Пристрій для двоступеневого розморожування сперми плідників у формі відкритих гранул

28723 Пристрій відноситься до галузі тваринництва, а саме до штучного осіменіння маток і може бути використаний при розморожуванні сперми плідників, замороженої у формі відкритих гранул. Відомий пристрій для розморожування сперми тварин, замороженої у формі гранул, який має ємність із водою (теплоносій), штатив з пробірками, вимірювач температури теплоносія та електронагрівний елемент, розміщений під дном ємності. Пристрій має потенціометр (електротермометр) для підтримання необхідної робочої температури теплоносія. (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1981). Даний пристрій працює в такому режимі. В ємність наливають 400-500 мл дистильованої води температурою 10-25°C. В штатив вставляють контрольний термометр, за яким проводять контроль робочої температури теплоносія. Включають електричне живлення нагрівника. Після виходу на режим (температура води утримується на встановленому рівні 38-42°С) в штатив ставлять скляні пробірки і в кожну з них вносять по 1 мл вторинного розчинника (2,9%-ний розчин натрію лимоннокислого). Пристрій наближують до горловини посудини Д'юара, в якому зберігається сперма в рідкому азоті (-196°С). В горловину посудини піднімають каністру із рідким азотом і гранулами сперми. Пінцет охолоджують в азоті, дістають одну гранулу і, як можна швидше (за 1 секунду), переносять її у пробірку із 1 мл 2,9%-ного розчину натрію лимоннокислого. За цих умов гранула об'ємом 0,2 мл розморожується протягом 35-45 секунд. Середня швидкість розморожування складає 4,4-5,6°С/с, а в зоні критичних температур, де проходить плавлення льоду, -30-0°С швидкість розморожування -2,5°C/c. Згідно з цією ж інструкцією категорично забороняється розморожувати гранули при кімнатній температурі. Недоліком наведеного пристрою є наступне: Оскільки процес розморожування проходить у скляній ємності (пробірка, флакон) - слабкому провіднику тепла, після швидкого перенесення гранули об'ємом 0,2 мл із рідкого азоту (t-196°С), температура розчину цитрату натрію у пробірці миттєво знижується із +42 до 2-4°С і утримується на такому рівні протягом 40-50°С до повного розморожування гранули. За цих умов сперматозоїди знаходяться тривалий час в зоні критичних температур (30-0°С), внаслідок чого з анабіозу виходить лише до 50% заморожених клітин, із яких, в свою чергу, у 45,0-50,0% клітин ушкоджується акросома і вони в заплідненні яйцеклітини участі не приймають. Найбільш близько до передбаченого винаходу є пристрій для відтаювання замороженої сперми тварин, автори Е.М. Платов, Е.Ф. Болбасов, А.И. Лепехов і Г.А. Чудотворцев, а.с. А61D7/02 № 1126296 (3513861) від 23.11.1982 колишнього CPCР прототип, який включає нагрівник, виготовлений у вигляді електромагнітної котушки, розміщений в корпусі пристрою. На корпусі нагрівника закріплений лоток, який може повертатись відносно горизонтальної осі, а метою короткочасного витримування цілої серії спермодоз (15-20 штук) укупі перед подаванням їх в нагрівник. Лоток має рукоятку для повертання його і подачі гранул у нагрівник вручну. Гранули по 15-20 штук насипають одночасно, алюмінієвою ложкою, у лоток, витримують певний час, видаляють частину холодоагенту (рідкого азоту) і поворотом рукоятки переносять їх у нагрівник для повного розморожування, яке проходить без використання 2,9%-ного розчину натрію лимоннокислого. Недоліками відомого пристрою є: - відсутність постійного стандартизованого режиму розморожування кожної гранули, оскільки посерійне зберігання (15-20 штук) спермодоз у лотку довго стримує мінусові температури в центрі серії, і значно швидше розморожуються крайні, розміщені окремо, гранули. Тому процес зняття холодоагенту із всієї серії сперми проходить не рівномірно, значна частина спермодоз може входити в зону критичних температур (-50°С і вище) ще в лотку, при яких відбувається порушення акросомного апарату сперміїв; - не передбачено регулювання експозиції зняття холодоагенту у зв'язку з об'ємом гранули, складом розчинника та температурою навколишнього середовища; - відсутність елементів, що забезпечують регулювання тривалості витримування гранул в лотку під час попереднього їх підігрівання, яким визначається температура як на периферії, так і в центрі гранули; - конденсування парів води із повітря, яке має місце на гранулах всієї серії під час попереднього зняття холодоагенту на лотку знижує осмотичний тиск в розмороженій спермі, а значить рухливість і виживаність сперміїв; - тривале витримування відкритих гранул на повітрі є причиною підвищення бактеріального забруднення сперми. Таким чином, даний пристрій не передбачає програмного стандартизованого зняття холодоагенту з кожної гранули, збереження її санітарної чистоти і застосовується лише для серійного розморожування сперми баранів без застосування вторинного розбавника, тому не може бути застосований для розморожування сперми бугаїв по одній спермодозі у скляній пробірці із 2,9%-ним розчином натрію лимоннокислого. В основу винаходу поставлено задачу розробити пристрій для забезпечення стандартизованого програмного режиму попереднього зняття холодоагенту для всіх гранул, залежно від їх об'єму, складу розбавника та температури навколишнього середовища, підвищити швидкість розморожування гранул в зоні критичних температур (-70-0°С) у скляній пробірці при температурі теплоносія (розчин натрію лимоннокислого) +38°C, уникнути конденсації водяних парів і бактеріального обсіменіння шляхом пропускання кожної гранули окремо через одноразовий поліетиленовий чохол, вставлений в трубку, затримки її протягом певного часу для зняття холодоагенту, за допомогою реле подвійної витримки часу, ізолювання від навколишнього середовища на період попереднього підігріву гранул, цим самим підвищити вихід числа сперміїв з прямолінійними рухами і цілісними акросомами після розморожування, їх рухливість, виживаність, запліднювальну здатність та розширити галузь використання пристрою. 28723 Поставлена мета досягається тим, що пристрій для двоступеневого розморожування сперми плідників у формі відкритих гранул, який має ємність із водою, куди вставлений штатив із пробірками, вимірювач температури (термометр) та підігрівач додатково укомплектований блоком попереднього зняття, від -196°С до певних температур (-70°С), холодоагенту із заморожених гранул, спеціальною трубкою для попереднього підігріву гранули, одноразовим поліетиленовим стерильним чохлом, що забезпечує закриту систему подачі спермодоз до розморожування, шторкою, яка закриває гранулу на період її підігріву і цим самим обмежує контамінацію останньої мікрофлорою та вбирання гігроскопічної води із повітря, штоком, з'єднаним з реле подвійної витримки, експозиція якого регулюється від 0 до 270 секунд, що забезпечує можливість вибору оптимального режиму попереднього підігрівання гранули у зв'язку з її об'ємом, складом розбавника та температурою навколишнього середовища. На фіг. 1 зображено пристрій двоступеневого розморожування сперми плідників у формі відкритих гранул (пристрій), загальний вигляд. Пристрій має: корпус металевий 1, в який вставляють пристрій для розморожування сперми 2, в середині якого в ємність для води 3, штатив для скляних пробірок 4 і вимірювач температури водяної бані 5. Пристрій обладнаний блоком попереднього зняття холодоагенту із замороженої гранули 6, який кріпиться до металевого круга, вмонтованого на шарикопідшипниках у верхній частині корпусу 7. Органи управління та індикації 8-11. На фіг. 2 зображена функціональна схема блока попереднього зняття холодоагенту. До складу блока входять: металева трубка 12, яка має отвори посередині стінки. В нижній отвір входить шток і утримує гранулу на період зняття з неї холодоагенту, а у верхній - вмонтовано діафрагму для перекриття просвіту поліетиленового чохла зверху на період утримування гранул. В середину металевої трубки вставляють одноразовий поліетиленовий чохол. Шток затримки гранули для попереднього підігріву і подання її на кінцеве розморожування з'єднується із електромагнітом, експозиція якого регулюється від 0 до 270 секунд. Трубка завершується лійкоподібним розширенням 13, яке виходить на лицеву панель. В основі корпусу вмонтовано підігрівач 14. Електронна частина блока включає два електромагніти ЕМ1 та ЕМ2, схему управління роботою електромагнітів СУ, блок живлення пристрою БЖ, трансформатор Тр, вмикач 8, кнопку пуску схеми витримки 9, регулятор часу витримки 10, індикатори роботи блока попереднього підігріву гранул та подання їх у пробірку для кінцевого розморожування 11. Джерелом живлення підігрівача і реле часу є електричний струм напругою 220 В, або постійний струм від акумуляторних батарей +12 В, для чого в металевій станині приладу вмонтовано перетворювач струму, що підвищує ступінь універсальності пристрою і розширяє можливості його використання крім ферм на випасах (луги, пасовиська в літніх таборах, приватних господарствах та інших місцях утримання худоби). Наявність регулятора подвійної витримки реле часу дозволяє вибрати режим двоступеневого розморожування гранул всіх прийнятих у виробництво об'ємів (0,1; 0,2 та 0,5 мл) для бугаїв, жеребців та баранів, що значно розширює галузь його застосування на інші види худоби. Пристрій двоступеневого розморожування біологічних об'єктів працює так: Відомий пристрій для розморожування сперми в формі гранул вставляють в корпус передбачуваного пристрою, наливають у нього 500 мл дистильованої води. Передбачуваний пристрій підключають до електромережі чи акумуляторних батарей на 10 хвилин для виходу підігрівача на постійний режим роботи +38±0,5°С. Після чого, в трубку блока зняття холодоагенту вставляють одноразовий поліетиленовий чохол, а у штатив поміщають стільки скляних пробірок, скільки гранул планують розморожувати, але не більше 5. В кожну із пробірок наливають по 1 мл 2,9%-ного розчину натрію лимоннокислого. Через 3 хвилини із посудини Д'юара пінцетом дістають одну гранулу, струшують краплини азоту і опускають у лійкоподібне розширення трубки блока попереднього зняття холодоагенту, після чого натискають на кнопку пуску реле. Опускаючись по трубці, гранула відкриває діафрагму, проходить її і стримується посередині трубки штоком блока для зняття холодоагенту, де і відбувається віддача холодоагенту гранулами до критичних температур -70°С (перший ступінь розморожування). Оптимальна витримка гранули визначається за допомогою термопари з обов'язковим врахуванням температури навколишнього середовища, розміру гранули та складу розбавника і виставляється за допомогою регулятора, виведеного на панель приладу. Оптимальною експозицією попереднього підігрівання гранул, приготовлених на лактозо-гліцерино-жовтковому розбавнику, об'ємом 0,1 мл при t +20°С є 10 секунд; (табл. 1) об'ємом 0,2 мл при t +20°С - 20 с, а 0,5 мл - 40-45 с. Із зміною складу розбавника та температури навколишнього середовища тривалість попереднього підігрівання гранул змінюється. Роботою штоку і шторки керують електромагніти. Після проходження запрограмованого часу спрацьовує блок управління і за допомогою електромагнітів, відкривається шток, стримуючий гранулу; остання провалюється у скляну пробірку з 2,9%-ного розчину лимоннокислого натрію із +38°С для кінцевого (другий ступінь) розморожування, а шток повертається у вихідну позицію. Температура кожної гранули перед попаданням у розчин натрію лимоннокислого становить -80-100°С. Таким чином, період до розморожування гранули в розчині лимоннокислого натрію скорочується із 40 секунд у відомому пристрої до 20-25 с - у передбачуваному, а швидкість розморожування підвищується в зоні критичних температур до 4,2°С/с або складає 168% до аналогічного показника у відомому пристрої. Внаслідок цього число сперматозоїдів із прямолінійними рухами в дозі після двоступеневого розморожування збільшується на 8-9%, їх рухливість - на 0,1-0,2 бала, виживаність - на 2,4 год., а запліднювальна здатність сперматозоїдів на 12,3% (Р>0,999), (табл. 2). Можливість зміни тривалості 28723 експозиції гранули за допомогою регулятора при попередньому її підігріванні від 0 до 270 с дозволяє використовувати прилад для двоступеневого розморожування сперми плідників різних видів с.-г. тварин (бугаї, коні, барани) у формі гранул різних за об'ємом (0,1; 0,2; 0,5). Застосування відомої температури для розморожування сперми +38°С виключає можливість перегріву сперматозоїдів при досягненні високих швидкостей її розморожування. Закрита система попереднього підігріву гранули (поліетиленовий чохол і шторка) виключає можливість конденсації водяних парів та бактеріального забруднення гранул. Таким чином, порівняно з відомим, передбачуваний пристрій для двоступеневого розморожування сперми плідників у формі відкритих гранул, завдяки наявності блока попереднього зняття холодоагенту із реле подвійної витримки часу, які являють собою автономний блок, що забезпечує попереднє програмне підігрівання кожної спермодози до конкретних (критичних) температур поза теплоносієм (2,9%-ний розчин лимоннокислого натрію) і, таким чином, суттєво прискорює процес кінцевого її розморожування в зоні критичних температур (-70-0°С), а також закритої системи подачі спермодоз до кінцевого розморожування гранул, яке значно знижує конденсування водяних парів та забезпечує санітарну чистоту сперми під час розморожування, двох джерел одержання енергії живлення (електромережа та акумулятор) дозволяє використовувати його в новій якості - розширити галузь та умови його використання (розморожувати сперму у відкритих гранулах всіх видів тварин на пунктах штучного осіменіння в дослідницьких лабораторіях установ, колективних і фермерських господарствах як в умовах пунктів штучного осіменіння, так і на випасах, лугах, літніх таборах). 28723 Таблиця 1 Вплив початкової температури заморожених гранул на показники якості сперматозоїдів після відтаювання Час витримування гранул при +20°С Контроль 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 150 180 210 240 270 Температура в центрі гранули перед розморожуванням, °С -196 -190 -187 -150 -104 -82 -64 -49 -39 -33 -28 -22 -20 -16 -10 -4 -3 -2 -1 Рухливість, бали Виживаність, год. 4,0±0,17 4,1±0,11 4,2±0,13 4,2±0,08 4,2±0,11 4,2±0,15 4,2±0,13 3,9±0,15 4,1±0,14 4,1±0,14 4,2±0,11 3,9±0,05 3,7±0,15 4,1±0,04 3,7±0,14 3,5±0,14 3,0±0,25 3,0±0,18 2,8±0,21 5,7±0,56 7,3±0,69 7,4±0,67 8,2±0,49 5,4±0,53 5,3±0,53 6,6±0,63 6,6±0,60 6,1±0,75 5,9±1,69 5,6±0,78 6,1±1,88 6,2±1,63 4,8±1,25 4,9±1,12 4,8±1,86 3,5±0,64 4,1±2,03 3,1±0,47 Таблиця 2 Заплідненість маток при різних способах розморожування сперми бугаїв Назва господарства, радгосп Красилівський Гоголівський Димерський Русанівський Промінь Любарецький Всього "Победа" Требухівський Всього Відтаювання при +38°С Із них запліднено Осіменено, гол. гол. % Корови 141 83 58,8 138 84 60,9 46 15 32,6 185 71 38,4 203 104 51,2 1081 430 39,8 1794 787 43,9 Телиці 643 451 70,1 55 38 69,1 698 489 70,0 *** - різниця статистично вірогідна Р>0,999 Осіменено, гол. Двоступеневий Із них запліднено гол. % 142 138 46 188 108 835 1457 95 98 21 99 86 383 782 66,9 71,0 45,6 52,3 79,6 45,9 53,7*** 422 178 600 352 142 494 83,4 79,8 82,3*** 28723 Фіг. 1 28723 Фіг. 2