Засіб для корекції мікробіоценозу

УКРАЇНА UA С2 (11)28135 ад (51) 6 А61К9/52, 9/56, 35/66 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ і НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ і ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) ЗАСІБ ДЛЯ КОРЕКЦІЇ МІКРОБІОЦЕНОЗУ (21) 98126394 (22) 03.12.1998 (24)16.10.2000 (33) UA (46) 16 10.2000, Бюл. № 5, 2000 р. (71) Григор'єв Олександр Вячеславович (72) Григор'єв Олександр Вячеславович, Єгорова Світлана Михайлівна, Григор'єва Тетяна Олек сандрівна (73) Григор'єв Олександр Вячеславович (51) 6 А61К9/52, 9/56, 35/66 '* (54) Засіб для корекції мікробіоценозу (56) RU 2017486 СІ, 15.08.94 . RU 2020932 СІ, 15.10.94 RU 2119796 СІ, 10.10.98 (57) 1 Засіб для корекції мікробіоценозу, який міс тить в собі, сорбент з нанесеними на нього кліти нами аутохтонних штамів мікроорганізмів, який відрізняється тим, що він являє собою виконані з фармацевтично придатного полісахариду мікрока псули з діаметром, що не перевищує 100 мКм, в кожній з яких розміщений придатний сорбент з розміром частинок 10-100 мКм, з нанесеними на них не менше 12 клітинами ауто хтонних штамів мікроорганізмів. 2, Засіб по п.1, який відрізняється тим, що прида тний сор бент має зда тність сорбува ти на 1 мм 2 поверхні не менше 1,8-10 3 клітин аутохтонних штамів мікроорганізмів. 3. Засіб по п.1 або 2, який відрізняє ться тим, що придатний сорбент має здатність сорбува ти на 1 мм 2 поверхні 2,0-107-1,ОЮ мікроклітин. 4.Засі б по п .1 або 2, а бо 3, який відріз няється тим , що мікрокапсули виконані з похідних целюлози. 5 . Засіб по п .1 а бо 2 , а бо 3 , або 4 , який відрізняє ться тим, що мікрокапсули, які виконані з похідних целюлози, покриті каррагінаном або альбуміном. CM О Винахід відноситься до галузі медицини та ветеринарії, а саме до фармакології, зокрема, до пробіотиків, та може бути використаний при корекції мікробіоцинозу організму людини (дітей та дорослих) та тварин. На сьогоднішній день мікробні екологічні системи людини приймають як своєрідний орган, який відіграє важливу роль у забезпеченні імуностимулюючої, витаміноутворюючої ферментної функції організму. Крім того, нормальна мікрофлора бере участь в регуляції вмісту холестерину в крові, нормалізації кров'яного тиску, має антимутагенн у та антиканцерогенну і протиінфекційну дію. Серед представників нормальної мікрофлори кишечника домінує рід Bifidobacterium, який складається з 24 видів. Існ ує обґр унто ване переконання, що біфідобактерії, що знаходяться в слизовому шарі не тільки кишечника, але, наприклад, піхви у жінок, відіграють визначальну роль в процесі корекції мікробіоценозу. Серед патологій кишечника значне місце відводиться дисбактеріозам, які обумовле н і ві дсутн і стю а бо з н иж ен ня м р і вня біфідобактерій, наявністю кишечних паличок із зміненими ферментативними властивостями, а також присутністю в ки шечник у ши гел, сальмонел, ентеропатогенних кишечних паличок, протеїв, ентеробактерів, цитобактерів, синегнійних паличок, стафілококів. На сьогоднішній день існує ряд препаратів, направлених на корекцію мікробіоценозу, зокрема дисбактеріозу кишечника встановленої етіології", наприклад, колібактерин (ФС 42-253 ВС-89), але відомий засіб не забезпечує в достатній мірі антагоністичної протиінфекційної активності та необхідного рівня приживлюваності мікроорганізмів на тканинах, та крім того, він має відносно низьку біодоступність. Найбільш близьким до рішення, що заявляється, є засіб, який корегує дисбактеріоз різноманітної етіології І являє собою активоване вугілля, на поверхню якого нанесені клітини ауто хтонних штамів в кількості 2.1-103-1,0-105 на 1 мм 2, а частки активованого вугілля мають розмір менше ЗО мКм (патент РФ № 2017486). Хоча антиінфекційна активність та приживлюваність ауто хтонних мікроорганізмів характеризується відносно високими показниками, відомий засіб має ряд не доліків. По-пер ше , через механічн у неза хи щеність засобу під час його вживання виниває елюція мікробних клітин (МК) вже в КО СО 00 CM 28135 верх ніх відділах кишеч ник а , що є прич иною , як а з ме н ш у є йо г о е ф ек т ив ніс ть К рім то го, і мо бі ліз ов а ні н а по в е рх ні акт ив ов а ного ву г і л л я мікробні клітини пі д д а ю т ь с я ш кід л ив о му в пл ив у ш лу нк ов ог о с оку і ч ас тк ов о ги нуть , що також знижує ефектив ність відомого за с обу І, н а р е ш т і, щ е о д н и м н е д о л ік о м з а с о бупр от от ипу є йог о низь ка зб ер е жніс ть з а зв ич а й них у м о в че р е з не д ос т ат н ю в и ж ив а ніс ть мік ро б н их к літ и н З ас і б з б е ріг а є т ь с я п р и т е м п ер а ту рі 8° С 4на пр отя зі року З а д аче ю ць ог о вин ах о ду є с тв ор е нн я з ас о бу , яки й ко р екту є мік ро б ю ц ен о з , ш лях о м с по лу че н ня ко мп он ен тів, як і в х о дя ть до й ог о с кла ду, та з ах ис ту йо го бі о ло гіч н о ак ти в н ої ч ас т ин и в ід в п л ив у с ер- е д ов л щ а ш л у н ку та ки ш е ч н ик ,а в нас лі д ок ч о г о до* с яг ає т ь с я підв и щ е н ня ф а р м ак о ло лч н ої як ос ті за с обу т а йо го к літи н но- б ю ло пч н ої е ф ект ив нос ті П ос тав л е на з а дач а в и рі шу є ть с я т и м щ о зас і б, , яки й ко р егу є п ро ц ес и мік р об ю ц е но зу та міс т ить в с о бі с ор б ен т з н ан ес ен и м и н а нь ог о к літ ин а м и ау тох т а нн их ш та мів мік ро о рг аніз мів згід но з в ин ах о, д о м, яв ля є с о бо ю вик о на ні з фа р м а це вт ич не пр и д ат но г о по ліс ах а ри ду мік ро ка пс у ли з ді а м ет р о м , який не перевищує 100 мКм , в кожній з яких ро з мі щ е н ий пр и да т ни й с ор бе н т з р оз мі р о м час т ин 1 0- 10 0 м К м з н а н ес ен и м и на н их н е м ен ш е 2 1 клі ти н а ми а у т ох т о нн их шт а мів мік ро о рг ані з мів Ау то х т о нн и м и мік р оо р га ніз м а м и є мі кр о орга ніз м и - пре дс т ав ни ки но р м а ль н ої мік ро ф л о р и л ю ди н и а бо тв ар ин и (бі фі до б акт ер м, ент е рок ок и, лактобацили , шлункові палички та ін ), які в ід нос ят ь с я до ро ду Bif ido b ak t eriu m , Lac t o b ac illus , Es c h e nc hia, St re pt oc oc c us т а ін Д о при д ат н их с о рб е нтів в ід нос я ть с я с о рб е нт,и які д оз во л е ні М ініс те рс т во м ох ор о ни зд о ро в'я Ук раї н и т а м а ю т ь нас ту п ні в лас ти в ос ті а) с о рб у в ат и н а с в ої й по в ерх ні мік ро б ні К ЛІ Т И Н И ау т ох т он н их мік р оо р га ніз мів в К І Л ЬК О С ТІ н е м ен ш е 1, 8 10 3 мікр об них кліт и н на 1 м м 2 дос ту пн ої д ля н их пов е рх ні , б) не м ат и в л ас т ив ос т ей д ес т ру кту ру в ат и мік ро б ні кліти н и ау т ох т он них мікр оо рг а ніз мів , в) м а т и в л ас т и віс т ь з н ах о д и т ис я в п о р о ш к о п о ді б ні й ф о р м і та м а т и р о з мі р и ч ас т и н ві д 1 0 д о 10 0 м К м, п ри ць о му с т ру к ту ра с ор б е нт у не п о в и н на МІНЯТИСЯ ПІД ВПЛИ ВОМ ВОДИ С о р бе н та м и , які ма ю ть н ав е де ні ви щ е в л ас т и в ос ті, м о жу т ь бу ти, нап ри к ла д, а л ю м ос и лік ат и, актив ов ан е в у гі л ля та ін Ав т ор а м и ц ьо го ви нах о ду зап р оп о но ва н а н а ве де н а кон це нт р аці я кліти н на 1 м м 2 пов ерх ні с о р б ен ту , О С КІ Л Ь К И та ка ко н ц ен тр а ція ви зн ач ає н е обх і дну при ж ив л ю в аніс ть ав т ох то нн их мік р оо рг а ніз мів н а с л из ов і й об о л он ці ш лу н ку щ о в , с в о ю ч е ргу є одн и м з в из нач а ю ч их ф акт орів е ф ек ти вн ос ті ліку в а н ня за с о б о м щ о за яв л яє тьс я Ко н ц ен тр а ціє ю , як а ре ко м е н ду єт ьс я д л я от р и ма н ня на й бі ль ш в ис о к их ре зу л ьт аті в , до ці л ьн о вв а ж ат и 2, 0 1 0 7 - 1, 0 1 0 8 М К/ м м 2 П р и по п а д а н ні ка пс у л и в п о л е ап л ік а ції від бу в ає ть с я п р оз кр и тт я під вп л ив о м ф ер м е нті в ш л у н к о в о г о с о к у Д л я р о з к р и т т я к а п с у л и н -е о бх і дн о , щ о б ц ьо м у пр о цес у від п ові д ав м а те рі а л ка псу ли Н и м м о ж е бут и бу дь- як и й п р и да т ни й для таких цілей поліс ахарид , який мав би адгезійну вл ас т ивіс ть до с л и зов ої , на пр ик л а д, ш лу нку Ав т о ри в ва ж а ю ть п ох і д ні це л ю л о з и н ай бі л ь ш пр и д ат ни м и с то ч к и зору н ая в н ос ті за зн ач е ної в л ас т ив ос ті, тех н о ло гіч н ос ті та ек о ло пч н ос ті К рі м то го, за зн ач е ні вл ас т и во с ті м ат е ріа л у мік р ок апс у л підс и л ю ю т ь с я як щ о ї х пок р ит и ка , р ра пн ан о м та/ а б о а ль бу мін о м З ах ис т ак ти в н ої ч ас т ин и з ас о бу то бт о с о рб е н, т а з ( м о бі л і з ов а н и м и на нь ому к лі т и н а м и мік р оо рг а ніз мів, д озв о л яє кап с у лі р оз кр ит ис я н а, пр ик л а д , а ш лу нку , д е і пот ріб н а ґі ді я на с л из ові й за р ах у н ок т рь ох п ро ц ес і ,в як і п р ох о дя ть п а ра л е ль н о ад г езі й на ак т ив ніс т ь кап с у ли щ о ро зк ри, л ас я, ад ге зій н а ак т ив ніс ть с ор б е нт а та мік ро б н их клітин Суку п ність цих п роцесів дає найбіль ш ви с ок и й р езу л ь та т за у м ов и щ о р о з мі р ч ас т о к с ор , б ен т а бу д е зн ах о д ит ис ь в ді а па з оні1 0- 1 00 м К м, а кіл ь кіс ть к літ и н н е м е н ш е 1 2 Р оз м і р с а м ої к апс ул и, а с а м е ї ї ді а м е т р , не п о в и не н п е р ев и щ у в а т и 100 м К м Д л я в из н ач е нн я опт и м а л ь н их ро з мі рів ч ас то к с ор б е нт а в зас о бі, щ о з аяв л яє ть с я, го ту в а л и с у спе нзії акт ив ов а но го ву г ля з п ер ев а ж ни м р о з мір о м часток від 5 до 100 мКм , здійс ню вали на їх п о в е рх ні о д н ак о ву п ов е р х н е ву к о н ц е нт р а ці ю 1, 010 6 М К/ м м 2 (бі фід о ба кт ер п , л акт о ба ц и ли ), з у рах у в а н ня м то го, щ о н и жні й рів ен ь оп т и м ал ь н ог о нас и ч е ння с л из ов ої с кл а дає 1, 4 10 5 М К/ м м 2 С у с п е н зії , я кі п р е д ст а в л я ю т ь мі к р ок о л о н ч різн их ро з мірів (п о К І Л ЬК О С ТІ мік ро б них к літи н, с о рб ов а них на о дні й час т ці с ор б ен т а) о д н ор а зо в о вв о ди л и пе р ор а ль н о щу р ят а м у ВІ Ц І 4 т и жні в з та ки м ро зр ах у нк о м , що б кіль кіс ть вве д ен их л акт о б а ц и л т а бі ф і д о б а кт е рі й ві д п ові д а л а д о б ові й д о зі , яка р ек о ме н до ва на д ля л ю д ин и (З О 10 9 м К м ) у пе р е ра х у нку н а ва гу тв а р и н и Т в а р и н и бу л и р озпо ді л е ні н а 2 г ру пи Ч ер е з 7 г о д ин п р е па ру в а л и ки ше чн и ки пе р шої груп и , а че р ез 24 го ди ни - дру гої Го м ог е на т и с л из ов ої в ис ів а л и на ж ив и ль ні с е ре д о ви щ а т а виз н ач а л и рів е нь ко л оні за ції с л и зо в ої Р е з у л ь т а т и е к с п е р и м е н т у н а в е д е н і в т а б ли ці 1 28135 Таблиця 1 Рівень колонізації слизової шлунку щурів біфідобактеріями та лактобацилами через 7 та 24 години в залежності від розміру мікроколонії Розмір час- Пов ерхня одток актив о- нієї клгтини в аного вугілля Розмір мікро- Кількість біфідобактерій, що колонії (чис- висіяні з 1 мм2 слизової шлунку лоМК сорбов . на 1 частці сорбента МК/мм2 слизов ої мКм мКм2 МК Через 7 год Г1П '' 300 2-6 1,6-103 мшшшт ЯМ 2 4-'І б" ' 40-180 3 5,4-ЇО ? 96-10* 6,0-Ю4 Через 24 год 1,0-103 шшшшшш 3.6-10* л КІЛЬКІСТЬ лаіс гобацил, що висіяні 3 мм 2 слизов ої шлунку Характер колонізаційного процесу МК/мм 2 слизової Через 7 год. 6.1-1Q3 Ь ,6 Ю 4 2,7*10* 1-Ю* 160-48Р 2,9-10* 4,0- Ю" 0,5-103 не в ияв лено 0,7-103 Тип процесу Згасаючий НИ 9.3-10-* 1000-3000 Через 24 год 1,0-103 90-270 Примітка: сірим шаром виділені границі активної зони. З наведених в таблиці 1 результатів випливає, що підтримуючий характер колонізації слизової, коли мікробні клітини, що входять до мікроколонії, здатні до розмноження, спостерігається при викор истанн і часток со рбен та р озмір ом від 1 0 до 100 мКм. Частки сорбенту розміром 100 мКм та вище на поверхні слизової не затримуються. Частки розміром 5 мКм та нижче, які є мікроколоніями розміром 5-6 МК, колонізаційної дії самостійно не чинять (необхідна їх конгломерація в 12-15 штук). Мінімальним рівнем поверхневої концентрації мікробних клітин ауто хтонних мікроорганізмів, сорбованих на сорбенті, можна вважати 12-180 мікробних клітин, розміщених на частці розміром 10-20 мКм з поверхнею 6,0Ю2-2,4-103 мКм 2 (0,00060,0024 мм 2). Відповідно мінімальний рівень поверхневої концентрації в препараті складає 2,0103-7,5-104 мікробних клітин аутохтонних мікроорганізмів на 1 мм 2 сорбента. Із цієї ж таблиці випливає, що мінімальний розмір мікрокопонії повинен бути не нижче 12-180 7.2-10' 0,8-103 Не виявлено МК а уто хтонних мікроорганізмів, сконцентрованих на одній або декількох частках сорбенту з загальною проекцією площі на поверхню слизової' не більше 0,00024 мм 2. З метою обгр унтування максимального рівня поверхневої концентрації мікробних клітин ауто хтонних мікроорганізмів на поверхні сорбенту, біфідобактерії сорбували на поверхні порошкоподібного активованого вугля з таким розрахунком, щоб отримати препарати, які мають різну поверхневу концентрацію мікробних клітин від 102 до 10 МК/мм 2 на одиницю поверхні сорбенту. При цьому враховували, що препарати, що мають поверхневу концентрацію вище 4-Ю6 МК/мм 2, містять в собі більше одного мультишару клітин. Далі рівні аліквоти сорбенту вводили перорально щурам і через 3 години препарували кишечники. Гомогенати розсівали на живильні середо ви ща . Вр а хо в ува ли р і ве н ь а дге з і ї біфідобактерій на одиницю поверхні слизової в залежності від по вер хнево ї концен траці ї по мікробних клітинах на сорбенті. Результати дослідів наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Залежність адгезії біфідобактерій на слизовій кишечника щурів від їх поверхневої концентрації на активованому вугіллі Вихідна поверхнева концентрація мікробних клітин біфідобактерій на сорбенті МК/мм сорбента Отриманий рівень адгезії біфідобактерій на слизовій кишечника щурів ІМК/м М СЛИЗОВО! 28135 Примітка: сірим шаром виділена зона насичення слизової мікробними клітинами. З таблиці 2 виникає, що максимальний рівень поверхневої концентрації, доцільної при конструюванні препарату, складає 107-10а МК/мм 2 сорбента. Дальше насичення слизової при збільшенні поверхневої концентрації мікробних клітин на сорбенті практично не збільшується. Винахід пояснюється прикладом конкретного виконання. Приклад 1 Засіб, що заявляється, отримують в два етапи. Спочатку клітини мікроорганізмів сорбують на частках сорбенту, який здатний створити на своїй по ве р хні п о вер хне ву кон цен тр аці ю не мен ше 1 ,8 -1 0 3 м ік ро б ни х к лі ти н а уто хто н н и х мікроорганізмів на 1 мм 2 поверхні. Отриману суспензію перемішують протягом 20-40 хвилин. Після цього суспензію змішують з капсулоутворюючою речовиною, якою є похідні целюлози, які можуть бути покриті каррагенаном або альбуміном у співвідношенні - на 4 частини суспензії 0,5-1,0 частини капсулоутворюючої речовини і розпилюють через фільєри з таким розрахунком, щоб отримати мікрокапсули розміром від 10 до 100 мКм в діаметрі. Розпилення проводять таким чином, щоб температурний режим та рН середовища не пошкодило життєздатності мікроорганізмів (рН в діапазоні 7,0-7,3, температура не вище 22-26°С). Мікрокапсули, які містили в середині частки сорбенту з сорбованими на них ауто хтонними мікроорганізмами, помістили в лотки та піддали ліофільному сушінню при заданому режимі (тривалість сушіння 72 години, охоложення при температурі не менше -45°С, нагрів при температурі не ви ще 24-26°С, поверхне вий шар матеріалу не більше 1,0-1,5 см). Отриманий препарат є порошком, кожна частка якого створює мікроколонію ауто хтонних мікроорганізмів. Мікроколонія складається з мікробних клітин (не менше 12-180), сорбовани х на одній або декількох частках сорбційного матеріалу. Збільшення кількості клітин в мікроколонії не впливає на якість та ефективність препарату. Фармакологічна дія засобу, що заявляється, обумовлена наступними факторами: а) збереженням клітин мікроорганізмів при проходженні через шлунок; б) адгезією мікроколонії на слизовій в полі аплікації; в) частковим розчиненням мікрокапсули та визво ленням часток сорбен ту з нане сеними на нього мікробними клітинами аутохтонних мікроорганізмів; г) наступною адгезією часток сорбенту з нане сеними на них мікробними клітинами на слизовій поверхні; д) колонізацією слизової поверхні кишечника; є) кількістю введени х в організм мікроколоній (не менше 104-105). Приклад 2 При визначенні клініко-бактеріологічної активності засобу, що заявляється, та являє собою капсулу з по хідних целюлози, покритих альбуміном, в яки х розмі щен і частк и ак ти во ва но го вугілля (розмір часток від 5 до 80 мКм), як аутохтонні мікроорганізми використовували бі фідобактері ї, що були нанесені на наведені вище частки активованого вугілля в кількості не менше 12 клітин. Як засіб порівняння використовували комерційний біфідумбактерин. Препарати вводили перорально добровольцям - носіям умовнопатогенних мікроорганізмів. Отримані результати представлені в таблиці 3. Таблиця З Порівняльна бактеріологічна ефективність нанесеного на активованому вугіллі та мікрокапсульоаного пробіотика (Біфідумбактерин Ш) та комерційного аналога біфідумбактерину. Добова доза препарата 6 мікроколоніях вмк Рівень нормалізації мікробіоценозу кишечника у носив умовнопатогенних мікроорганізмів (УПМ) в % від отримавших препарат Біфідумбактерин ЇМ БІфідумбалтерин комерційний 3-Ю3 Збільшення біфідобактерій 15,1±1,3 3-Ю4 85,8±1,6 65,9±4,1 17,5±2,2 3-Ю5 91,7±1,3 8б,7±б,2 26,0±4,2 Дані таблиці 3 свідчать про наступне: а) клініко-бактеріологічна ефективність, яка полягає в збільшенні (нормалізації) рівня біфщобактерій та елімінації з організму умовнопатогенних мікроорганізмів, простежувалась при мінімальному введенні 3,0-104 мікроколоній; б) в клініко-бактеріологічному плані ефек тивність імібілізованого мікрокапсульованого пре парату ви ща порі вняно з комерційним анало гом біфідумбактерину. Елімінація УПМ 4,2±0,1 Збільшення біфі- Елімінація УПМ добактерій нема ефекту нема ефекту _j 36,4±3,8 60,0±4,2 Приклад З Для визначення фармакологічної якості мікрокапсульованого препарату порівняно з комерційними препаратами біфідумбактерину та лактобактерину зазначені препарати вміщували в термостат на прискорене зберігання при температурі 37±0,1 °С. Через один , два та три місяці препара ти висівали на відповідні живильні середовища, визначали загибель мікробних клітин у відсо тках від 28135 початкової кількості, яка була закладена на зберігання. Отримані рез уль тати на ведені в таб лиці 4 і свідчать про те, що збережність засобу, що заявляється, вища ніж відомих засобів Таблиця 4 Терміни зберігання імобілізованого на активованому вуглі та мікрокапсульованого пробіотика з включенням біфідобактерій Зберігання при темпер-рі 37° С Падіння активності з % від початкової кількості Е 1 місяць 2 місяці 3 місяці 32,0% 18,2% 92,0% 19,6% 100,0% 20,6% 8,0 % 10,0% 16.0% Комерційного біфідумбактерина Імобілізований та мікрокапсульовании біфідумбактерин (мобілізований та мікрокапсульований лактобактерлн Таким чином, представлений винахід дозволяє отримати препарат-пробіотик, який внаслідок сукупності сво їх власти востей має високу профілактичну та лікувальну дію, а, крім того, поліпшені умови зберігання. ДП "Український інститут промислової власності (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лео Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 Підписано до друку ttf". О