Спосіб діагностики інфекцій

Спосіб діагностики інфекцій, який включає змішування сироватки крові з боратним буфером рН 8,4, а для виділення антигену додають розчин поліетиленгликолю з м.м.6000, проводять інкубацію на холоді, центрифугують, відмивають преципітат поліетиленгликоль-боратним буфером і ідентифікують антиген в імунохімічній реакції, і відрізняється тим, що для виділення антигену у вигляді імунних комплексів додають поліетиленгликоль до кінцевої концентрації 3,75 %, а після відмивання преципітату його дисоціюють 0.1N розчином NaOH, нейтралізують 0,1 N розчином НСІ, вносять в лунки полістиролового планшету з адсорбованим специфічним антигеном і антитілами, після інкубації" відмивають забуференим фізіологічним розчином, після чого визначають зв'язаний антиген і антитіла класів JgG або JgM за допомогою імунохімічної реакції. Винахід відноситься до об пасті медицини, а саме до імунології інфекційних захворювань і може бути використаний для діагностики інфекцій бактеріальної та іншої етіології, наприклад, для диференціювання гострої та хронічної ієрсинеозної інфекції. Відомий спосіб визначення специфічності імунних комплексів (1; Ac. Ne 1323959. СССР, МКИ G 01 N 33/53. Способ определения специфичности иммунных комплексов / Ю.А. Кузьмин, Б.В. Каральник (СССР). - № 4024572/28-14; Заявлено 18.02.86; Опубл. 15.07.87. Бюл. № 2 . - 2 с ] , шляхом титрування дослідної проби, її підкислення до рН 2,4-2,8, додавання антигенного або антитільного еритроцитарного діагностикуму (наприклад, ехинококового еритроцитарного діагностикуму), нейтралізації суміші і при збільшенні титру в порівнянні з контролем без підкислення взірця визначають присутність імунних комплексів. Недоліком цього способу є перед усім те, що дисоціація імунних комплексів проводиться у кислому середовищі в присутності еритроцитарних діагностикумів, що може викликати неспецифічну гемаглютинацію, а наступна нейтралізація не виключає цього феномену, тим паче, що реакція проводиться в присутності антигенів і антитіл імунних комплексів Відомий також спосіб прогнозування перебігу запального процесу в легенях (2; Ас. Ne 1478123. СССР, МКИ G 01 Н 33/53. Способ прог нозирования течения воспалительного процесса в легких / А К Абрамовская, СВ. Савельева, Л.К. Суркова. И В Коваленко (СССР) - Ne 4218637/2814; Заявлено 25.02 97; Опубл. 07.05.89. Бюл. Ne 17. - 3 с), шляхом визначення рівня циркулюючих імунних комплексів і титру антитіл до бактерій, виділених з мокротиння кількісним мікробіологічним методом, і по їх рівню визначають затяжну або сприятливу течію запального процесу. Недоліком цього способу є те, що визначається рівень тільки неспецифічних імунних комплексів, а антитіла визначаються до мікробів, які виділені кількісним мікробіологічним методом, який є дуже трудомістким і прогноз ставиться тільки за одним специфічним показником - рівнем антитіл. За цим способом неможливо диференціювати це гострий, або це хронічний процес у стадії загострення. Найближчим по суті до способу, що заявляється, є спосіб діагностики хронічної інфекції {3; А с Ne 1690691. СССР, МКИ А 61 В 10/00. Способ диагностики хронической инфекции / Л.Г. Горина, Ю.В. Вульфович, А.Г. Гаврилова, С.А Гончарова (СССР). - № 4196596/63; Заявлено 19.02.87; Опубл. 15.11.91. Бюл. N9 42. - 2 с ] , який включає послідовне додавання до сироватки крові піддослідного боратного* буферу, поліетиленгликолю з м.м. 6000 до кінцевої концентрації 3,5%, інкубацію на холоді, центрифугування, відмивання преципітату 3.5 %-ним поліетиленгликоль-боратним бу 35316 фером, нанесення на скло, фіксування етанолом і дослідження в імунохімічній реакції. Недоліком відомого способу являється те, що циркулюючі імунні комплекси (ЦІК). які виділяються, не піддаються дисоціації. Тому визначення в них антигену за допомогою реакції імунофлюресцеиції (РІФ), особливо в умовах надлишку антитіл, які утворюються при хронічних інфекціях, може бути неможливим. Цим способом не визначаються специфічні антитіла і неможливо віднести їх до конкретного класу імуноглобулінів, що не дозволяє диференціювати гостру інфекцію від хронічної. в основу винаходу покладена задача діагностики бактеріальних і іншої етіології інфекцій шляхом виділення із крові хворих циркулюючих імунних комплексів, їх дисоціацію, визначення за допомогою ІФА специфічного антигену, специфічних антитіл, а також їхній клас • JgM, або JgG, що дає можливість диференціювати, гостру і хронічну іерсинеозну інфекцію у хворих. Суть винаходу є в тому, що сироватку крові хворого змішують з боратним буфером рН 8,4, а для виділення антигену додають розчин поліетиленгликолю з м м. 6000, проводять інкубацію на холоді, центрифугування, відмивання преципітату поліетиленгликоль-боратним буфером і ідентифікування антигену в імунохімічній реакції, відмінний тим, що для виділення антигену додають поліетиленгликоль до кінцевої концентрації 3,75 %, а після відмивання преципітату його дисоціюють 0,1 N розчином NaOM, нейтралізують 0,1 N розчином НСІ, вносять в лунки полістиролового планшету з адсорбованими в них специфічним антигеном і антитілами, після інкубації відмивають забуференим фізіологічним розчином, визначають зв'язаний антиген і антитіла класів JgM і JgG за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА), або радіоімунного аналізу (РІА) (імунохімічної реакції). Новим в способі, який заявляється, є те, що виділення антигену здійснюють додаванням поліетиленгликолю до кінцевої концентрації 3,75 %, а після відмивання преципітату його дисоціюють 0,1 N розчином NaOH, нейтралізують 0,1 N розчином НСІ, вносять в лунки полістиролового планшету з адсорбованими в них специфічним антигеном і антитілами, після інкубації відмивають забуференим фізіологічним розчином, визначають зв'язаний антиген і антитіла класів JgM і JgG в імунохімічній реакції. Кінцевий діагноз, наприклад, ієрсинеозу може бути встановлений тільки після проведення досліджень, спрямованих на визначення сгіецифічного антигену ієрсиній і специфічних антитіл. При перебігові іерсинеозної інфекції в крові утворюються циркулюючі імунні комплекси (ЦІК), які включають специфічні антигени і антитіла. Вміст антитіл і антигенів в імунних комплексах утруднює*їх визначення. Ті способи, що існують зараз, не дають можливості гарантованого їх визначення. Ця задача може бути вирішена розробленим способом діагностики, який дозволяє одночасно в ЦІК визначати специфічний антиген і специфічні антитіла, а також визначати належність їх до конкретного класу імуноглобулінів JgM чи JgG. При наявності антигену і антитіл класу JgM визначають гостру інфекцію, а антигена і антитіл класу JgG хронічну інфекцію. Реалізують спосіб наступним чином. Кров хворого беруть з ліктьової вени, ставлять в термостат при 37°С на три години для згортання і відокремлення сироватки від згортку, а також для попередження випадіння імунних комплексів, що мають властивості і кріоглобулінів. Після чого центрифугують 5 хвилин при 3000 об/хв. Отриману сироватку розводять у три рази боратним 0,1 М буферним розчином рН 8,4 (наприклад 0,3 мл сироватки + 0,6 мл боратного буферу) і відбирають 0,33 мл суміші у центрифужну пробірку, куди доливають 3 мл 4,166 % розчину поліетиленгликолю 6000 в боратному буфері. Інкубують 1 годину при кімнатній температурі і ніч у холодильнику при +4вС. центрифугують при 3000 об/хв 20 хвилин, потім відмивають ЦІК 3,75 % ПЕГ в боратному буфері. Після цього дисоціацію ЦІК проводять в 0,165 мл 0,1 N розчину NaOH протягом години, нейтралізують 0,165 мл 0,1 N розчину НСІ. Отриманий розчин вносять у три мікролунки полістиролового планшету, в яких адсорбовано в одній специфічні антитіла, а в двох інших - специфічні антигени, і інкубують при 4°С протягом 16 годин, після цього відмивають забуференим фізіологічним розчином (рН - 7,2-7,4), після чого за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА) в першій лунці визначають специфічний антиген, в другій - антитіла класу JgM, в третій - антитіла класу JgG з моноспецифічними антиімуноглобуліновими сироватками. При наявності специфічного антигену і антитіл класу JgM визначають гостру інфекцію, а при наявності специфічного антигену і антитіл класу JgG визначають хронічну інфекцію, а при наявності тільки антитіл класу JgG визначають перенесену раніше інфекцію. Приклади реалізації способу. Приклад 1. Хворий П., 22 роки, надійшов в інфекційне відділення з діагнозом ієрсинеоз, хронічний перебіг з вторинними вогнищевими ураженнями (гепатит, артрит, дерматит) у стадії субкомпенсації. РПГА з ієрсинеозним 0 3 діагностикумом 1:200, з псевдотуберкульозним діагностикумом 1:200, що менше діагностичного титру (1:400). Сироватку крові хворого розвели у 3 рази боратним буфером і до 0,33 мл суміші долили 3 мл 4,166 % розчину поліетиленгликолю MM 6000 в боратному буфері, інкубували 1 годину при кімнатній температурі і 16 годин при температурі 4*С, центрифугували при 3000 об/хв 20 хвилин, відмивали ЦІК 3,75 % ПЕГ у боратному буфері, дисоціацію ЦІК проводили 0,1 N розчином NaOH 1 годину, нейтралізували 0.1 N розчином НСІ. За допомогою ІФА визначили наявність антигену ієрсинія ентероколітіка 03, антитіла класу JgG до ієрсинію ентероколітіка та ієрсинія псевдотуберкульозіс. Таким чином підтвердили діагноз хронічна інфекція, викликана ієрсинія ентероколітіка 03. Приклад 2. Хворий О., 18 років, надійшов в інфекційне відділення з діагнозом ієрсинеоз, генералізована форма, середньої важкості. Хворіє протягом місяця. РПГА з еритроцитарним ієрсинеозним діагностикумом 0 3 1:200, що менше діагностичного титру • 1:400. Кров на аналіз взяли у хворого на 35-й день після захворювання. Дослід 35316 ження проводили як у прикладі 1. Визначили наявність в ЦІК антигену ієрсинія до ентероколітіка 03, а також антитіла до нього класів JgM та JgG. Діагностовано іерсинеоз, викликаний ієрсинія ентерколітіка 03, затяжний рецидивний перебіг. Приклад 3. Хвора Б., 25 років, надійшла в Інфекційне відділення з діагнозом іерсинеоз. Захворіла тиждень тому. РЛГА з еритроцитарним ієрсинеозним діагностикумом 03 - 1:100, що менше діагностичного титру • 1:400. Кров на аналіз взяли у хворої на 10-й день після захворювання. Дослідження проводили як у прикладі 1. Визначили наявність в ЦІК антигену ієрсинія ентероколітіка 03, а також антитіла до нього класу JgM. Діагностовано іерсинеоз, викликаний ієрсинія ентероколітіка 03 (третього серовару), гостра форма. Спосіб забезпечує велику інформативність, бо виявляються специфічні антигени в ЦІК, специфічні антитіла, а також визначається клас імуноглобулінів, що дозволяє своєчасно диференціювати гострі, затяжні і хронічні форми інфекції, а це дозволяє призначати відповідне лікування і зни зити кількість випадків переходу ієрсинеозу у хронічну форму, а також проводити відповідне лікування хронічних форм. Джерела інформації: 1. Ac. NB 1323959. СССР, МКИ G 01 N 33/53. Способ определения специфичности иммунных комплексов / Ю.А Кузьмин, Б В. Каральник (СССР). - № 4024572728-14; Заявлено 18.02.86; Опубл. 15.07.87. Бюл. №2. - 2 с. (аналог). 2. А. с. № 1478123. СССР, МКИ G 01 N 33/53. Способ прогнозирования течения воспалительного процесса в легких / А.К. Абрамовская, СВ. Савельева, Л.К. Суркова, И.В. Коваленко (СССР). - № 4218637/28-14; Заявлено 25.02.97; Опубл. 07.05.89. Бюл. № 17. - 3 с. (аналог). 3. Ac. NB 1690691. СССР, МКИ А61 В 10/00. Способ диагностики хронической инфекции / Л.Г. Горина, Ю.В. Вульфович, А Г. Гаврилова, С.А. Гончарова (СССР). - № 4196596/63; Заявлено 19.02.87; Опубл. 15.11.91. Бюл. № 4 2 . - 2 с. (прототип). Тираж 50 ею. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. ГагарЫа, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03