Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка, що включає визначення кількості дисемінованих пухлинних клітин в кістковому мозку, який відрізняється тим, що додатково в пухлинній тканині визначають співвідношення фосфомоноестери/неорганічний фосфат, рівні експресії білка CD34 та концентрації активних форм матриксних металопротеїназ-2 та -9, і при наявності дисемінованих пухлинних клітин в кістковому мозку, величині співвідношення фосфомоноестери/неорганічний фосфат, меншій ніж 1,4, експресії CD34, більшій ніж 142, і концентраціях активних форм матриксних металопротеїназ-2 та -9, вищих ніж, відповідно, 2,0 та 4,5 мкг/г тканини, прогнозують несприятливий перебіг захворювання, а при відсутності дисемінованих пухлинних клітин в кістковому мозку, величині співвідношення фосфомоноестери/неорганічний фосфат, більшій ніж 1,4, експресії CD34, меншій ніж 142, і концентраціях активних форм матриксних металопротеїназ-2 та -9, нижчих ніж, відповідно, 2,0 та 4,5 мкг/г тканини, - сприятливий.

Текст

Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка, що включає визначення кількості дисемінованих пухлинних клітин в кістковому мозку, який відрізняється тим, що додатко 3 the bone marrow / M. Heiss, E. Simon. B. Beyer at al. // J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol. 20. - P.2005-2016). Позитивним у прототипі є те, що застосований метод проводиться з використанням моноклональних антитіл і характеризується високим рівнем селективності. Недоліками прототипу є те, що як маркер прогнозу використовують лише кількість ДПК в KM і не враховують рівні гіпоксії та експресії або активності гіпоксія-залежних білків в пухлинній тканині хворих, що дозволило б оцінити ступінь агресивності пухлини. В основу корисної моделі поставлено задачу створити спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка шляхом визначення показника гіпоксії РМЕ/РІ. рівня експресії білка CD34 та концентрацій активних форм металопротеїназ-2 та -9 в пухлинній тканині додатково до визначення кількості ДПК в KM, що дасть можливість комплексної оцінки ступеня агресивності пухлини та дозволить контролювати ефективність протипухлинної терапії, корегувати схеми лікування та покращити показники виживаності. Поставлена задача вирішувалася наступним чином: За 1-2 доби до оперативного втручання в результаті стандартної процедури пункції KM із стернальної кістки отримували пунктат KM, з якого виділяли мононуклеарні клітини та зберігали їх при температурі -20°С до часу використання. Мононуклеарні клітини наносились на скельця в процесі центрифугування на цитоцентрифузі впродовж 10сек. при 1500об/хв. Виявлення наявності цитокератин-позитивних клітин серед мононуклеарів КМ на цитоспінових препаратах здійснювали, використовуючи метод АРААР (alkaline phosphataseanti-alkaline phosphatase) та систему візуалізації EnVisionTM G/2 System/AP Rabbit/Mouse (Permanent Red) ("Dako Cytomation". Данія). Як первинні антитіла використовували моноклональні мишачі антитіла проти цитокератину (клон АЕ1/АЕЗ, "DakoCytomation", Данія). Дофарбування ядер здійснювали 0,1% розчином метилового зеленого. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували ДПК як забарвлені червоним клітини на зеленому тлі та проводили підрахунок. Частину пухлинної тканини, отриманої у того ж хворого підчас оперативного втручання, одразу занурювали в забуференний формалін, після чого готували парафінові блоки за стандартною методикою. Парафінові блоки за допомогою мікротома нарізали на зрізи товщиною 4-6мкм, які наносили на предметне скло. Іншу частину пухлинної тканини, отриманої підчас операції, зберігали в рідкому азоті при температурі -180°С не більше, ніж 1 місяць. Отриману під час операції тканину, що зберігалась в рідкому азоті, гомогенізували і розділяли на два зразки. З метою визначення РМЕ/Рі методом ЯМРспектроскопії [7] із зразка гомогенізованої пухлинної тканини екстрагували фосфорвмісні речовини розчином холодної 1,2 н НСlО4 (перхлорної кислоти) Потім рН перхлорного екстракту (ПХЕ) доводили до 7,6-8,0, дівалентні іони видаляли за допо 59969 4 могою Chelex 10мг/5мл (Sigma, США), фільтрували, ліофілізували та зберігали при температурі 31 20°С. Перед реєстрацією спектрів ПХЕ на Р ЯМР-спектрометрі зразки розчиняли в 1,0мл D2O, центрифугували і переносили в ЯМР-пробірки для аналізу. Спектри ПХЕ реєстрували на ЯМРспектрометрі, використовуючи 5мм кювети. Спектри вимірювали при 161,976 MHz, зі спектральною шириною в 64724,9 Hz, шириною імпульсу 90° та затримкою в 4сек. Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma) правила за стандарт. 31 Всі Р-хімічні зрушення у спектрах співвідносили до сигналу фосфокреатину (ФК). який позначався як 0,0ррm. Межа розподілу між гіпоксичними та добре оксигенованими пухлинами складала 1,4 для всіх обстежених хворих. Пухлини, для яких співвідношення РМЕ/Рі1,4- добре оксигенованими. Концентрації активних та латентних форм ММП-2 та -9 в зразку гомогенізованої пухлинної тканини визначали методом зимографії в 12% ПААГ з додецилсульфатом натрія і 0,1% желатину як субстрат [11]. 50мг пухлинної тканини гомогенізували в 1% розчині додецилсульфату натрія, гомогенат центрифугували при 3000об/хв., 20мкл надосаду вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4°С, в напрузі електричного поля 150V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивали в 2,5% розчині тритону Х-100, потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальція (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37°С, фіксували та забарвлювали 0,25% Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність ММП-2 та -9 візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі кожного із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Межа розподілу між умовно високою та низькою концентраціями активних форм ферментів дорівнює 2,0мкг/г тканини для ММП-2 та 4,5мкг/г тканини для ММП-9, тобто, концентрації активних форм ММП-24,5мкг/г тканини вважались високими. Імуногістохімічне виявлення експресії білка CD34 проводили з використанням відповідних моноклональних антитіл CD34 (клас II, клон QBEnd, "DakoCytomatuion", Данія) в розведенні 1:100 на депарафінізованих зрізах пухлинної тканини. Для виявлення експресії CD34 на зрізи наносили 1% розчин сироваточного альбуміну бика, потім проводили інкубацію препаратів з відповідними моноклональними антитілами в оптимальному розведенні протягом однієї години. Після промивання препаратів у розчині фосфатного буфера їх інкубували 40хв. у полімерному розчині. Для візуалі 5 зації активності пероксидази використовували діамінобензидина тетрагідрохлорид (DAB) ("DakoCytomation", Данія) та дофарбовували зрізи гематоксиліном Майера. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували клітини, що експресують CD34, як клітини, забарвлені коричневим кольором. Використовуючи окулярну сітку 20×20 квад2 ратів площею 1см перераховували кількість заба2 рвлених клітин на 1мм , і при значенні 142 - гіперваскуляризованою. Встановлено, що у тих обстежених хворих, в KM яких виявлені ДПК. а пухлинна тканина - гіпоксична, гіперваскуляризована, і в ній виявлено високі концентрації активних форм ММП-2 та -9, агресивність пухлини вважається високою, що є основою для прогнозування несприятливого перебігу захворювання. У хворих, в KM яких не виявлені ДПК, а пухлинна тканина - добре оксигенована, гіповаскуляризована, і в ній виявлено низькі концентрації активних форм ММП-2 та -9, агресивність пухлини вважається низькою, що є основою для прогнозування сприятливого перебігу захворювання. Критеріями ефективності використаного способу є покращання раннього виявлення рецидивів та/або метастазів пухлини, корекції схем лікування, що призводить до підвищення ефективності терапії та подовження життя хворих на РШ. За розробленою методикою обстежено 56 хворих на РШ. У 38 хворих виявлено високу агресивність пухлини та встановлено негативний прогноз перебігу захворювання, у 18 - низьку агресивність пухлини та позитивний прогноз перебігу захворювання. Прикладами реалізації заявленого способу можуть вважатися наведені витяги з Історій хвороби двох хворих. І. Хвора Ш., 1943 року народження (Історія хвороби №17729. АК №14996/06. ПГЗ №4674560/06 - низькодиференційована аденокарцинома шлунка, T2N0M0, G4, стадія IB). Виконана операція - дистальна субтотальна резекція шлунка за Більрот-ІІ у модифікації Гофмейстера-Фінстерера. За 1-2 доби до оперативного втручання в результаті стандартної процедури пункції KM із стернальної кістки хворої отримували пунктат KM, з якого виділяли мононуклеарні клітини та зберігали їх при температурі -20°С до часу використання. Мононуклеарні клітини наносились на скельця в процесі центрифугування на цитоцентрифузі впродовж 10сек. при 1500об/хв. Виявлення наявності цитокератин-позитивних клітин серед мононуклеарів КМ на цитоспінових препаратах здійснювали, використовуючи метод АРААР та систему візуалізації EnVisionTM G/2 System/AP Rabbit/Mouse (Permanent Red) ("Dako Cytomation", Данія). В якості первинних антитіл використовували моноклональні мишачі антитіла проти цитокератину (клон АЕ1/АЕ3, "DakoCytomation". Данія). Дофарбування ядер здійснювали 0,1% розчином метилового зеленого. За допомогою світлового мікроскопа в KM хворої були виявлені ДПК як забарвлені червоним клітини на зеленому тлі. 59969 6 Частину пухлинної тканини, отриманої у тієї ж пацієнтки підчас оперативного втручання, одразу занурювали в забуферений формалін, після чого готували парафінові блоки за стандартною методикою. Парафінові блоки за допомогою мікротома нарізали на зрізи товщиною 4-6мкм, які наносили на предметне скло. Іншу частину пухлинної тканини, отриманої підчас операції, зберігали в рідкому азоті при температурі -180°С не більше, ніж 1 місяць. Отриману під час операції тканину, що зберігалась в рідкому азоті, гомогенізували і розділяли на два зразки. З метою визначення РМЕ/Рі методом ЯМРспектроскопії [7] із зразка гомогенізованої пухлинної тканини екстрагували фосфорвміснІ речовини розчином холодної 1,2н НСlO4. Потім рН за допомогою ПХЕ доводили до 7,6-8,0, дівалентні іони видаляли за допомогою Chelex 10мг/5мл (Sigma. США), фільтрували, ліофілізували та зберігали при температурі -20°С. Перед реєстрацією спект31 рів ПХЕ на Р ЯМР спектрометрі зразки розчиняли в 1,0мл D2O, центрифугували і переносили в ЯМР- пробірки для аналізу. Спектри ПХЕ реєстрували на ЯМРспектрометрі, використовуючи 5мм кювети. Спектри вимірювали при 161.976 MHz, зі спектральною шириною в 64724.9 Hz, шириною імпульсу 90° та затримкою в 4сек. Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої кислоти (Sigma) правила за стандарт. 31 Всі Р-хімічні зрушення у спектрах співвідносили до сигналу ФК, який позначався як 0,0ррm. Співвідношення РМЕ/Рі дорівнювало 1,0, тобто, було менше, ніж 1,4, що вказує на гіпоксичність пухлини. Концентрації активних та латентних форм ММП-2 та -9 в зразку гомогенізованої пухлинної тканини визначали методом зимографії в 12% ПААГ з додецилсульфатом натрію і 0,1% желатину в якості субстрату [11]. 50мг пухлинної тканини гомогенізували в 1% розчині додецилсульфату натрію, гомогенат центрифугували при 3000об/хв., 20мкл надосаду вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4°С, в напрузі електричного поля 150V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивали в 2,5% розчині тритону Х-100, потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальцію (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37°С, фіксували та забарвлювали 0,25% Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність ММП-2 та -9 візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі. а їхня локалізація відповідала молекулярній масі кожного Із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Концентрація активних форм ММП-2 становила 3,6мкг/г тканини, а ММП-9 - 17,0мкг/г тканини, що більше, ніж 2,0 та 4,5мкг/г тканини, 7 відповідно, тому наведені показники вважаються високими. Імуногістохімічне виявлення експресії білка CD34 проводили з використанням відповідних моноклональних антитіл CD34 (клас II, клон QBEnd, "DakoCytomatuion", Данія) в розведенні 1:100 на депарафінізованих зрізах пухлинної тканини. Для виявлення експресії CD34 на зрізи наносили 1% розчин сироваточного альбуміну бика, потім проводили інкубацію препаратів з відповідними моноклональними антитілами в оптимальному розведенні протягом однієї години. Після промивання препаратів у розчині фосфатного буфера їх інкубували 40 хвилин у полімерному розчині. Для візуалізації активності пероксидази використовували DAB ("DakoCytomation", Данія) та дофарбовували зрізи гематоксиліном Майера. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували клітини, що експресують CD34, як клітини, забарвлені коричневим кольором. Кількість забарвлених клітин становила 165, що більше, ніж 142, і свідчить про те, що пухлина гіперваскуляризована. Таким чином, в KM хворої Ш. виявлені ДПК, а пухлина характеризується як гіпоксична, гіперваскуляризована. з високими рівнями активності желатиназ. За цих умов прогноз перебігу захворювання є несприятливим. Тривалість життя хворої становила 40 тижнів. II. Хворий К., 1952 року народження (Історія хвороби № 3752, АК №8344/05. ПГЗ №12808-16/05 - железистий, місцями перснеподібний рак шлунка. T3N1M0. G3-4. стадія ІІІА). Виконана операція - розширена гастректомія за Гіляровичем. За 1-2 доби до оперативного втручання в результаті стандартної процедури пункції KM із стернальної кістки хворого отримували пунктат KM, з якого виділяли мононуклеарні клітини та зберігали їх при температурі -20°С до часу використання. Мононуклеарні клітини наносились на скельця в процесі центрифугування на цитоцентрифузі впродовж 10сек. при 1500об/хв. Виявлення наявності цитокератин-позитивних клітин серед мононуклеарів КМ на цитоспінових препаратах здійснювали, використовуючи метод АРААР та систему візуалізацІЇ EnVisionTM G/2 System/AP Rabbit/Mouse (Permanent Red) ("Dako Cytomation", Данія). Як первинні антитіла використовували моноклональні мишачі антитіла проти цитокератину (клон АЕ1/АЕ3, "DakoCytomation", Данія). Дофарбування ядер здійснювали 0,1% розчином метилового зеленого. В результаті дослідження препарату під світловим мікроскопом на ньому не були виявлені забарвлені червоним клітини на зеленому тлі, тобто в KM хворого відсутні ДПК. Частину пухлинної тканини, отриманої у вказаного пацієнта підчас оперативного втручання, одразу занурювали в забуференний формалін, після чого готували парафінові блоки за стандартною методикою. Парафінові блоки за допомогою мікротома нарізали на зрізи товщиною 4-6мкм, які наносили на предметне скло. Іншу частину пухлинної тканини, отриманої підчас операції, зберігали в рідкому азоті при температурі -180°С не більше, ніж 1 місяць. 59969 8 Отриману під час операції тканину, що зберігалась в рідкому азоті, гомогенізували і розділяли на два зразки. З метою визначення РМЕ/Рі методом ЯМРспектроскопії [7] із зразка гомогенізованої пухлинної тканини екстрагували фосфорвмісні речовини розчином холодної 1,2н НСlО4 Потім рН за допомогою ПХЕ доводили до 7,6-8,0, дівалентні іони видаляли за допомогою Chelex 10мг/5мл (Sigma, США), фільтрували, ліофілізували та зберігали при температурі -20°С. Перед реєстрацією спект31 рів ПХЕ на Р ЯМР спектрометрі зразки розчиняли в 1,0мл D2O, центрифугували і переносили в ЯМР- пробірки для аналізу. Спектри ПХЕ реєстрували на ЯМР спектрометрі, використовуючи 5 мм кювети. Спектри вимірювали при 161,976 MHz, зі спектральною шириною в 64724,9 Hz, шириною імпульсу 90° та затримкою в 4сек. Тринатрієва сіль метилендифосфонієвої 31 кислоти (Sigma) правила за стандарт. Всі Рхімічні зрушення у спектрах співвідносили до сигналу ФК, який позначався як 0,0ррm. Співвідношення РМЕ/Рі дорівнювало 1,8, тобто, було більше, ніж 1,4, що вказує на те, що пухлина добре оксигенована. Концентрації активних та латентних форм ММП-2 та -9 в зразку гомогенізованої пухлинної тканини визначали методом зимографії в 12% ПААГ з додецилсульфатом натрія і 0,1% желатину як субстрат [11]. 50мг пухлинної тканини гомогенізували в 1% розчині додецилсульфату натрія, гомогенат центрифугували при 3000об/хв, 20мкл надосаду вносили в лунки геля та проводили електрофорез при температурі +4°С, в напрузі електричного поля 150V, протягом 4 годин. Після розділення досліджуваних білків гель відмивали в 2,5% розчині тритону Х-100. потім інкубували в буфері з додаванням хлориду кальцію (рН=7,5) впродовж 18 годин при температурі +37°С. фіксували та забарвлювали 0,25% Кумассі діамантовим синім. Після відмивання гелю у розчині оцтової кислоти з метанолом протеолітична активність ММП-2 та -9 візуалізувалась у вигляді знебарвлених смужок на синьому тлі, а їхня локалізація відповідала молекулярній масі кожного із ферментів, які визначалися за стандартами молекулярних мас. Оцінку протеолітичної активності проводили шляхом виміру площі зони лізису та визначали концентрації активних форм ферментів, використовуючи стандартний набір матриксних металопротеїназ. Концентрація активних форм ММП-2 становила 0,3мкг/г тканини, а ММП-9 - 0,9мкг/г тканини, що менше ніж 2,0 та 4,5мкг/г тканини, відповідно, тому наведені показники вважаються низькими. Імуногістохімічне виявлення експресії білка CD34 проводили з використанням відповідних моноклональних антитіл CD34 (клас II, клон QBEnd, "DakoCytomatuion", Данія) в розведенні 1:100 на депарафінізованихових зрізах пухлинної тканини. Для виявлення експресії CD34 на зрізи наносили 1% розчин сироваточного альбуміну бика, потім проводили інкубацію препаратів з відповідними моноклональними антитілами в оптимальному розведенні протягом однієї години. Після проми 9 59969 вання препаратів у розчині фосфатного буфера їх інкубували 40 хвилин у полімерному розчині. Для візуалізації активності пероксидази використовували DAB ("DakoCytomation", Данія) та дофарбовували зрізи гематоксиліном Майера. За допомогою світлового мікроскопа візуалізували клітини, що експресують CD34, як клітини, забарвлені коричневим кольором. Кількість забарвлених клітин становила 110, що менше ніж 142, і свідчить про те, що пухлина гіповаскуляризована. Таким чином, в KM хворого К. не виявлені ДПК, а пухлина характеризується як добре оксигенована, гіповаскуляризована, з низькими рівнями активності желатиназ. За цих умов прогноз перебігу захворювання сприятливий. Тривалість життя хворого становила 127 тижнів. Джерела інформації: 1. Macdonald J.S., Cervantes A. New horizons for gastric cancer: commentary // Eur. J. Cancer Suppl. - 2006. - Vol. 4, №10. - P.1-2. 2. Muller V., Alix-Panabieres С. Pantel К. Insight into minimal residual disease in cancer patient: Implication for anti-cancer therapies // Eur. J. Cancer - 2010. -Vol. 46.-P.1189-1197. 3. Circulating tumor cells demonstrate an altered response to hypoxia and an aggressive phenotype / K. Ameri, R. Luong, H. Zhang et al. // Br J Cancer. 2010. -Vol.102. - P.561-569. 4. Clinical significance of micrometastasis in bone marrow of patients with gastric cancer and its relation Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 10 to angiogenesis / Y. Kakeji, y. Maehara. K. Shibahara et al. // Gastr Cancer. - 1999. - Vol. 2. - P.46-51. 5. Hoeckel M., Vaupel P. Tumor hypoxia: definitions and current clinical, biologic, and molecular aspects // J. NatL Cancer Inst. - 2001. - Vol. 93. P.266-276. 6. Eriksen J.G., Horsman M.R. Tumor hypoxia - a characteristic feature with a complex molecular background // Radiother. Oncol. - 2006. - Vol. 81. РЛ19-121. 31 7. Correlation between P-NMR spectroscopy and tissue СЬ tention measurements in a murine fibrocarcoma /P. Vaupel, P. Okunieff. F. Kallinowski et al. // Radiation Res. - 1989. - Vol. 120. - P.477-493. 8. Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis // Front Biosci - 2006. - Vol. 11. - P.479-491. 9. Matrix metalloproteinase-2 is a consistent prognostic factor in gastric cancer / F. Kubben, C. Sier, W. Duijn et al. // Br J Cancer - 2006. - Vol. 94. – P.1035 -1040. 10. Minimal residual disease in gastric cancer: evidence of an independent prognostic relevance of urokinase receptor expression by disseminated tumor cells in the bone marrow / M.Heiss, E. Simon, B.Beyer at al. // J. Clin. Oncol. - 2002. - Vol.20. P.2005-2016 (прототип). 11. Inhibition of invasion and metastasis in cells transfected with an inhibitor of metalloproteinases / YA. De Clerk, N. Perez. H. Shimada et al. // Cancer research. - 1992. - Vol. 52. - P.701-708. Підписне Тираж 24 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for predicting the disease course in patients with gastric cancer

Автори англійською

Osinskyi Serhii Petrovych, Bubnovskaya Larysa Mykytivna, Hanusevych Iryna Ivanivna, Kovalska antonina Vasylivna, Humeniuk Lilia Dmytrivna, Merentsev Serhii Pavlovych, Oliinychenko Hennadii Petrovych

Назва патенту російською

Способ прогнозирования течения заболевания у больных раком желудка

Автори російською

Осинский Сергей Петрович, Бубновская Лариса Никитовна, Ганусевич Ирина Ивановна, Ковельская Антонина Васильевна, Гуменюк Лилия Дмитриевна, Меренцев Сергей Павлович, Олийниченко Геннадий Петрович

МПК / Мітки

МПК: A61B 10/00, G01N 33/50

Мітки: захворювання, перебігу, хворих, спосіб, рак, шлунка, прогнозування

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/5-59969-sposib-prognozuvannya-perebigu-zakhvoryuvannya-u-khvorikh-na-rak-shlunka.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб прогнозування перебігу захворювання у хворих на рак шлунка</a>

Подібні патенти