мг/л та замочували поміщене у "мішечки" насіння відкасників у приготовленому розчині протягом 2-4 год. Відмивали поміщене у "мішечки" насіння у стерильній дистильованій воді, далі поверхнево стерилізували 96 %-им етанолом протягом 10-15 с; витримували у 15 %-му розчині Н2О2 протягом 20 хв, промивали стерильною дистильованою водою протягом 30-40 хв. Простерилізоване насіння висаджували у стерильні чашки Петрі на агаризоване живильне середовище МС/2 без регуляторів росту та пророщували його за умови 16-годинного світлового періоду при інтенсивності освітлення 15002000 лк, температурі 20-22 °C та вологості повітря 70-80 %. Схожість насіння для обох видів - С. cirsioides та С. onopordifolia - при цьому становила 100 %. Відсоток формування коренів у проростків С. cirsioides становив 85,7 %, у С onopordifolia100 % (таблиця). Відсоток формування коренів при замочуванні у розчині ІМК 1000 мг/л для С. cirsioides був у 3 рази вищим у порівнянні з двома іншими прикладами (1 і 2), для С. onopordifolia цей відсоток був у 3 і 4,5 рази вищим, порівнюючи із прикладом 1 (без замочування у регуляторах росту) та прикладом 2 (за обробки ГК3 концентрацією 1000 мг/л) відповідно (таблиця). Тому найефективнішим із запропонованих способів формування кореневої системи у рослин роду Carlina є замочування насіння цих видів у розчині ІМК. Таким чином, запропонований спосіб укорінення in vitro рослин видів С cirsioides та С. onopordifolia дозволяє: 1) скоротити, порівняно із відомими способами, матеріальні витрати завдяки використанню нестерильного розчину ІМК у 12-15 разів; 2) вкорінювати в умовах in vitro ендемічні реліктові види рослин, у яких добре розвинута стрижнева коренева система; 3) підвищити відсоток вкорінення in vitro рослин С. cirsioides та С. onopordifolia до 100 %: 4) знизити трудомісткість процесу та зменшити затрати часу для виконання поставленого завдання у 4 рази, що сприятиме прискоренню технологічного циклу вирощування; 5) уникнути травмування проростків, порівняно із відомим способом; 6) багаторазово використовувати нестерильний розчин ІМК; 7) уникнути змін концентрації розчину ІМК, що можуть виникати під час стерилізації при високих температурах, шляхом використання нестерильного розчину цього регулятора росту. Джерела інформації: 1. Гавриленко Н.О. Інтродукція відкасника татарниколистого Carlina onopordifolia Bess, ex Szaf., Kulcz. et Pawl, в дендропарку Асканія-Нова / Н.О. Гавриленко, Л.О. Слепченко // Біосферний заповідник "Асканія-Нова" імені Ф.Е. Фальц-Фейна НААН України. - 2010. 2. Конвенція про охорону дикої флори і фауни та природних середовищ існування в Європі (Берн, 1979 p.). - К., 1998. 3. Кравець Η. Введення в культуру in vitro Carlina onopordifolia Bess, ex Szaf., Kulcz. et Pawl та Carlina cirsioides Klok / H. Кравець, Η. Дробик // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Інтродукція та збереження рослинного різноманіття. - 2016. - Вип. 34, № 1. - С. 61-65. 4. Лікарські рослини: Енциклопедичний довідник / Відп. ред. A.M. Гродзінський. - К.: Укр. Енциклопедія ім. М.П. Бажана, 1992. - 544 с. 5. Мацку Я. Атлас лекарственных растений / Я. Мацку, И. Крейча. - Изд-во Веда (Словацкая АН), 1981. - 418 с. 6. Червона книга України. Рослинний світ / [відп. за ред. Я.П. Дідух]. - К.: Глобалконсалтинг, 2009. - 900 с. 7. Trejgell A. Micropropagation of Carlina acaulis L. [Text] / A. Trejgell, M. Bendarek, A. Tretyn // Acta Biol. Cracov. - 2009. - Vol. 51, № 1. - P. 97-103. 8. Trejgell A. Shoot multiplication and in vitro rooting of Carlina onopordifolia Basser [Text] / A. Trejgell, A. Tretyn // Acta Biol. Cracov. - 2011. - Vol. 53, № 2. - P. 68-72. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб укорінений in vitro рослин видів Carlina cirsioides та Carlina onopordifolia, що включає вкорінення рослин in vitro з використанням регулятора росту рослин - індол-3-масляної кислоти (ІМК), який відрізняється тим, що насіння рослин відкасників замочують у розчині ІМК концентрацією 100-1000 мг/л, витримують у ньому протягом 2-4 год.; після чого насіння стерилізують у 15 %-му розчині Н2О2 і висаджують на живильне середовище Мурасіге і Скуга з половинним вмістом макро- та мікросолей (МС/2) без регуляторів росту, пророщують його за умови 16-годинного світлового періоду при інтенсивності освітлення 1500-2000 лк, температурі 20-22 °C та вологості повітря 70-80 %. 3 UA 116640 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4