Спосіб експрес – тестування стану системи гемокоагуляції за допомогою визначення часу зсідання плазми

Способ экспресс-тестирования состояния системы гемокоагуляции путем определения времени свертывания плазмы, включающий инкубацию плазмы, введение раствора гемокоагулирующего ферментного препарата и определение времени свертывания, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в инкубированную плазму в объемном соотношении 2:1 вводят 0,35 NtH ед. ферментного препарата Анцистрона-Н, при определении времени свертывания выше нормального 30±2 с плазму разбавляют нейтральным буферным раствором не менее чем в 1,5 раза и повторно определяют время свертывания разбавленной плазмы, по которому тестируют состояние системы гемокоагуляции пут'ем количественного определения уровня фибриногена, наличия продуктов деградации фибриногена/фибрина и ингибиторов свертывания. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при времени свертывания разбавленной плазмы, соответствующем норме, устанавливают гиперфибриногенемию. 3. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что при времени свертывания разбавленной плазмы выше нормы определяют количество фибриногена в исследуемой плазме и при его уровне ниже нормы судят о гипофибриногенемии. 4. Способ по пп. 1, 3, о т л и ч а ющ и й с я тем, что при нормальном уровне фибриногена определяют тромбиновое время свертывания исследуемой плазмы, по которому при нормальном времени свертывания судят о наличии продуктов деградации фибриногена/фибрина, а при увеличении времени свертывания не менее чем в 1,5 раза определяют наличие ингибиторов свертывания. С > СП ON О Изобретение относится к медицине и может быть использовано при диагностике заболеваний, связанных с нарушениями в системе свертывания крови и фибринолиза, характеризующихся колебаниями уровня фибриногена в плазме, присутствием в нем продуктов деградации фибриногена/фибрина (ПРФ) и ингибиторов свертывания крови. Наличие в крови ПРФ и ингибиторов свертывания, гипер- и гипофибриногенемии являются важными показателями состояния системы гемокоагуляции, позволяющими выявлять и предсказывать ход развития болезни, а также контролиро 14516 вать правильность применяемого лечения (Бокарев И.Н., Щепотин В.М., Ена Я.М. Внутрисосудистое свертывание. - К.: Здоровье. - 1989). Известные и широко применяемые в клинико-лабораторной практике способы оценки состояния системы гемокоагуляции основаны на определении времени свертывания исследуемой плазмы либо тромбином, либо тромбиноподобными ферментами из змеиных ядов (Иванов Е. П. Руководство по гемостазиологии. - Минск: Беларусь. - 1991. - 302 с ) . Способом-прототипом является тест "тромбиновое время", в котором определяют время свертывания плазмы тромбином и по его удлинению судят о наличии отклонений в системе гемокоагуляции (Иванов Е. П. Диагностика нарушений гемостаза, - Минск: Беларусь. - 1983. 220 с ) . Поскольку тромбин является естественным для организма ферментом, действие которого тесно связано с влиянием различных w-нгибиторов и активаторов, данные теста сложно интерпретировать. Тест мало чувствителен к колебаниям уровня фибриногена, присутствию ПРФ и ингибиторов свертывания, этот способ невозможно применять при гепаринотерапии. Более удобны и точны тесты с применением тромбин о подобных ферментов из змеиных ядов, такие как "атроксиновое время" (диагностический кит фирмы SIGMA, США) и "рептилазное время" (кит фирмы PENTAPHARM, Швейцария). Используемые в этих тестах ферменты воздействуют на конечный этап свертывания крови - превращение фибриногена в фибрин. Их действие не зависит от присутствия в плазме эндо- и экзогенных ингибиторов свертывания, в т.ч. гепарина (Угарова Т. П. Гемокоагулирующие ферменты из ядов змей // Биохимия животных и человека. - 1989. - Вып. 1 3 . - е . 65-74). Однако данные этих тестов позволяют только качественно установить уровень функционально активного фибриногена и наличие разных уровней ЛРФ в исследуемой плазме. Кроме того, использование тестов в нашей медицине затруднено в связи с дефицитом зарубежных ферментных препаратов. Задачей настоящего изобретения является разработка способа экспресс-тестирования состояния системы гемокоагуляции, одновременно обеспечивающего исследование набора параметров системы гемокоагуляции и повышение точности тестирования. Параллельной задачей является сокращение расхода человеческой плазмы для широкого диапазона исследований и использование отечественных ферментных препаратов. 5 Для^решения поставленной задачи использовали тромбиноподобный фермент из яда змеи Agkistrodon hatys halys, на основе которого был создан отечественный ферментный препарат Анцистрок-Н (Уга10 рова Т.П., Соловьев Д.А., Золотухин В.А. и др. Выделение тромбиноподобных ферментов из яда змей рода Agkistrodon // Тезисы доклада на конференции "Методы получения и анализа биохимических реак15 тивов. - Рига. - 1937. - С. 122). Этот фермент, подобно описанным Рептилазе и Анкроду, отщепляет от фибриногена только фибринопептид А, приводя к образованию фибринового сгустка. Он обла20 дает очень высокой специфичностью действия на фибриноген, при этом не взаимодействуя с другими компонентами системы гемокоагуляции. Ранее на основе Анцистрона-Н нами был предложен метод 25 количественного определения фибриногеі на в плазме крови человека (Платонова Т.Н., Сушко Е.А., Соловьев Д.А., Ена Я.М. Определение содержания фибриногена в плазме крови человека с помощью тром30' биноподобного фермента Анцистрон-Н и анализ состояния гемостаза в присутствии ингибиторов свертывания //Физиологический журнал. - 1993. - Т. 39. - № 1. - С. 65-74). 35 Медицинский результат достигается при разработке способа экспресс-тестирования состояния системы гемокоагуляции путем определения времени свертывания плазмы, включающего инкубацию 40 плазмы, введение раствора гемокоагулирующего ферментного препарата и определение времени свертывания, отличающегося тем, что в инкубированную плазму в объемном соотношении 2:1 вводят 0,35 45 NIH ед. ферментного препарата Анцистрона-Н; при определении времени свертывания выше нормального 30±2 с плазму разбавляют нейтральным буферным раствором не менее чем в 1,5 раза и 50 повторно определяют время свертывания разбавленной плазмы, по которому тестируют состояние системы гемокоагуляции путем количественного определения уровня фибриногена, наличия продуктов де55 градации фибриногена/фибрина и ингибиторов свертывания. Определяют эти показатели по следующим данным: при времени свертывания разбавленной плазмы, соответствующем норме, устанавливают гиперфибриногенемию; при времени свер 14516 тывания разбавленной плазмы выше норП р и м е р 1 (контроль, донор). К мы определяют количество фибриногена 0,2 мл стандартно полученной плазмы, в исследуемой плазме и при его уровне которая инкубировалась 1 мин при 37°С, ниже нормы судят о гипофибриногенемии; прибавляют 0,1 мл раствора Анцистрон-Н при нормальном уровне фибриногена оп- 5 с активностью 0,35 NIH. При непрерывределяют тромбиновое время свертывания ном встряхивании засекают время обраисследуемой плазмы, по которому при норзования сгустка. Время свертывания плазмальном времени свертывания судят о намы 30 с. личии продуктов дефадации фибриногена/ Вывод; в плазме данного человека софибрина, а при увеличении времени свер- 10 держится нормальное количество фибритывания не менее чем в 1,5 раза опреденогена, отсутствуют ПРФ и ингибиторы ляют наличие ингибиторов свертывания. свертывания крови. Для правильной интерпретации полуУровень фибриПРФ, ченных в анцистроновом тесте данных исАнцистрономкг/мл вое время, с пользуется соответствующая модельная 15. ногена, г/л система: для моделирования гиперфибриногенемии к донорской плазме добавляют2,89 32 30 ся определенные количества очищенного 3,06 28 фибриногена, для снижения уровня фиб.-2,50 риногена донорская плазма разбавляется 20 дефибринированной плазмой, для модеП р и м е р 2. Время свертывания лирования присутствия ПРФ и гепарина в плазмы при той же постановке теста 40 плазму вносят очищенные фрагменты фибс. Увеличение анцистронового времени мориногена и фибрина и экзогенный гепажет свидетельствовать о повышенном или рин. Обнаружено, что контрольное время • 25 пониженном уровне фибриногена в плазв тесте (30') получается при колебаниях ме. Исследуемую плазму разбавляли в 2 уровня фибриногена в пределах 2,2-3,2 раза нейтральным буфером. Проводили г/л крови. Снижение или увеличение уровня определение анцистронового времени, фибриногена приводит к значительному свертывания разбавленной плазмы по выудлинению анцистронового времени (см. 30 шеописанному методу. Время свертывачертеж). Приводимая на рисунке кривая ния разбавленной плазмы - 30 с, что может быть использована для количестсвидетельствует о гиперфибриногенемии. венного определения уровня фибриногена По калибровочной кривой (чертеж) опрев том случае, если в плазме отсутствуют деляли количественно уровень фибриноПРФ и/или ингибиторы свертывания кро- 35 гена: анцистроновое время 40 с в неразви. При этом необходимо отметить, что бавленной плазме соответствует 4 г фибтест "тромбиновое время" мало чувствириногена на 1 л крови. телен к колебаниям уровня фибриногена. Вывод: в плазме данного человека соНачертеже приведена зависимость вредержится повышенное количество фибримени свертывания плазмы в анцистроно- 40 ногена - 4 г/л крови, отсутствуют ПРФ и вом тесте от концентрации фибриногена. ингибиторы свертывания. Уровень фибриногена, г/л 4,0 4,0 4,0 5,0 . 4,8 ПРФ, мкг/мл _ \ П р и м е р 3. Время свертывания плазмы в анцистроновом тэсте 40 с. Увеличение анцистронового времени может свидетельствовать как о повышенном, так и о пониженном уровне фибриногена в 40 40 40 45 44 Разбавление плазмы, цл буфера + 100 цл плазмы Анцистроновое время разбавленной плазмы, с 50 100 150 100 150 Анцистроновое время, с 31 30 30 31 29 плазме. Исследуемую плазму разбавляли в 2 раза буфером. Время свертывания разбавленной плазмы - 45 с, что свидетельствует об отсутствии гиперфибриногенемии. Для подтверждения гипофибри 8 14516 фибриногена соответствует время в анцистроновом тесте 40 с. Вывод: в плазме данного человека содержится пониженное количество фибриногена - 1,25 г/л крови, отсутствуют ПРФ и ингибиторы свертывания. ногенемии проводили количественное определение уровня фибриногена известным методом. Обнаруживается уровень фибриногена 1,25 г/л крови. Эта цифра подтверждается калибровочной кривой на чертеже. Данному пониженному уровню Уровень фибриногена, г/л 1,76 1,25 ПРФ, мкг/мл Анцистроновое время, с Разбавление плазмы, цл буфера +100 ідл плазмы Анцистроновое время разбавленной плазмы, с 35 40 100 50 40 45 П р и м е р 4. Время свертывания донорской плазмы 30 с. В плазму вводят определенные количества очищенных фрагментов фибриногена и фибрина. Это позволяет установить следующее: при добавлении менее 10 мкг/мл крови фрагментов существенного удлинения анцистронового времени не наблюдалось; начиная с 15 мкг обнаруживается заметное удлинение времени в тесте (см. таблицу). Из таблицы также видно, что присутствие в плазме гепарина при введении человеку разовой дозы 20 тыс. ед. не'влияет на значение анцистронового времени. Кроме того, нами было проведено сравнение данных, полученных в предлагаемом нами тесте, с показаниями теста-аналога "атроксиновое время" (диагностический кит фирмы SIGMA, США) в присутствии разных количеств ПРФ. Показано, что влияние ПРФ на показания обоих тестов идентично, при этом тромбиновое время практически не реагирует на присутствие ПРФ, Уровень фибриногена, г/л 3.2 2.9 2,7 20 25 30 35 П р и м е р 5. Время свертывания плазмы в анцистроновом тесте 40 с, время свертывания разбавленной плазмы тоже 40 с. При количественном определении уровня фибриногена обнаруживали нормальное содержание фибриногена в крови - 2,7 г/л. Следовательно, увеличение анцистронового времени связано с присутствием в исследуемой плазме ПРФ и/или ингибиторов свертывания. Для прояснения ситуации проводили определение свертывания исследуемой плазмы тромбином. Получали тромбиновое время в пределах нормы - 12 с. Значит, в данной плазме содержится ПРФ, их уровень определяют по таблице: анцистроновому времени свертывания 40 с соответствует 200 мкг ПРФ на мл плазмы. Вывод: в плазме данного человека содержится нормальное количество фибриногена, однако присутствуют ПРФ в количестве 200 мкг/мл крови. ПРФ, мкг/мл Тромбиновое время, с Анцистроновое время, с Анцистроновое время разбавленной плазмы, с 80 160 200 13 11 12 34 37 40 34 36 40 чивается тромбином. Следовательно, в П р и м е р 6. Время свертывания данной плазме присутствуют значительплазмы в анцистроновом тесте 40 с, вреные количества ингибиторов свертывамя свертывания разбавленной плазмы тоже 40 с. При количественном определе- 55 ния крови. нии уровня фибриногена обнаруживали Выв'од: в плазме данного человека сонормальное содержание фибриногена в держится нормальное количество фибрикрови. При определении тромбинозого ногена и отсутствуют ПРФ, однако обнавремени свертывания обнаруживали, что руживается значительное количество инисследуемая плазма вообще не сворагибиторов свертывания крови. 14516 Уровень фибриногена, г/л " 3,5 2,5 2,8 ПРФ, м кг/мл 10 Тромбиновое время, с Анцистроновое время, с Анцистроновое время разбавленной плазмы, с >60 48 >60 38 43 40 38 45 40 При разработке предлагаемого теста было обследовано 68 человек. Среди них лица среднего (14 человек), пожилого (25) и старческого (9) возраста с гипертонической болезнью II ст., пожилого (8) и старческого (4) возраста с изолированной систолической артериальной гипертензией, практически здоровые лица пожилого возраста (8 человек). В качестве Контрольной группы были использованы 15 практически здоровых лиц молодого возраста. Плазмы, полученные стандартно, исследовали широким спектром методов, позволяющих охарактеризовать большое число показателей системы гемокоагуляции и фибринолиза. Среди методических подходов наряду с анцистроновым временем у этих лиц определяли уровень фибриногена в плазме крови двумя способами - с использованием тромбина (Белицер В.А., Варецкая Т.В., Бутылин Ю.П. и др. Определение"содержания фибриногена в плазме крови // Лаб. дело. - 1983. - № 4 . - С. 38-42) и Днцистрона-Н (Платонова Т.Н., Сушко Е.А., Соловьев Д.А., Ена Я.М. Определение содержания фибриногена в плазме крови человека с помощью тромбиноподобного фермента Анцистрон-Н и анализ состояния гемостаза в присутствии ингибиторов свертывания// Физиологический журнал. - 1993. - Т. 39. - № 1. - С. 65-74) в случаях присутствия ингибиторов свертывания крови, наличия растворимого фибрина {Варецкая Т.В., Михаловская Л.П., Свитальская Л.А., Ена Я.М. Определение растворимого фибрина в плазме крови // Клин, и лаб. диагностика. - 1992. - № 7. - С. 1014), продуктов расщепления фибрина и фибриногена, тромбиновое и протромбиновое время, активированное частичное 15 20 25 30 35 40 45 50 тромбопластиновое время (Бокарев И.Н., Щепотин В.М., Ена Я.М. Внутрисосудистое свертывание. - К.: Здоровье. - 1989), уровень антитромбина LU (Белицер В.А., Мусялковская А.А., Платонова Т.Н., Ена Я.М. Определение активности Антитромбина Ш в плазме крови // Лаб. дело. 1987. - № 4. - С. 255-258), использовали турбидиметрический экспресс-микрометод определения состояния систем свертывания крови и фибринолиза (Авт. св. СССР № 1777089, 1990), а также предлагаемый нами анцистроновый тест. В результате проведенных исследований показано, что тест "анцистроновое время" наряду с такими общепринятыми тестами, как АЧТВ, "протромбиновое время", "тромбиновое время", может быть от-, несен к скрининг-тестам. Тест рекомендуетдя использовать в случае использования плазм больных при назначении гепарина, при использовании экстракорпоральных методов лечения (гемосорбция, гемодиализ, плазмофорез и др.), 'Анализируя данные теста в соответствии с предлагаемой последовательностью операций, мы получаем данные об уровне фибриногена в плазме, о наличии ПРФ, о присутствии ингибиторов свертывания, о состоянии системы гемокоагуляции крови в целом. Анцистронозый тест отличается высокой чувствительностью, воспроизводимостью и информативностью. Его использование в совокупности с рядом доступных и широко используемых в нашей медицине подходов и при правильной интерпретации данных позволяет с высокой точностью установить ряд нарушений в Системе гемокоагуляции при минимальных затратах времени и человеческой плазмы. 11 Количество ПРФ, м кг/мл >10 40 60 80 160 200 300 12 14516 Анцистроновое время, с без гепарина с гепарином Тромбиновое время, с 30 32 33 35 36 38 30 32 34 35 36 39 46 14 14 14 15 15 15 15 45 Атроксиновое время, с 14 15 16 17 18 20 21 Упорядник Техред М. Келемеш Коректор М. Самборська Замовлення 543 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл м 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101