Спосіб визначення статі рослин актинідія аргута (actinidia arguta)

Реферат: Спосіб визначення статі рослин актинідія аргута (Actinidia arguta) шляхом обробки рослинних зразків хімічним реагентом, подальшого аналізу результатів реакції та встановлення статі рослини за забарвленням зразків, причому зрізи однорічних пагонів на стадії 2-3-річних сіянців обробляють в польових умовах однією краплею спиртового розчину йоду в концентрації 0,50,7 % і при забарвленні зрізу в чорний колір встановлюють чоловічу стать рослини, а при забарвленні в світло-сірий колір - жіночу. UA 122529 U (12) UA 122529 U UA 122529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біології, зокрема до визначення статі рослин актинідії на стадії сіянців в прегенеративний період їх розвитку. Може бути застосована в селекції рослин актинідія - виду Actinidia arguta (A. arguta) та підвиду - Actinidia arguta var. purpurea (A. purpurea). Актинідія належить до роду рослин Actinidia Lindl. Це дводомна культура і для забезпечення високої продуктивності її насаджень на ділянках необхідно одночасно висаджувати чоловічі та жіночі рослини у співвідношенні 1 до 5-7. Сортові жіночі рослини для посадки одержують лише шляхом вегетативного розмноження, в той час як чоловічі рослини-запилювачі можуть бути як вегетативного, так і насіннєвого походження. Численні дослідження свідчать, що саме сіянці краще пристосовуються до нових умов зростання, вирізняються вищою адаптивною здатністю, підвищеною стійкістю до негативних чинників навколишнього середовища порівняно з вегетативно розмноженими рослинами. Актинідія - це інтродуцент флори південно-східного азіатського генетичного центру, тому за умов інтродукції рослини-запилювачі доцільно використовувати саме насіннєвого походження. Для прискорення селекційного процесу з культурою актинідії та підвищення його ефективності навпаки, важливо вже в ювенільний період вибракувати чоловічі особини, значно зменшивши затрати на подальший догляд за селекційним фондом. До того ж за літературними даними вихід рослин-запилювачів інколи сягає 90 %, а то й 100 % від загальної маси сіянців [1]. Методи визначення статі сіянців актинідії аргути до вступу їх у генеративну фазу розвитку (на 5-7 рік після посіву) нині відсутні, тому питання пошуку критеріїв ранньої діагностики статі рослин й опрацювання методу її визначення є надзвичайно актуальним і має важливе теоретичне та практичне значення. Відомі способи визначення статі рослин хмелю, казуаринових кущів, борожо-рослин на стадії сіянців [2, 3, 4]. Всі три відомі способи засновані на визначенні статі рослин на стадії сіянців за допомогою молекулярних маркерів, розроблених за допомогою полімеразної ланцюгової реакції. Всі три відомі способи мають суттєві недоліки через необхідність проведення полімеразної ланцюгової реакції, яка є довготривалою, затратною, вимагає високовартісних апаратури та реактивів, окремої лабораторії та навченого персоналу. Окрім того, не виявлено публікацій про розроблені молекулярні маркери для визначення статі актинідії. Відомі способи визначення статі рослин актинідія аргута за морфологією листя, квіток чи коренів [5, 6]. Недоліком відомих способів визначення статі за морфологічними ознаками є можливість діагностики лише у дорослих рослин, які досягли генеративного періоду розвитку. А це знижує ефективність селекції, збільшує затрати праці, коштів, посівної площі, часу. Визначення статі рослин актинідія аргута за морфологічними ознаками в ювенільному віці (рання діагностика 2-3-х річних сіянців) до цього часу не відоме [6]. Найближчим за технічною сутністю та досягнутим результатом до способу визначення статі рослин актинідія аргута (A.arguta, A.purpurea), що заявляється, є відомий обраний за прототип спосіб, описаний у збірнику [6]. За відомим способом використовують метод кольорових осадів. Він полягає в тому, що перемелюють листя окремих дорослих рослин A. arguta та A. purpurea, заливають його водним розчином ацетату свинцю, настоюють, фільтрують, екстракт знову настоюють, доки не випаде осад, і за кольором одержаного осаду визначають стать рослини: у жіночих рослин колір осаду яєчно-жовтий, у чоловічих - зеленкувато-жовтий (червень) або відповідно жовтий та лимонножовтий (липень). Недоліками відомого способу є його складність, довготривалість, необхідність приладів для переробки листя (міксери, фільтри), вартісних реактивів, можливість діагностики статі лише у дорослих рослин (5-7 років), низька точність (65,0 %) діагностики, бо можливі помилки через близькість відтінків забарвлення осадів. Відомий спосіб діагностики статі є дуже неточним також через те, що кольори осадів та їх інтенсивність варіюють в залежності від фази розвитку рослини та моменту взяття проб для аналізу. А це знижує ефективність селекції, збільшує затрати праці, коштів, посівної площі, часу та робить відомий спосіб безперспективним щодо практичного застосування. В основу корисної моделі, що заявляється, поставлено задачу в способі визначення статі рослин актинідія аргута шляхом обробки рослинних зразків новим хімічним реагентом в польових умовах забезпечити підвищення точності діагностики, спрощення його, здешевлення, скорочення терміну аналізування, виконання в польових умовах, можливість аналізування статі рослин в ювенільному віці (сіянців віком в 2-3 роки), що підвищує ефективність селекції, зменшує затрати праці, коштів, посівної площі, часу. Створено експрес-метод діагностики, оскільки процедура визначення статі триває 2-3 хвилини. При цьому точність визначення 1 UA 122529 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 зростає з 65,0 % (прототип) до 95,0 %. Спосіб, що заявляється, простий, не потребує вартісного обладнання для підготовки зразків до аналізування та спеціальної підготовки фахівців. Поставлена задача вирішується тим, що створено спосіб визначення статі рослин актинідія аргута (A. arguta) шляхом обробки рослинних зразків хімічним реагентом, подальшого аналізу результатів реакції та встановлення статі рослини за забарвленням зразків. Новим в заявленому способі є те, що зрізи однорічних пагонів на стадії 2-3-річних сіянців обробляють в польових умовах однією краплею спиртового розчину йоду в концентрації 0,50,7 % і при забарвленні зрізу в чорний колір встановлюють чоловічу стать рослини, а при забарвленні в світло-сірий колір - жіночу. Між сукупністю ознак корисної моделі та технічним результатом, якого досягають при його реалізації, існує причино-наслідковий зв'язок. Пагони актинідії аргути складаються з первинної покривної тканини - епідерми, перидерми, коркового камбію фелогену та фелодерми. Дрібні клітини фелодерми заповнені хлоропластами та крохмальними зернами. Між флоемою та ксилемою утворює кільце камбій. Корову паренхіму та флоему розділяє шар склеренхіми з клітинами видовженої форми та потовщеними оболонками. Основні елементи ксилеми - це судини, механічні елементи та паренхіма, що складається з клітин деревної паренхіми і серцевинних променів. Серцевина пагона актинідії аргути сформована з паренхімних клітин, периферійна частина яких утворює перимедулярну зону, з віком серцевинні клітини відмирають, що призводить до утворення в центрі пагона порожнини. Тому авторами корисної моделі було вирішено проводити діагностику саме на однорічних пагонах 2-3-річних сіянців. Порівняльні дослідження різностатевих рослин актинідії виявили суттєву різницю в анатомічній будові пагонів в межах виду - перидерма однорічних пагонів жіночих рослин дещо товща порівняно з чоловічими. Водночас була відмічена особливість варіювання показників вмісту крохмалю залежно від статі рослин. Було виявлено накопичення більшої кількості крохмалю в пагонах жіночих рослин порівняно з чоловічими і переважно зосередженої в клітинах перимедулярної зони та радіальних променів пагонів і в шарі ендодерми що прилягає до склеренхіми. Дослідження динаміки накопичення крохмалю в різних структурах пагона показали, що перетворення його більш виразне в гістологічних елементах кори. Оскільки виявлена локалізація крохмалю і його кількість в стеблі чоловічих і жіночих рослин різна, то авторами був розроблений метод визначення статі сіянців, в основу якого покладено якісний хімічний тест на визначення крохмалю у зрізі однорічних пагонів 2-3-річних сіянців рослин актинідія аргута: обробку зрізу реактивом - спиртовим розчином йоду (якісний реагент на крохмаль). Перевагою методу є доступність для широкого загалу садівників, простота, дешевизна та мобільність визначення статі сіянців - різниця в забарвленні спостерігається вже за 2-3 хвилини після нанесення реактиву, масовість використання без будь-якої шкоди рослинам. Дослідження довели, що для проведення тестування достатньо однієї краплі реактиву й оптимальною є концентрація спиртового розчину йоду 0,5-0,7 %. Менша концентрація ніж 0,5 % дає дуже слабку хімічну реакцію та майже не забарвлює зріз пагона. Вища концентрація ніж 0,7 % не має розрізняльної властивості, бо забарвлює зрізи і жіночих, і чоловічих рослин в інтенсивний чорний колір. На кресленні показано забарвлення зрізів однорічних пагонів чоловічої та жіночої рослин A. purpurea за способом, що заявляється: зліва - пагін чоловічої рослини, справа - жіночої. Даний метод був апробований на селекційних ділянках ботанічного саду. Його застосували при визначенні статі 500 сіянців актинідії виду A. arguta (400 рослин) та підвиду A. purpurea (100 рослин), сорти яких є найбільш перспективними для впровадження в культуру в правобережному Лісостепу України. За результатами проведених аналізів 500 сіянців виявлено 305 рослин A. arguta чоловічої статі та 95 рослин жіночої статі, а також 90 рослин підвиду A. purpurea чоловічих та 10 - жіночих. Для підтвердження результатів ранньої діагностики статі сіянців у дорослих рослин їхню стать перевіряли відомим способом за морфологічними ознаками [6]. По досягненню сіянцями генеративного віку попередня рання діагностика справдилась на 95 % (у 380 рослин A. arguta та у 95 рослин A. purpurea), що вказує на високу ефективність і перспективність широкого використання запропонованого експрес-методу визначення статі сіянців в прегенеративний період розвитку рослин. Застосування даного методу дозволяє визначити стать сіянців уже в 2-3-річному віці в польових умовах, підвищує ефективність селекції, зменшує затрати праці, коштів, посівної площі, часу. Контрольну групу рослин склали 50 дорослих (5-7 років) актинідій виду A. arguta та 50 дорослих - підвиду A. purpurea. Стать актинідій контрольної групи визначали за відомим 2 UA 122529 U 5 10 15 20 25 30 35 способом-прототипом. В контрольній групі стать рослин справдилась у 65 % рослин: у 34 рослин виду A. arguta та у 31 рослини підвиду A. purpurea. Спосіб визначення статі рослин актинідія аргута (A. arguta), що заявляється, виконують наступним чином. Тестування проводять в польових умовах в будь-яку пору року, виключаючи зиму, виконуючи гострим ножем зрізи однорічних пагонів на стадії 2-3-річних сіянців актинідії. Використовують аптечний препарат "Розчин йоду спиртовий 5 %", наприклад, виробництва ТОВ "Тернофарм", Україна. Препарат розводять етанолом до необхідної концентрації 0,5-0,7 %. На зріз наносять одну краплю спиртового розчину йоду в концентрації 0,5-0,7 %. Вже за 2-3 хвилини зріз забарвлюється. За забарвленням в світло-сірий колір визначають належність рослин до жіночої статі, а в інтенсивно чорний колір - до рослин чоловічої статі. Приклади виконання способу, що заявляється. Приклад 1 Визначали стать дворічного сіянцю актинідії аргути (A. arguta) 29 квітня 2010 року. Для цього в польових умовах гострим ножем зробили зріз однорічного пагона, нанесли на зріз одну краплю 0,5 %-ного спиртового розчину йоду. Вже за 3 хвилини зріз мав світло-сіре забарвлення, характерне для жіночих рослин актинідія аргута. На сіянець нанесли маркування з датою проведеної діагностики та визначеною статтю. Через 6 років (30 травня 2016 року), коли рослини досягай генеративного періоду розвитку, за морфологічними ознаками підтверджено попередню діагностику статі, виконану 29 квітня 2010 року за способом, що заявляється, а саме: рослина жіночої статі. Приклад 2 Визначали стать трирічного сіянцю актинідії аргути, а саме: підвиду A. purpurea, 18 жовтня 2010 року. Для цього в польових умовах гострим ножем зробили зріз однорічного пагона, нанесли на зріз одну краплю 0,7 %-ного спиртового розчину йоду. Вже за 2 хвилини зріз мав яскраво чорне забарвлення, характерне для чоловічих рослин актинідія аргута. На сіянець нанесли маркування з датою проведеної діагностики та визначеною статтю. Через 6,5 року (25 травня 2017 року), коли рослина досягла дорослого віку, за морфологічними ознаками підтверджено попередню діагностику статі, виконану 18 жовтня 2010 року за способом, що заявляється, а саме: рослина чоловічої статі. Джерела інформації: 1. Скрипченко Н.В. Статевий диморфізм видів роду ACTINIDIA Lindl. /[Скрипченко Н.В., Мороз П.А]. "Інтродукція рослин". - 2009. - С. 50-58. 2. Пат. RU 2272840, МПК: C12N 15/00, C12Q 1/68, С12Р 19/34, А01Н 1/04, опубл. 27.03.2006. 3. Заявка IN5259CH2013 (А), МПК: C12Q 1/00, опубл. 29.05.2015. 4. Заявка WO2006027696 (А2), МПК: C12Q 1/68, опубл. 16.03.2006. 5. https://kak-sdelat-vse.com/sad-i-ogorod/715-kak-otlichit-aktinidiyu-muzhskuyu-otzhenskoy.html. 6. Культурная флора России. Flora of cultivated plants /Том "Актинидия. Лимонник". "Actinidia. Schisandra". - Μ.: Россельхозакадемия. - 2007. - C. 117-122. 40 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 Спосіб визначення статі рослин актинідія аргута (Actinidia arguta) шляхом обробки рослинних зразків хімічним реагентом, подальшого аналізу результатів реакції та встановлення статі рослини за забарвленням зразків, який відрізняється тим, що зрізи однорічних пагонів на стадії 2-3-річних сіянців обробляють в польових умовах однією краплею спиртового розчину йоду в концентрації 0,5-0,7 % і при забарвленні зрізу в чорний колір встановлюють чоловічу стать рослини, а при забарвленні в світло-сірий колір - жіночу. 3 UA 122529 U Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4