Спосіб визначення антимутагенних властивостей у рослин

Спосіб визначення антимутагенних властивостей у рослин шляхом уведення їх екстрактів в організм тварин на фоні індукованого мутагенезу, визначають КІЛЬКІСТЬ хромосомних аберацій є клітинах кісткового мозку і по зниженню хромосомних перебудов міркують про антимутагени» властивості рослин, який відрізняється тим, що проводять попередню підготовку екстрактів з листя рослин, яким присутні протекторні властивості, визначають активність антиокислювальних ферментів, і якщо вона в границях 60-90%, -вибирають екстракти з високими антиоксидантними властивостями Заявляємий спосіб визначення антимутагенних властивостей у рослин зараховується до галу зі медицини, зокрема до профілактично» і призначається для підбору рослинних препаратів для лі рослинного екстракту необхідно 50 експериментальних щурів утече багато часу і реактивів для досягнений мети досліду В основу винаходу поставлено завдання визначення антимутагенних властивостей у рослин шляхом уведення їх екстракту в організм тварин на фоні індукованого мутагенезу, визначення кількості хромосомних аберацій в клітинах кісткового і по зниженню хромосомних перебудов в клітинах міркують про антимутагенні властивості рослинних екстрактів попередньо підготовлених з листя рослин і відібраних на основі визначення і наявності в «их активностей антиокислювапьних ферментів (якщо сумарна антиокислювапьна активність екстрактів буде знаходитись в границях 60-90%), що дає можливість скорочення часу, реактивів і тварин для проведення експерименту На початку експериментальної частини роботи рослини відбирають по наявності в них протекторних властивостей а потім вже уводжують дослідним і контрольним тваринам на фоні відомого мутагенезу для означення захисного антимутагенного ефекту Сутність способу полягає в тому, що визначення антимутагенних впастивостей екстрактів рослин, здійснюють підготовкою їх водних екстрактів і відбором по визначенню антиоксидантних ферментів і загально) антиокислювальної активності, потім відібрані екстракти рослин уводять тваринам на фоні мутагену (циклофосфану і доксорубщину) і по наявності хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку міркують про зміни мутагенезу - при їх зменшенні - фіксують антимутагенні властивості рослин Таким чином кувальної і профілактичної мети КЛІНГЧНОІ і ГІГІЄНІЧ НОЇ практики Відомий спосіб визначення і застосування антиоксидантних властивостей препаратів [1 Fe»g D І , Loeb L A Oxtgen radical induced mutagenesis is DNA polymerase specific//J Мої Btol - 1 9 9 4 ~ V 235, N1, - P 33-41] шляхом запобігання розвитку хромосомних перебудов та інших пошкоджень в генетичному апараті клітин при впливанні мутагенних факторів Недопіком відомого способу є той факт, що застосування рослинних екстрактів з протекторною метою в організмі людини f тварин не завжди дає позитивний антимутагенний ефект Наприклад антиоксиданту вітаміну С, застосованому в певних дозах, притаманна канцерогенна дія Найбільш близьким за технічної суті заявляемому способу є спосіб визначення антимутагенних властивостей у препаратів (2 Литвинов С К Методические рекомендации по экспериментальному выявлению химических модификаторов мутагенеза и канцерогенеза - М 1986 - 9 с ] Проводять уведення фармакологічних препаратів в організм тварин на фоні індукованого мутагенезу і визначають КІЛЬКІСТЬ хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку, згодом по зниженню хромосомних перебудов міркують про їх антимутагенні властивості Недоліком відомого способу є те що для вивчення антимутагенних властивостей одного СО ю со 35317 відбирають з багатьох рослин рослини з антиоксидантними властивостями, а потім проводять експериментальні дослідження на тваринах. Новим а заявленому способі є той факт, що попередньо підготовляють екстракти з листя рослин, що володіють протекторними властивостями, і визначають в них активність антиокиспювапьних фєрменлв, і якщо сумарна антиокислювальна активність знаходиться в границях 60-90%, то дані екстракти відбирають для наступного експериментального дослідження наявності в них антимутагенних властивостей Щоденна доза надходження мутагенів їжею може складати 5-6 мкг Чимало лікарських засобів, надходячи в організм, також утворюють генотоксичні агенти Захист людини від впливання мутагенів - один з найбільш важливих напрямків профілактики порушень здоров'я. При цьому постає завдання розробити методи, здатні усунути чи послабити дію мутагенів в організмі Його вирішення будується на біохімічних підходах За останній час зросла кількість свинцю та ртуті в їжі, воді, вихлопних газах, тютюновому диму і у волоссі дітей Багато наукових робіт вказують на захисні механізми при вільнорадикальних процесах присутність низькомолекулярних антиоксидантів (вітамінів Е,С, SH-групи, аскорбат. каротин, сечова кислота), ферменти (пероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза); хелатори; процеси відновлення, завдяки активності фосфолтаз, пероксидаз, трансфераз, редукгаз, протеаз, ендонуклєаз, полімераз Однак, останнім часом з'явилися роботи, в яких йдеться про те, що екзогенні антиоксиданти на завжди досягають своїх "мішеней" (ДНК, мітохондрій). Руйнування ДНК. викликане вільними радикалами, на фоні аскорбзту. іонів міді га заліза Вітамін С може знижувати мутагенний ефект в низьких дозах впливання на організм, але підвищувати дію високих доз цього ж мутагена. Інкубація клітин з аскорбіновою кислотою призводила навіть до підвищення частоти мутацій полімераз. Антиоксидантні властивості рослинних продуцентів давно застосовуються в профілактичній медицині Використання різних аліментарних факторів для'Підвищення резистентності організму показане в раніше виконаних роботах в галузі радіобіології Сюди входить застосування одноразових радіопротекторів. Вони діють по типу механізму захисного екранування, і до них зараховують аскорбінову кислоту, дисульфіди, флавоноїди, глутатіон. тиопові ефіри, полісахариди, альфа-токоферол, ретиноіди, еугенол, таурин, альфакарнозин, імідазол-4-оцетова кислота, N-ацетилцистеїн, каротиноїди, поліаміни. кверцитін, білірубін Тобто антиоксидантні властивості препаратів не відповідають цілком за профілактику генетичних порушень під впливом несприятливих факторів Антимутагени же вважаються, хоча ( новим, класом фармакопопчних засобів. Порівняно з групою антиоксидантів, вони можуть знижувати пошкодження ДНК за рахунок активації репаративних процесів у ядерному хроматині Антимутагенні властивості необхідно визначати методами, що потребують великих коштів. До речовин, які підвищують загальну неспецифічну резистентність організму, належать адаптогени рослинного походження - фітоадаптогени. Дійсно, радюпротекторний ефект виявлявся у екстрактів женьшеня і елеутерокока. Сучасне життя потребує пошук доступних методів визначення антимутагени их властивостей рослин. Таким чином, необхідно лроводити відбір рослин за протекторними властивостями з метою подальшого дослідження на антимутагенез. Реалізують спосіб наступним чином: проводять підготовку водних екстрактів з листя рослин; відбирають екстракти з високими антиоксидантними властивостями, для цього в них визначають активність in vivo ферментів каталази І супероксиддисмутази, а також загальну антиокислювальну активність (АОА) in vitro на модельних фосфолінідах. Якщо АОА знаходиться в границях 60-90% - у рослини передбачають антимутагенні властивості, потім вводять тваринам внутрішньобрюшинно екстракти тваринам на фоні Індукованого мутагенезу (циклофосфан або доксорубіцин в/м) в 3-х дозах (наприклад. 2,0 мг/кг - однократне, двократне і трьохкратне введення; або 2,0, 10,0 і 20,0 мг/кг - при трьохкратному введенні протягом 5 днів, та інші); визначають цитогенетичним методом кількість хромосомних аберацій в клітинах кісткового мозку щурів. І по їх зниженню в серіях експерименту (комбінування різноманітних доз мутагену і досліджуваного екстракту рослини) в порівнянні з контрольною серією визначають наявність антимутагенних властивостей. Приклад 1. Прикладом унікальної радіорезистентності може служити Ginkgo biloba. Тому нами було сплановано експерименти щодо вивчення антимутагенних властивостей екстрактів з його листя Першій серії експериментальних тварин вводили досліджуваний водний екстракт G.b один раз, другий - двічі і третій - тричі на фоні введення циклофосфану (2,0 мг/100 г; 4,0 мг/100 г; 6.0 мг/100 г) Контрольні серії1 складалися з введень одного мутагена у ВІДПОВІДНІЙ КІЛЬКОСТІ разів При цьому відсоток метафаз з хромосомними аномаліями, в порівнянні з ефектом мутагена, в серп додаткового введення на його фоні екстракту G.b. вірогідно знижувався в серіях дворазової І триразової Ін'єкції Структура аберацій хромосом в експериментальних групах показує, що підвищення відсотка складних мутацій вірогідне на малих дозах мутагена і досліджуваного екстракту при одноразовому І дворазовому їх введенні, що свідчить про виникнення сильних мутагенів в першу і другу добу експерименту. Протягом наступного часу ефект G Ь. зростав, напевне, за рахунок впливання на ферментативнусистему дезактивації та метаболізму ксенобіотиків. Тобто, незважаючи на високі антиоксидантні властивості водного екстракту листя досліджуваної рослини позитивний ефект його впливу на репарацію хромосомних перебудов і розривів відмічався при збільшенні дози і часу впливання. G.b., будучи сильним антиоксидантом при введенні його в організм тварин на фоні мутагену, може проявляти І протекторні властивості, зни 35317 жуючи алкілування циклофосфа ном або його вміст, в результаті чого, напевне, затихає реакція репараційних систем (ферментів) у механізмах захисту від мутагена. Протекторні і антимутагенні властивості цієї рослини можуть застосовуватися в профілактичній медицині Приклад 2. За розробленою нами схемою виявлення антимутагенних властивостей рослинних об'єктів з метою їх подальшого профілактичного застосування ми вивчили харчову добавку "БіовІт". Біовіт являє собою природний біологічний активний комплексний вітамінний продукт, створений на основі зародків пшениці До його складу входить 45% білка, 48% вуглеводів, вітаміни (Е-320 мкг, Bt - д о Юмкг, В г - до 8 мкг, Be-до 10 мкг; Р Р - д о 70 мкг; Рг - до 35 мкг, Л - до 800 мкг). а також мікроелементи та основні електроліти (кальцій, магній, кальцій, фосфор тощо) Він виробляється з високоякісного сухого харчового зерна шляхом виділення зародка пшениці і пропусканням його через ділянки постійного магнітного попя В досліджуваному препараті ми визначали активність катаяази, супероксиддисмутази та загальної антиокислювальної активності на штучних жовткових фосфоліпідах У біовіта відмічається висока каталазна і СОД-активність, а значить він бере на себе перекиси, що утворюються в організмі при активації ПОЛ Y-променями Як було зазначено раніше, на фоні зростання екологічного впливу у Гінкго підвищується активність цих ферментів Значить, бювіт набув цих властивостей у зв'язку з дією ЕМІ. а, можливо і те, що вони можуть бути зумовлені їх вітамінним складом Під впливом променевої терапії він за допомогою цих ферментів нівелюватиме вільнорадикальні процеси в непошкоджених новоутворенням тканинах. На білих щурах-самцях лінії "Вістар" вагою 150-180 г вивчали модулюючі мутагенез властивості біовіту За 7 днів до введення мутагенних за собів (відомих цитостатиків - доксорубїцину та циклофосфану) в їжу та воду піддослідних щурів додавали біовіт Потім вводили у зростаючих дозах ксенобіотики і через 48 годин тварин умертвляли під хлороформним наркозом. Виділяли КІСТКОМОЗКОВІ мета фазні пластини, в яких аналізували кількість мутантних клітин і структуру хромосомних перебудов у них (ХА) На великих дозах цитостатичних засобів вірогідно зменшується відсоток клітин з мутаціями і зменшується кількість склзднорепарованих хромосомних аберацій На малій дозі циклофосфану не відмічається не тільки зменшення частоти аберангних клітин а й кількість сестринських хроматидних обмінів і парних фрагментів - має тенденцію до зростання. Мутагени вводили на фоні стимуляції регенерації" біовітом, оскільки літературні дані свідчать про те, що кістховомозкове кровотворення на фоні біовіту у відновному періоді після променевого впливання підвищувалося Приклад 3. Нами вивчалися протекторні властивості деяких лікарських трав Результати показали, що деякі з них (череда, чорнобиль, дурнишник і тисячолітник) можуть застосовуватися з метою подальшого дослідження їх антимутагенних якостей Застосування відомого способу дає можливість поліпшення профілактики генетичних пошкоджень в організмі людей під впливом несприятливих факторів зовнішнього середовища за допомогою рослинних екстрактів. Інформація: 1. Feig O.I., Loeb L.A Oxigen radical induced mutagenesis is DNA polimerase specific // J. Мої. Biol. - 1994. - V. 235, N1. - P. 33-41. 2 Литвинов С К. Методические рекомендации по експериментальному выявлению химических модификаторов мутагенеза и канцерогенеза М , 1986 - 9 с Таблиця 1 Вплив водного екстракту G.b. на Індуційований мутагенез відсоток мутантних клітин у кістковому мозку щурів % хромосомних перебудов в клітинах кісткового мозку щурів Кратність та уведення екстракте G.b. 0 1 2 3 - Кратність уведення циклофосфану в доз) 2,0 иг/100 г ваги тіла тварин 0 1 1 Э 1,6 16,7 30,0 39 17,7 16,7' _ _ 30,7' Примітка: * - віропдність розбіжностей в порівнянні з контролем (уведення мутагену з тією ж кратністю) 35317 Таблиця 2 Зміни в структурі хромосомних аберацій в експерименті введення G b на фоні мутагена (п=3) Серія експерименту Загальна кількість АХ G.b. + ЦФ 1 G.b +ЦФ2 G b 4 ЦФ 3 Типи аберацій Коефіцієнт захисту + або посилення Хромати/дні Хромосомні % складних мутацій 118 102 16 60,7' -1,33 67 47 20 53,3* -2,22 155 106 49 32,7* + 1.45 ЦФ1 125 59 66 45.7 ЦФ2 ЦФЗ 143 83 60 24.0 163 111 52 47,3 Примітка* * - pU < 0,01 - вірогідність розбіжностей з ВІДПОВІДНИМ контролем Таблиця З Вивчення антиокислювальних властивостей у Пнкго Назва вивчаючого об'єкта In vivo СОД, усл. Од GINKGO BILOBA In vitro АОА, в % Каталаза, мкат/л 126.0 1640358 92,9 Таблиця 4 Антиоксидантна активність "Біовіта" Назва вивчаючого об'єкта In vitro In vivo СОД. уел Од АОА, в % 380.0 БЮВІТ (п=10) КАТАЛАЗА. мкат/л 1802196 69,5 Таблиця 5 Схема експерименту на щурах щодо вивчення модулюючих мутагенез властивостей "БІовіту" N* щурів Назва серії опиту 1-5 ЦФ, 2,0 мг/кг 6-Ю ДР, 0,2 мг/кг 11-15 16-20 21-25 26-30 ЦФ, 20.0 мг/кг ЦФ, 2.0 мг/кг + Бювіт ДР + Бювіт ЦФ, 20,0 мг/кі + Бювіт Примітка: ЦФ - циклофосфан, ДР - доксорубіцин Таблиця 6 Змінення "Біовітом" індуціиованих мутацій в леикопоетичних клітинах кісткового мозку експериментальних щурів (п=5) Серія опиту Відсоток аберантиих клітин Доксорубіцин Циклофосфан 2,0 мг/кг 20 мг/кг 0,2 мг/кг Без бювіта 16,5 57,6" 28,4 3 бювітом 18.35 30,4* 17.0* Примітка: * - вірогідність розбіжностей з серією без бювіту, *' - в порівнянні з другою дозою мутагена (при pU