Спосіб прогнозування перебігу мінімальної залишкової хвороби у хворих на рак шлунка із зайвою вагою

Реферат: Спосіб прогнозування перебігу мінімальної залишкової хвороби у хворих на рак шлунка із зайвою вагою включає визначення кількості дисемінованих пухлинних клітин у кістковому мозку і рівня гіпоксії у первинній пухлині. При цьому додатково визначають вагу хворого та кількість пухлино-асоційованих адипоцитів в пухлинній тканині і при наявності великої їх кількості (більше ніж 26,4 %) прогнозують особливо несприятливий перебіг захворювання. UA 121683 U (12) UA 121683 U UA 121683 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, а саме - до онкології, і може використовуватись для врахування впливу ожиріння на перебіг пухлинного процесу, яке є найбільш поширеним серед людей, особливо похилого віку, що повинно поліпшити ефективність прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка (РШ), і надасть можливість індивідуалізувати лікувальні заходи для таких пацієнтів та змінити терапевтичні режими з урахуванням особливостей їх обміну речовин. Встановлений тісний зв'язок між ожирінням та виникненням пухлин, їх ростом та злоякісною прогресією. Існують певні особливості як перебігу пухлинного процесу у людей з надмірною вагою і ожирінням, так і їх лікуванням. Згідно з рекомендаціям ВОЗ і МОГ хворих розподіляють за масою тіла (ІМТ) наступним чином: ІМТ до 25 вважається нормою, а ІМТ >25>30 - надмірна вага і ожиріння. Встановлено, що ожиріння асоціюється і з РШ. Адипоцити, клітини жирової тканини, знаходячись в мікрооточенні пухлинних клітин, набувають глибоких змін у своєму фенотипі і такі, так звані, пухлино-асоційовані адипоцити (ПАА) сприяють інвазії пухлинних клітин і метастазуванню. Для РШ використовують низку прогностичних показників, серед яких найпоширенішими є показники системи TNM [1], рівень гіпоксії первинної пухлини [2], а також кількість дисемінованих пухлиних клітин (ДПК) у кістковому мозку (KM) хворих [3]. На сьогодні в лікувальних заходах, які застосовують, не враховуються особливості пухлинного процесу та відповідь пухлини на терапію у людей із зайвою вагою, особливо при ожирінні. Врахування ваги тіла хворих та знання вмісту адипоцитів в пухлинній тканині надасть можливість передбачити прогноз перебігу захворювання, навіть при умовах високої агресивності пухлини з метою розробки індивідуалізованого лікування. За прототип прийнято спосіб застосування показника кількості дисемінованих пухлиних клітин у кістковому мозку хворих на рак шлунка, (Disseminated tumor cells in bone marrow of gastric cancerpatients: correlation With tumor hypoxia and clinical relevance / L. Bubnovskaya, A. Kovelskaya, L.Gumenyuk [at al.J / Journal of Oncology. - 2014. Vol. 2014, Article ID 582140. - 8 p.), за яким за допомогою імуноцитохімічного методу визначають маркер прогнозу перебігу мінімальної залишкової хвороби, пов'язаного з рівнем гіпоксії первинної пухлини. Позитивним у прототипі є те, що застосований метод характеризується високим рівнем селективності, що асоціюється з рівнем гіпоксії пухлини. Недоліками прототипу є те, що наявність дисемінованих пухлинних клітин у кістковому мозку та рівень гіпоксії в первинній пухлині як маркери прогнозу не співвідносять з індексом маси тіла хворих та не враховують вміст адипоцитів в первинній пухлині. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб прогнозування перебігу мінімальної залишкової хвороби у хворих на рак шлунка із зайвою вагою шляхом врахування показника маси тіла хворих та кількості пухлино-асоційованих адипоцитів в пухлині додатково до визначення кількості дисемінованих пухлиних клітин у кістковому мозку і показника рівня гіпоксії в пухлинній тканині, що дасть можливість оцінити можливий перебіг захворювання у хворих із зайвою вагою, особливо при ожирінні, своєчасно корегуючи схеми індивідуального лікування з урахуванням особливостей обміну речовин у таких хворих, шляхом змін терапевтичних режимів, що покращить показники виживаності у пацієнтів цієї категорії. Поставлена задача вирішувалася наступним чином: За 1-2 доби до оперативного втручання в результаті стандартної процедури пункції КМ із стернальної кістки отримували пунктат KM, з якого виділяли мононуклеарні клітини та зберігали їх при температурі -20 °C до часу використання. Мононуклеарні клітини наносились на скельця в процесі центрифугування на цитоцентрифузі впродовж 10 сек. при 1500 об./хв. Виявлення наявності цитокератин-позитивних клітин серед мононуклеарів КМ на цитоспінових препаратах здійснювали, використовуючи метод АРААР (alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase) та систему візуалізації EnVisionTM G/2 System/AP Rabbit/Mouse (Permanent Red) ("Dako СуШтаи'оп",Данія).Як первинні антитіла використовували моноклональні мишачі антитіла проти цитокератину (клон АЕ1/АЕЗ, "Dako Cytomation", Данія). Дофарбування ядер здійснювали 0,1 % розчином метилового зеленого. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували ДПК як забарвлені червоним клітини на зеленому тлі та проводили підрахунок. З метою визначення РМЕ/Рі методом ЯМР спектроскопії отриману під час операції тканину, що зберігалась в рідкому азоті при температурі -180°, гомогенізували, екстрагували фосфоровмісні речовини розчином холодної 1,2 н НСlO4 (перхлорної кислоти). Потім рН перхлорного екстракту (ПХЕ) доводили до 7,6-8,0, дівалентні іони видаляли за допомогою Chelex 10мг/5мл (Sigma, США), фільтрували, ліофілізували та зберігали при температурі -20 °C. Перед реєстрацією ЯМР спектрів зразки розчиняли в 1,0 мл D2O, центрифугували і переносили 1 UA 121683 U ЗІ 5 10 15 20 в ЯМР пробірки для аналізу. Р ЯМР спектри ПХЕ реєстрували на спектрометрі Bruker 400 MHz 31 (Widebore Ultrashield, AV-400 Electronics, ФРН), використовуючи 5 мм кювети. Р ЯМР спектри вимірювали при 161,976 MHz зі спектральною шириною в 64724,9 Hz, шириною імпульсу 90°. 31 З1 Тринатрієва сіль метилендифосфопієвої кислоти (Sigma) слугувала за стандарт. Всі Р рхімічні зрушення у спектрах співвідносили до сигналу фосфокреатину, який був позначений як 0,0 рріп. межа розподілу між умовно "добре" та "бідно" оксигенованими пухлинами дорівнює 1,4 для всіх обстежених хворих. Пухлини, для яких співвідношення РМЕ/Рі1,4 - задовільно оксигеновані. + Імуногістохімічне визначення Рlin5 -клітин як маркера життєздатних адипоцитів, проведено на парафінових зрізах тканини РШ, використовуючи специфічні кролячі поліклональні антитіла (Perilipin-5/OXPAT Antibody, Termoscientific, США) у розведенні 1:200. На зрізи наносили 1 % розчин сироваточного альбуміну бика, потім проводили інкубацію препаратів з відповідними поліклональними антитілами в оптимальному розведенні протягом однієї години. Після промивання препаратів у розчині фосфатного буфера їх інкубували 40 хв. у полімерному розчині (EnVision+/HRP; DakoCytomation, Данія). Для візуалізації активності пероксидази використовували діамінобензидин тетрагідрохлорид (DAB) ("DakoCytomation", Данія) та дофарбовували зрізи гематоксиліном Майера. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували клітини, що експресують Р1іп5. Р1іп5-позитивні клітини були підраховані на 1000 + клітин на кожному зрізі при збільшенні Х400 і число Рlin5 - клітин виражали у відсотках. Індекс маси тіла (ІМТ) - величина, яка дозволяє оцінити ступінь відповідності маси людини її зросту і тим самим побічно оцінити, чи є маса достатньою, нормальною чи надмірною. Важливий для визначення необхідного лікування. Індекс маси тіла (ІМТ) обчислюється за формулою:  25 30 35 40 45 50 55 m , h2 2 де: m - маса тіла в кілограмах; h - ріст в метрах, вимірюється в кг/м . Встановлено, що у хворих на РШ з високим індексом маси тіла (ІМТ >25>30) при мінімальній залишковій хворобі, тобто у кістковому мозку яких виявлені дисеміновані пухлинні клітини, а пухлинна тканина знаходиться в стані гіпоксії з виявленою високою кількістю пухлиноасоційованих адипоцитів (більше ніж 26,4 %), тобто агресивність пухлини вважається високою, що є основою для прогнозування несприятливого перебігу захворювання. За розробленою методикою обстежено 98 хворих на рак шлунка при мінімальній залишковій хворобі, тобто були в наявності дисеміновані пухлинні клітини у кістковому мозку: у 51 хворого з високим індексом маси тіла (ІМТ >25>30) та у 47 хворих - з низьким (ІМТ