Спосіб оцінки гістологічної активності гепатиту у хворих на хронічну патологію печінки

1. Спосіб оцінки гістологічної активності гепатиту у хворих на хронічну патологію печінки, що включає оцінку морфометричних показників шляхом морфологічного дослідження біоптату печінки, який відрізняється тим, що як морфометричний показник визначають середню кількість клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що при перевищенні середньої кількості клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату - 7,41 клітин/1000 мкм 2 - встановлюють помірну гістологічну активність хронічного гепатиту. (19) (21) u200804760 (22) 14.04.2008 (24) 11.08.2008 (46) 11.08.2008, Бюл.№ 15, 2008 р. (72) ГРОМАШЕВСЬКА ЛЮБОВ ЛЕОНТІЇВН А, U A, ФРОЛОВ ВАЛЕРІЙ МИТРОФАНОВИЧ, UA, ПІНСЬКИЙ ЛЕОНІД ЛЕОНІДОВИЧ, UA, РЕШЕТНІКОВА ОЛЬГ А СЕРГІЇВНА, UA, ЗІНЧЕНКО ОЛЬГА ВОЛОДИМИРІВН А, UA, ОВЧАРЕНКО ВОЛОДИ МИР ВІКТОРОВИЧ, UA (73) ЛУГАНСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ, UA, ДЕРЖАВН А УСТАНОВА "ІНСТИТУТ ЕПІДЕМІОЛОГІЇ ТА ІНФЕКЦІЙНИХ ХВОРОБ ІМ. Л.В. ГРОМАШЕВСЬКОГО АМН УКРАЇНИ", UA 3 34569 hepatitis // Hepatology. - 1981. - №1. - P.431-435.; Ishak K., Baptista A., Bianchi L. et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis // J. Hepatol. 1995. - №22. - P.696-699; Серов В. В., Севергина Л. О. Мор фологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при вирусных хронических гепатитах В и С // Архив патологии. - 1996. - №4. - С.61-64], коли наявність та вираженість морфологічних ознак в біоптаті оцінюється за шкалою кількості балів. Сучасними є методи комп'ютерної верифікації морфологічних змін в тканині печінки за допомогою спеціалізованих аналізаторів комп'ютерних зображень [Гомоляко И.В., Донцова Л.С., Швадчин И.А. и др. Диагностическая эффективность морфометрических признаков при дистрофии печени // Лабораторная диагностика. - 1999. - №1. - С.55-59]. Проте актуальною є визначення такого морфологічного показника активності гепатиту, який в найбільшій мірі впливає на прогресування хронічного гепатиту і розвиток фіброзу у хворих на хронічну патологію печінки. В аналозі [Kutcher R., Smith G.S., Sen F. et al. Comparison of sonograms and liver histologic findings in patients with chronic hepatitis С virus infection // J. Ultrasound. Med. - 1998. - May; 17(5). - P.321325] запропоновано використання ультразвукового дослідження (УЗД) для оцінки гістологічної активності гепатиту, зокрема активності ХГС. Проте при використанні запропонованого аналога має місце низька специфічність щодо визначення гістологічної активності гепатиту, а при співставленні результатів УЗД із морфологічними змінами в печінці, в більшості випадків, встановлені УЗД зміни відповідають наявності стеатозу та фіброзу печінки. Також для верифікації активності гепатиту був запропонований аналог [Dietrich C.F., Lee J.H., Herrmann G. et al. Enlargement of perihepatic lymph nodes in relation to liver histology and viremia in patients with chronic hepatitis С // Hepatology. - 1997. Aug; 26(2). - P.467-472], коли маркером зростання активності ХГС виступає гіперплазія перипечінкових лімфатичних вузлів, яка виявляється при УЗД органів черевної порожнини. Проте збільшення перипечінкових лімфатичних вузлів може супроводжувати також і бактеріальні ураження біліарних трактів, ураження печінки при цитомегаловірусній та аденовірусній інфекції, злоякісне ураження регіонарних лімфатичних вузлів, то що. Таким чином, спосіб має малу специфічність щодо визначення зростання активності гепатиту. В аналозі [Серов В.В., Севергина Л.О. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при вирусных хронических гепатитах В и С // Архи в патологии. 1996. - №4. - С.61-64] був запропонований морфологічний спосіб оцінки активності ХГС, де за допомогою напівкількісного методу - бальної шкали морфологічних ознак визначається інтегративний показник активності гепатиту. Проте запропонований спосіб є тільки напівкількісним, оцінка гістологічних змін суттєво залежить від кваліфікації морфолога, цей спосіб по 4 требує проведення фарбування біоптату печінки, крім гематоксилін-еозином, ще й ліпідних гранул, що значно ускладнює обробку біоптату, уповільнює отримання результатів. В способі - прототипі [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. - 1981. - №1. - P.431-435] запропонований напівкількісний морфологічний спосіб оцінки активності гепатиту, в якому за допомогою бальної шкали морфологічних змін в тканині печінки визначається сумарний індекс гістологічної активності гепатиту. Цей спосіб за сутністю найбільш схожий із запропонованим, тому обраний в якості прототипу. Проте результати способу - прототипу суттєво залежать від кваліфікації морфолога, є тільки напівкількісними, спосіб потребує оцінки гістологічних змін в усіх трьох зонах часточок, зокрема оцінки лобулярного компоненту (інтралобулярної дегенерації і фокального некрозу), який в найменшій мірі впливає на загальну активність гепатиту та на прогресування фіброзу. У зв'язку з вищевикладеним, в основу корисної моделі покладено задачу підвищення точності морфометричної оцінки активності гепатиту у хворих на хронічну патологію печінки, шляхом встановлення середньої кількості клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату, що дозволить суттєво скоротити об'єм морфологічних тестів для верифікації активності гепатиту та підвищить точність морфометричної оцінки змін в тканині печінки. Поставлена задача вирішується в способі оцінки гістологічної активності гепатиту у хворих на хронічну патологію печінки, що включає морфометричний показник - середню кількість клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату. Підставою для цієї пропозиції була вперше встановлена закономірність, яка полягає в тому, що при зростанні активності гепатиту, серед морфометричних ознак, найбільшу специфічність та чутливість, щодо визначення активності гепатиту та найбільший вплив на прогресування фіброзу, є запропонована морфологічна ознака - середня кількість клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату та при його перевищенні 7,41 клітин/1000мкм 2 встановлюють помірну гістологічну активність хронічного гепатиту. Під час численних досліджень встановлено, що вказаний спосіб є вірогідним методом морфометричної оцінки активності гепатиту, незалежно від віку, статі хворого та відзначається тільки середньою кількістю клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату. Спосіб здійснюється таким чином: у хворих на хронічну патологію печінки проводять морфологічне дослідження біоптату печінки і в якості морфометричного показника визначають середню кількість клітин лімфомоноцитарного інфільтрату в 5 34569 перипортальній зоні часточок печінки на 1000мкм 2 біоптату та при його перевищенні - 7,41 клітин/1000мкм 2 встановлюють помірну гістологічну активність хронічного гепатиту. При розробці заявленого способу для його клінічного і патогенетичного обґрунтування було обстежено 44 хворих на ХГС у віці від 19 до 66 років (34 особи чоловічої статі і 10 - жіночої), які спостерігались в інфекційному відділенні 3 багатопрофільної міської лікарні м. Луганська і Луганському міському гепатологічному центрі. Критеріями включення до дослідження було встановлення у хворого - діагнозу ХГС на підставі комплексу клініко-біохімічних показників, визначення антитіл-анти-HCV і полімеразної ланцюгової реакції - HCV-RNA, проведення ультразвукового дослідження (УЗД) органів черевної порожнини з визначенням розмірів печінки, її ультразвукової щільності, стану судин, жовчовивідних шляхів. Для виключення вірусних гепатитів іншої етіології та ВІЛ - інфекції проводилось дослідження HbsAg, HbeAg, анти - HbeAg сумарні, анти - HbcІg M, анти - Hbs, анти - HDV, анти - HIV. Біопсія печінки проводилась під контролем ультразвукового дослідження під місцевою анестезією, величина фрагменту печінкової тканини, яка була отримана при біопсії, була більш 10мм. Для фарбування гістологічних зразків нами були використані методи фарбування: гематоксилін - еозином і за Ван Гізон. Визначення індексу гістологічної активності (ІГА) нами здійснювалось за методом R. G. Knodell [Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of a numeral scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. 1981. - №1. - P.431-435], коли роздільно оцінювались: перипортальні мостовидні некрози, фокальні і лобулярні некрози, інфільтрація портальних трактів лімфомакрофагальними елементами. Загальна кількість балів ІГА складається з таких компонентів: 1) запальна інфільтрація портальних трактів (порто-портальний запальний інфільтрат) (0-4 бали), 2) порто-перипортальні некрози (з наявністю мостовидних некрозів або без них) (0-10 балів); 3) лобулярний компонент (інтралобулярна дегенерація і фокальний некроз) (0-4 бали). Фіброз був оцінений за класифікацією METAVIR [The French METAVIR Cooperative Study Group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis С // Hepatology. - 1994. - N20. - P.15-20]. Кожен екземпляр біопсії був оцінений від F0 до F4 за стандартною шкалою: F0 = фіброзу немає, F1 = портальний фіброз без перетинок, F2 = поодинокі перетинки, F3 = численні перетинки без цирозу, F4 = цироз печінки. Для оцінки різниці ІГА між групами із різними стадіями фіброзу був використаний Uтест Мана-Уітні, для оцінки зв'язку між окремими показниками - метод рангової кореляції Спірмена. Також нами був використаний спеціалізований пакет прикладних програм "Morpholog" [Овчаренко В.В., Маврич В.В., 2003; свідоцтво про реєстрацію авторського права №9604]. Нами було проведено мікроморфометричне дослідження тканини печінки на комп'ютерному морфометричному комплексі, 6 до складу якого входили: мікроскоп Olympus BX41, цифровий фотоапарат Olympus C5050Z з п'я тимегапіксельною матрицею, що з'єднаний з мікроскопом системою відеоадаптерів цієї ж фірми. До складу комплексу також входить персональний комп'ютер Athlon XP 2200+, DDR RAM 512mB, HDD 128Gb, video: GeForce FX5200 128Mb, що обладнаний платою відеозахвату, з'єднаний з цифровою камерою за допомогою USB інтерфейсу, а також за допомогою відеокабелю. Цей комплекс дозволяє переглядати на екрані монітора зображення гістологічного препарату в реальному масштабі часу, вибирати необхідну ділянку для фо тографування, за допомогою програмних засобів керувати режимом роботи цифрового фотоапарата (виставлення зумера, корекції кольорової гами, зміна фокусу, розмір та компресія зображення тощо) отримувати ци фрові зображення гістологічних препаратів та зберігати їх на жорсткому диску комп'ютера для подальшого аналізу. Мікрофотографії отримували в кількох режимах збільшення: при об'єктиві 4х та 10х для дослідження макромікробудови та з об'єктиву 40х для дослідження мікробудови при постійному оптичному зумері фотоапарата рівному 162. В кожному отриманому зображенні гістологічного препарату визначались такі параметри: загальна площа досліджуваної ділянки біоптату, площа лімфомоноцитарної інфільтрації, середня кількість лімфомоноцитарних клітин в портальній, перипортальній і центролобулярній зонах, середня площа 1 клітини лімфомоноцитарного інфільтрату в досліджуваній зоні печінкових часточок. Отримані в результаті роботи програми дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Excel XP і Statistica 6 для подальшої статистичної обробки. При проведенні мікроскопічного дослідження матеріалів біопсії у хворих на ХГС нами було визначено, що при ХГС спостерігається гетерогенність гепатоцитів, сполучення жирової і гідропічної дистрофії, локальні спалахи некрозів гепатоцитів, лімфоідні фолікули та ланцюги лімфоцитів переважно в портальних трактах та центролобулярно. Також має місце гіперплазія синусоїдальних клітин, клітин Купфера, проліферація дуктул. При мінімальній активності гепатиту спостерігаються сегментарні перипортальні некрози, окремі вогнища гідропічної та жирової дистрофії. Лімфомоноцитарна інфільтрація супроводжується лімфоідними агрегатами, незначною гіперплазією ретикулоендотеліальних клітин, поодинокими ділянками ланцюжків лімфоцитів в синусоїда х. При помірній гістологічній активності спостерігаються перипортальні, перисинусоідальні, мостовидні некрози у переважній більшості портальних трактів. Фокальні некрози переважають в більшості печінкових часточок. Лімфоідні фолікули частіш локалізуються в портальних трактах, спостерігається гіперплазія клітин Купфера і ендотелію синусоідів, а також інфільтрація синусоідів лімфоцитами, наявність їх ланцюгів. Має місце жирова і гідропічна дистрофія гепатоцитів дифузного характеру. Високі значення ІГА супроводжуються перебудовою структури печінки з утворенням хибних розеткоподібних часточок, які розділені колагено 7 34569 вими волокнами. В жовчних протоках реєструється дистрофія епітелію, проліферація і фіброз жовчних протоків, перидуктальний склероз зі значною кількістю колагену. Некротичні зміни спостерігаються переважно в тих гепатоцитах, які розташовуються перипортально у вигляді східчастих некрозів, де має місце дотик лімфомоноцитарного інфільтрату до гепатоцитів. В цих зонах спостерігається виражений набряк гепатоцитів, їх анізоцитоз і анізокорія з появою апоптотичних тілець, периферичною конденсацією хроматину у ядрі клітин. В ряді спостережень має місце охоплення лімфомоноцитарним інфільтратом групи гепатоцитів, що призво 8 дить, крім фібротичних змін, до локального некрозу гепатоцитів, формування розеток, а в деяких випадках до диспластичних змін гепатоцитів. В залежності від активності патологічного процесу в печінці всі обстежені пацієнти були розподілені на 2 групи за значенням ІГА (за Knodell): 1 група (27 хворих) - незначні прояви хронічного гепатиту з мінімальною активністю патологічного процесу (0-8 балів за Knodell); до 2 групи (17 хворих) - увійшли хворі із помірно вираженою активністю патологічного процесу (9 -15 балів за Knodell). При розподілі групи хворих на ХГС за вираженістю фіброзу стадію F0 мали 4 хворих, F1 - 12, F2 - 11, F3 - 10, F4 - 7 хворих на ХГС (табл. 1). Таблиця 1 Показники індексу гістологічної активності (за Knodell R.G., 1981) у хворих на ХГС із різними стадіями фіброзу. Запальна інфільтПортоЛобулярний комГрупи хворих рація портальних перипортальні некпонент (інІндекс гістологічна ХГС із різ- Кількість хвотрактів (порторози (з наявністю тралобулярна деної активності за ним ІГА і стаді- рих в підгр упі портальний запа- мосто-видних нек- генерація і фокаKnodell льний інфільтрат) розів або без них) льний некроз) (0-4) єю фіброзу (0-4) (за Knodell) (1-10) (за Knodell) (за Knodell) ІГА за Knodell 10 1,0±0,0 0,60±0,15 0,60±0,15 2,20±0,13 (1-3) ІГА за Knodell 17 3,35±0,18 3,29±0,23 0,47±0,19 7,12±0,27 (4-8) ІГА за Knodell 11 3,73±0,13 4,91±0,30 1,73±0,37 10,36±0,32 (9-12) ІГА за Knodell 6 3,67±0,19 7,17±0,83 3,33±0,19 14,17±0,55 (13-15) ІГА за Knodell 27 2,48±0,25 2,30±0,30 0,52±0,13 5,30±0,49 (1-8) ІГА за 17 3,71±0,11 5,71±0,44 2,29±0,31 11,71±0,52 Knodell(9-15) F0(3a 4 1,50±0,43 0,50±0,25 0,75±0,22 2,75±0,65 METAVIR) F1(за 12 1,75±0,31 1,50±0,32 1,08±0,34 4,33±0,81 METAVIR) F2(sa 11 3,64±0,15 4,09±0,30 0,55±0,27 8,27±0,47 METAVIR) F3(sa 10 3,70±0,14 5,10±0,26 1,70±0,35 10,5±0,59 METAVIR) F4(3a 7 3,71±0,17 6,14±0,96 2,0±0,67 11,86±1,32 METAVIR) F0-1 (за 16 1,69±0,26 1,25±0,27 1,0±0,27 3,94±0,65 METAVIR) F2-4 (за 28 3,68±0,09 4,96±0,32 1,32±0,26 9,96±0,51 METAVIR) В 1 групі портальний інфільтрат в менш ніж в третині портальних трактів мав місце у 11 з 27 пацієнтів (40,8%), в 1/3 - 2/3 портальних трактів у 8 (29,6%) і порто-перипортальний інфільтрат в більш ніж 2/3 трактів у 8 хворих (29,6%) (табл. 1). В 2 групі портальна інфільтрація менш ніж в 1/3 портальних трактів не спостерігалась, а інфільтрат в 1/3 - 2/3 портальних трактів був у 5 з 17 хворих (29,4%). Порто - перипортальна інфільтрація в більш ніж 2/3 трактів в цій гр упі мала місце у 12 (70,6%) пацієнтів. При аналізі наявності порто-перипортальних некрозів була встановлено, що в 1 групі незначні ступінчасті некрози гепатоцитів портоперипортальної зони мали місце у 8 (29,6%), а помірні ступінчасті некрози порто-перипортальних зон, які займають меш 50% кола більшості портальних трактів у 6 (22,2%). В 2 групі таких ознак не спостерігалось. В 2 групі мали місце мостовидні некрози гепатоцитів більш ніж в 3 портальних зонах у 7 (41,2%), а в 2 випадках - мультилобулярні некрози гепатоцитів, чого не спостерігалось в 1 9 34569 групі хворих на ХГС. Розсіяні лобулярні фокальні некрози менш ніж в третині часточок в 1 групі були у 11 (40,7%) хворих, а в 2 гр упі лише у 4 (5,9%). Проте лобулярні некрози гепатоцитів в 1/3 - 2/3 часточок мали місце в 1 групі у 1 хворого (3,7%), а в 2 гр упі - у 9 (52,9%). При використанні дискриминантного аналізу показників ІГА за Knodell в двох групах хворих на ХГС - 1-ої групи з мінімальною активністю і 2-ої групи з помірною активністю було встановлено, що найбільші дискриминантні властивості між ними має така складова ІГА, як вираженість портоперипортальних некрозів. В абсолютних значеннях цей показник дорівнює 2,30±0,30 балів і 5,71±0,44 балів відповідно та має дискриминантний коефіцієнт F =42,75 (р