Поліпептид, який має активність легеневої поверхнево-активної речовини, та фармацевтична композиція для лікування респіраторного дистрес-синдрому у ссавців

1 Полипептид, обладающий активностью легочного поверхностно-активного вещества, общей формулы I: C2 (54) ПОЛІПЕПТИД, ЯКИЙ МАЄ АКТИВНІСТЬ ЛЕГЕНЕВОЇ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНОЇ РЕЧОВИНИ, ТА ФАРМАЦЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ РЕСПІРАТОРНОГО ДИСТРЕС-СИНДРОМУ У ССАВЦІВ 35636 в виде пластинчатых телец. Они представляют собой компактные образования из фосфолипидных двойных слоев с высоким содержанием дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и фосфатидилглицерина (ФГ). Другими основными компонентами, содержащимися в легочных поверхностно-активных веществах, являются протеины, которые обозначаются как SP-A, SP-B и SP-C. SP-A представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, играющий основную роль в регуляции секреции. Протеины SP-C и в меньшей степени SP-B выполняют функцию «термодинамических катализаторов» при формировании мономолекулярной поверхностной пленки (в более узком смысле поверхностно-активного вещества). Благодаря наличию этих протеинов кинетика расширения чрезвычайно ускоряется. Только вследствие этого без задержек возможна адаптация состава поверхностно-активного вещества к соответствующим требованиям поверхностного натяжения. Эти свойства отражаются в крайне гидрофобном характере протеинов, в частности SP-C. Путем экстракции легочной ткани или промывки легких животных можно получить препараты поверхностно-активного вещества, которые как в физико-химической измерительной аппаратуре, например, на животных моделях, так и при клиническом применении проявляют способность компенсировать недостаток поверхностно-активного вещества и тем самым пригодны, например, для терапии детского синдрома удушья (респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН)). Однако этим препаратам, полученным из животных, присущи серьезные недостатки. Состав фосфолипидов сильно зависит от вида животного, его здоровья и состояния питания и может быть лишь в ограниченной степени сбалансирован примешиванием определенных компонентов. Содержание поверхностно-активных протеинов, а также соотношение SP-B/SP-C подвержено тем же неопределенностям. Кроме того, в терапевтически применяемой смеси также содержатся возможные продукты протеолитического разложения протеинов или модифицированные производные (например, в результате окисления метионина). При продолжительном применении или аппликации больших количеств поверхностноактивного вещества, что может быть необходимо, например, при синдроме удушья у взрослых (шоковые легкие, респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ)) или в других случаях применения, например, при использовании поверхностноактивного вещества в качестве «буксира» для других веществ при легочной аппликации, вопрос, связанный с пополнением вещества, остается открытым. Поэтому эти проблемы предлагается решать путем получения протеинов методами генной инженерии. Так как рекомбинантные протеины, в частности при применении бактериальных систем экспрессии, могут быть получены практически в неограниченных количествах, и существуе т возможность применения современных методов анализа и контроля качества, то, используя синтетические фосфолипиды, можно получить поверхностно-активное вещество точно определенного со става. Это вещество может оптимально удовлетворять терапевтическим требованиям. Центральная часть человеческого протеина SP-C (см. формулу I, где А обозначает Н или Phe, В обозначает Cys и С обозначает Met), который особенно важен для кинетики расширения, состоит исключительно из алифатических, очень гидрофобных аминокислот, таких, как валин, лейцин и изолейцин. Длина этой центральной части (аминокислоты 12-34) позволяет интегрировать пептид в мономолекулярную фосфолипидную пленку. В последовательности Pro-Cys-Cys-Pro (позиция 36) оба Cys-остатка тиоэтерифицированы пальмитиновой кислотой по SH-группам. Пальмитиновая кислота дополнительно повышает гидрофобный характер всего протеина и одновременно закрывает обе SH-группы цистеинов и защищает их от окисления и образования дисульфидного мостика. Центральная область (аминокислоты 13-34) образует трансмембранную пространственную спираль. Эта область примыкает к N-концу с помощью полярной последовательности, содержащей положительно заряженные аминокислоты (Lys, 10: Arg, 11). В международной заявке WO 91/18015 описывается получение рекомбинантного SP-C и мутантов SP-C. В этой заявке, помимо прочего, предлагается заменить оба цистеина в положениях 4 и 5 двумя серинами. Преимущество этого при получении состоит в том, что после выделения очень гидрофобного протеина отпадает необходимость в те хнически трудоемком пальмитоилировании обоих цистеинов. Неожиданно было обнаружено, что SP-C-мутанты, отличающиеся от человеческого белка SPC заменой обоих цистеинов в положениях 4 и 5 фенилаланином или триптофаном и заменой метионина в положении 32 изолейцином, лейцином или серином, не обладают никакими функциональными потерями в сравнении с природным SPC, а в отношении стабильности - даже превосходят его. При этом значительно упрощается получение с использованием методов генной инженерии с достижением более высокого выхода. Новые полипептиды с легочной поверхностной активностью могут быть получены с высокой чистотой. Предметом изобретения являются поэтому полипептиды с легочной поверхностной активностью, имеющие аминокислотную последовательность общей формулы I (I) где: А обозначает Н или Phe, В обозначает Phe или Trp и С обозначает Ile, Leu или Ser. Предпочтительным предметом изобретения являются полипептиды общей формулы I, где А обозначает Н или Phe, В обозначает Phe и С обо 2 35636 значает Ile, при этом наиболее предпочтительно А обозначает Н, В обозначает Phe и С обозначает Ile. Еще одним предметом изобретения являются фармацевтические композиции, которые отличаются тем, что содержат один или несколько полипептидов по изобретению и, при необходимости, дополнительно содержат один или несколько легочных поверхностно-активных полипептидов из группы SP-A и SP-B, предпочтительно SP-B. Полипептиды по изобретению могут быть получены либо по известным методам твердофазного пептидного синтеза, либо с помощью соответствующих рекомбинантных векторов в клеткаххозяевах. Методы конструирования векторов, методы трансформирования клеток, методы, вызывающие экспрессию протеина в трансформированных клетках, и методы выделения и очистки экспрессированных протеинов известны специалистам в данной области техники (см., например, WO 86/03408, WO 87/06588 и WO 91/18015). При получении векторов для экспрессии SP-C в бактериальных системах используют обычные методы рекомбинантной ДНК. Экспрессия гидрофобного SP-C-протеина в бактериях возможна в большом количестве и без ущерба для клетки-хозяина только в форме пригодных слитых протеинов, как, например, совместно с хлорамфениколацетилтрансферазой (CAT). Например, вектор pTrpAmpСАТ152 кодирует N-терминальную область CAT и предназначен для клонирования «внутри рамки считывания» (5'-)EcoRI- и (3'-)PstI-фрагментов ДНК, кодирующи х SP-C. CAT и SP-C связываются при этом на белковом уровне друг с другом через чувствительное к гидроксиламину место слияния (AsN¯Cly). Такие векторы, как рTrpAmpCAT152::SPC, позволяют осуществлять контролируемую экспрессию соответствующих слитых протеинов вплоть до производственного масштаба (ферментация). Экспрессия слитых белков вызывает образование телец включения в клетке-хозяине. При этом длина доли CAT в слитом протеине может быть изменена таким образом, что будут достигн уты высокие выходы телец включения при высокой доли SP-C. Помимо бактерий, экспрессия может происходить и в большом количестве систем-хозяев, например, в клетках млекопитающих, дрожжей и насекомых. Пригодные для различных клеток-хозяев конструкции ДНК синтезируют по известным методам и встраивают обычным образом с соответствующими управляющими последовательностями в геном клеток-хозяев. На синтезаторе ДНК MilliGen/Biosearch Cyclone обычным фосфоамидитным методом могут быть синтезированы два олигонуклеотида ДНК. Первый олигонуклеотид ДНК образует кодирующую (нетранскрибируемую) нить ДНК длиной 118 нуклеотидов. Эта нить кодирует (в направлении 5'®3') специфический в отношении EcoRI 5'конец для последующего субклонирования, место расщепления Asn/Gly гидроксиламином и человеческий SP-C, начиная с Gly-25 и кончая Leu-58 SPC-последовательности-предшественика, т.е. Gly-1, соответственно Leu-34 в формуле I. При этом из вестная аминокислотная последовательность человеческого SP-C-протеина, по правилам генетического кода, переводится в ДНК. Однако последовательность модифицируется таким образом, что оба цистеина в положениях 28 и 29 SP-Cпоследовательности-предшественника заменяются фенилаланином или триптофаном, а метионин в положении 56 последовательности-предшественника заменяется изолейцином, лейцином или серином. Таким же образом дополнительно могут быть учтены частоты использования кодона клетки-хозяина. Измененная SP-C-последовательность, содержащая в положениях 4 и 5 фенилаланин и в положении 32 - изолейцин (нумерация, согласно формуле I), обозначается в соответствии с обычным однобуквенным кодом для этих обеих аминокислот как SPC34(FF/I). Далее смысловая нить ДНК содержит терминирующий ТАА-кодон для прерывания рибосомной трансляции, а также специфический в отношении PstI 3'-конец. Второй олигонуклеотид ДНК представляет собой комплементарную, некодирующую (антисмысловую) нить, состоящую из 110 нуклеотидов. Синтетически полученный SP-C-фрагмент ДНК клонируют в пригодный вектор экспрессии, как, например, pTrpAmpCAT152. Этот вектор составлен из рКК233 (фирма Pharmacia), содержащего ген устойчивости к ампициллину и являющегося производным pBR322. Trc-промотор может быть заменен на Trc-промотор, как в pTrpAmpCFT152. Могут быть использованы также и другие индуцируемые промоторы. Для субклонирования SP-C-фрагмента комплементарные олигонуклеотиды ДНК сначала гибридизируют друг с другом. Получающаяся в результате двойная нить ДНК имеет выступающие однонитевые концы (EcoRI/PstI). Встраивание в векторную ДНК осуществляется обычным путем после расщепления векторной ДНК с помощью EcoRI/PstI, очистки требуемых фрагментов векторной ДНК посредством электрофореза в агарозном геле и гибридизации SP-CДНК и векторных фрагментов по сцепленным концам. Затем оба фрагмента, по известным методам, связывают друг с другом путем лигирования. Для амплификации ДНК и выделения плазмид производят трансформацию по обычным протоколам, например, в кальцийхлорид-компетентные клетки ММ294 Е.coli и для селекции несущих плазмиду клеток покрывают на LB-агаровых пластинках ампициллином. Из полученных устойчивых к ампициллину (Amp-резистентных) колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью соответствующи х комбинаций рестрикционного фермента. Выбирают клоны с ожидаемой рестрикционной картой ДНК. Путем полного секвенирования плазмидной последовательности подтверждается правильно осуществленная инсерция последовательности SPC34(FF/I). Полученные таким образом плазмидные векторы позволяют осуществлять экспрессию слитого протеина CAT::SPC под контролем Trc-промотора (или други х промоторов). Рекомбинантный слитой протеин выпадает в клетках-хозяевах после индукции в форме телец включения. Слитой протеин CAT152::SPC34(FF/I) имеет 3 35636 следующую, представленную обычным однобуквенным кодом аминокислотную последовательность: desministerium für Forschung und Technologie, Bonn]. В плазмиде рКК233-2, поставляемой фирмой Pharmacia, с помощью EcoRI/HindIII был вырезан Trc-промотор и заменен синтетическим Trpпромотором (рTrp233). Последний состоит из промоторной области (участок связывания РНКполимеразы), операторной области (участок связывания Trp-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (S/D-последовательности), а также сайтов рестрикции для клонирования. За Trp-промотором был вставлен ген (САТ152), кодирующий 152 аминокислоты 5'-части бактериальной хлорамфеникол-ацетил-трансферазы. С частью САТ152 ДНК-последовательности был слит синтетический фрагмент гена, кодирующий 34 аминокислоты, подобного человеческому, протеина SP-C(FF/I). Функциональный транскриптон CAT::SPC(FF/I) заканчивается бактериальной rrnВпоследовательностью Т1Т2, терминирующей транскрипцию. Полученная конструкция обозначается как pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I). Вектор pTrpAmpCAT::SPC(FF/I) имеет следующие функциональные элементы: - ген CAT152::SPC34(FF/I), управляемый Trpпромотором и Т1Т2-терминатором транскрипции; - ori-область и соседние области, которые управляют числом копий плазмиды; - ген Аmp®. После помещения плазмиды в клетку-хозяина, последняя имеет высокое число копий гена CAT::SPC(FF/I), контролируемого Trp-промотором. Trp-репрессор вырабатывает сама клетка-хозяин. Ферментативное получение rCAT::SPC регулируется концентрацией триптофана в среде, соответственно, добавлением b-IAA (b-индолилакриловой кислоты). 2. Периодическая ферментация. С помощью пробирки Working Cell Bank (культура глицерина) культуральную среду (состав см. ниже) высевают в шейкер (предварительная или начальная культура 1 л) и при 37°С инкубируют при встряхивании и при сильной ампициллинзависимой селекции. За ростом следят по оптической плотности при 578 нм. По достижении начальной культурой Е.соli 199 оптической плотности более 3 культур у высевают в 10-литровый ферментер и продолжают выращивание бактерий при уменьшенной ампициллинзависимой селекции. После достижения значения оптической плотности между 5 и 6 10-литровую культур у переносят в 100литровый ферментер и продолжают инкубировать в те х же условиях. После достаточного роста путем добавления, например, 40 мг/л P-IAA индуцируют управляемый Trp-промотором транскриптон CAT::SPC(FF/I). После индукции для сбора клеток ферментацию продолжают дополнительно в течение 4-5 ч. Во время ферментации напрямую контролируют и регулируют парциальноедавление кислорода (рО2), значение рН и температуру бульона в ферментере. Значение рН поддерживают постоянным с помощью раствора едкого натра, парциальное давление кислорода (рО2) регулируют путем введения кислорода и с помощью числа оборотов мешалки. Оптическую плотность при 578 нм и концентрацию источника С в среде определяют через определенные интервалы. Пенообразова 34 аминокислоты SP-C(FF/I) в положениях 153-186 слитого протеина выделены подчеркиванием и указанием положений 1-34. Последующее расщепление гидроксиламином для разделения CAT и SP-C происходит между Asn-152 и Gly-153 (соответствует 1-й аминокислоте в SP-C-пептиде). Выделение и очистка SP-Cпептида осуществляется по обычным в химии белка методам. Полипептиды, по изобретению, можно применять отдельно или в комбинации в фармацевтических композициях, которые удовлетворяют требованиям лечения дыхательных путей. Эти композиции пригодны не только для лечения синдрома удушья у недоношенных новорожденных и у взрослых, но также и для лечения пневмонии и бронхита. Кроме того, полипептиды по изобретению пригодны в качестве «буксира» для лекарственных веществ, вводимых путем ингаляции. Наряду с полипептидами, композиции содержат фосфолипиды, предпочтительно такие фосфолипиды, которые содержатся в природных составах, обладающих легочной поверхностной активностью, как, например, предпочтительно: дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ФОФГ) и/или фосфатидилглицерин (ФГ). Для достижения оптимальной вязкости композиции содержат ионы кальция или магния, а также хлорид натрия. Для определения вида и количества отдельных компонентов композиций специалист может ориентироваться, во-первых, на известный состав природного легочного поверхностно-активного вещества, а во-вторых, на многочисленные предложения, известные из уровня техники, например, из европейских патентных заявок ЕР-А 0119056 и ЕР-А 0406732. Предпочтительные композиции, по изобретению, содержат от 80 до 95 мас.% фосфолипидов, от 0,5 до 3,0 мас.% полипептидов, от 4 до 7 мас.% жирной кислоты, предпочтительно - пальмитиновой кислоты, и от 1 до 3 мас.% хлорида кальция. Пример получения. 1. Штамм-продуцент. Применяемый штамм-продуцент E.coli 199 имеет происхождение из штамма ММ294 E.coli K12, который депонирован под № 5208 в «Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ» (DSM, Браун швейг). Вектор экспрессии pTrpAmpCAT152::SPC34 (FF/I), содержащий ген слитого протеина CAT152::SPC34(FF/I), был получен из ДНК-последовательности pBR322, т.е. ColEI-производного [E.Weber (ред.), (1988), Biologische Sicherheit, Bun 4 35636 ние контролируют с помощью пенного датчика, с помощью которого, при необходимости, определенными дозами добавляют антивспениватель для подавления пенообразования. В различные моменты времени отбирают аликвоты культурального бульона. После лизиса бактерий протеины E.coli для контроля экспрессии разделяют на полиакриламидном геле и подкрашивают. Процентную долю (доминантных) протеинов во всем протеине E.coli определяют с помощью денситометра. Вскоре после индукции рекомбинантного гена появляется новая доминантная протеиновая полоса (rCAT::SPC). Культуральная среда имеет следующий состав: Соевый пептон 27,0 г/л, дрожжевой аутолизат KAV 14 г/л, NaCI 5,0 г/л, К 2НРО4 ´ЗН2О 6,0 г/л, КН2РО4 3,0 г/л, MgSO4 ´7Н2О 0,5 г/л, глицерин (99,5%-ный) 30,0 г/л, антивспениватель J673 (фирма Structol Соmр.) 0,2 мл/л, L-триптофан 80,0 мг/л и ампициллин 20 мг/л для 1-й предварительной культуры и 5 мг/л - для 2-й предварительной культуры и 100-литрового ферментера. Перед нагреванием в автоклаве и стерилизацией комплексной питательной среды рН с помощью 2Н NaOH устанавливают на 6,8. Для предварительной культуры в 10-литровом ферментере скорость мешалки составляет 750 об/мин, а расход кислорода составляет 10 л/мин при 37°С, для главной культуры в 100-литровом ферментере скорость мешалки составляет 400 об/мин, а расход кислорода составляет 70 л/мин при 37°С. Антивспениватель при необходимости добавляют одноразовым шприцем через перегородку. Приблизительно через 4 часа после индукции клетки отделяют от культурального бульона фильтрацией и/или центрифугированием. Влажную клеточную массу собирают в емкости из нержавеющей стали и в течение ночи перемешивают с 10 л переваривающего буфера (рН 8,0) в холодильнике (16 часов, 4°С). Перемешанную клеточную суспензию обрабатывают (при комнатной температуре) в гомогенизаторе высокого давления (³700 бар) и снова собирают в стерильную емкость из нержавеющей стали. Затем сразу же путем фильтрации и/или центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 27000xg) при 4°С собирают тельца включения, ресуспендируют в буфере (около 1 л) и порциями, например, приблизительно по 350 мл, переносят в 1-литровую круглодонную колбу и лиофилизуют в течение приблизительно 96 часов. Из 100-литровой ферментационной загрузки получают приблизительно 200 г сухих телец включения с содержанием слитых протеинов более 20 мас.%. Лиофилизованные тельца включения могут храниться при -20°С месяцами. 3. Расщепление слитого протеина и очистка липофильного пептида SP-C(FF/I). 100 г сухих телец включения растворяют при легком нагревании в 1,6 л 8-молярного раствора гидрохлорида гуанидина (917,1 г). Нерастворившийся остаток отфильтровывают через складчатый фильтр. Для расщепления слитого протеина по месту связывания Asn-Gly к раствору добавляют 167 г гидроксиаммонийхлорида и рН раствора доводят 2Н NaOH до 9,6. Расщепляющий раствор затем оставляют стоять на 3-4 дня при комнатной температуре при перемешивании. По завершении реакции добавлением 6,4 л трис-буфера (рН 8,0) осаждают SPC(FF/I) и его отделяют с помощью центрифугирования (центрифуга Sorvall RC2-B, 20000xg). Надосадочную жидкость декантируют, осажденные центрифугированием SP-C повторно суспендируют в 400-500 мл трис-буфера и снова центрифугируют при тех же условия х в течение 30 минут. Осажденный центрифугированием SP-C растворяют в 3,5 л смеси хлороформа, метанола и соляной кислоты (1,75 л CHCl3 + 1,75 л CH3OH + приблизительно 30 мл 2Н НСl). Этот сырой раствор SP-C далее очищают с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) на С8 в качестве материала обращенной фазы. Хлороформ/метанольный экстракт перед загрузкой на колонку для препаративной ЖХВД разбавляют 90%-ным метанолом в соотношении приблизительно 1:2. Из этого раствора в колонку (диаметр 5 см) можно загружать, например, приблизительно 400 мг SP-C(FF/I) (например, разбавленного ~2 литрами сырого экстракта). SPC (FF/I) элюируют в кислых условиях (рН 2-3) с использованием градиента вода/изопропанол (см. условия разделения). Приблизительно через 30 минут хроматографирования в той области, в которой элюирован SP-C (УФ-обнаружение при 220 нм), собирают 4-6 фракций по 200 мл. Фракции проверяют с помощью аналитической ЖХВД и, соответственно, направляют в банк данных. Если пробы необходимо хранить, то их замораживают в жидком азоте и хранят в морозильной камере при -80°С. Чистота получаемого SP-C(FF/F) составляет 98,5-99,5%. Условия разделения: Колонка Kromasil С8 100 А 16 мкм 300 мм, внутренний диаметр - 50 мм. Элюент А: Вода для ЖХФД из установки Мillipore; Б: изо-РrОН с линейным градиентом; В: 60 ммоль/л НСL (разбавление из дымящей соляной кислоты). Градиент Время %А %Б %В 0 10 55 65 75 85 90 45 45 0 0 45 45 45 50 50 95 95 50 50 50 5 5 5 5 5 5 5 Поток (мл/мин) 100 100 100 100 100 100 0,2 4. Встраивание SP-C(FF/I) в фосфолипидную матрицу. Липофильный пептид SP-C(FF/I) смешивают в изопропанольном растворе с компонентами фосфолипидной матрицы и осаждают путем впрыскивания в разбавленный раствор поваренной соли (0,065% вес/вес NaCI) при комнатной температуре в гомогенной смеси с компонентами фосфолипидной матрицы. Из суспензии легочного поверхностно-активного вещества на стаканчиковой центри 5 35636 фуге отделяют легочное поверхностно-активное вещество (ЛП АВ), ресуспендируют в растворе электролита (NaCI, СаСl2) и с помощью 0,1Н NaOH рН доводят до 6,5. Эту водную суспензию разливают по 20-миллилитровым ампулам и лиофилизуют. Приведенные в нижеследующем примере получения весовые и объемные данные относятся к получению 10-граммового препарата легочного поверхностно-активного вещества. 7,00 г дипальмитоилфосфатидилхолина (ДРФХ), 3,08 г аммониевой соли пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (ПОФГ ´ NН4) и 0,25 г пальмитиновой кислоты растворяют при 40°С в 200 мл 90%-ного изопропанола и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор фосфолипида объединяют с 1 л раствора, полученного после ЖХВД-очистки и содержащего 200 мг очищенного SP-C(FF/I). Значение рН полученного «распыляемого раствора» доводят при перемешивании раствором бикарбоната (приблизительно 5 мл 5%-ного раствора NaHCO3) до 4,5. «Распыляемый раствор» при интенсивном перемешивании вводят при комнатной температуре со скоростью впрыскивания 25 мл/мин через однокомпонентное сопло в 9,6 л разбавленного раствора NaCI (0,065% вес/вес). Образуется опалесцирующий раствор, из которого после двухчасовой выдержки при 4-8°С при впрыскивании раствора электролита (3,0 г CaCl2´2H2O и 61,3 г NaCI в 300 мл Н2О) в осадок выпадает препарат легочного поверхностно-активного вещества. С успензию легочного поверхностно-активного вещества (общий объем 10,8-11,0 л) выдерживают в течение ночи при 4°С, а затем в течение 30 минут цен трифугир уют на стаканчиковой центрифуге Sorvall (RC2-В) при 16000xg. Для удаления остатков изопропанола образовавшуюся при центрифугировании лепешку ресуспендируют в половинном объеме 0,65%-ного раствора поваренной соли и повторно центрифугируют. Эту стадию повторяют 34 раза. Лепешку, полученную на заключительной стадии центрифугирования, растворяют в 400 мл 0,65%-ного раствора NaCI, значение рН с помощью 0,1Н NaOH доводят до 6,5 и распределяют порциями по 6,2 г в 20-миллилитровые ампулы. Содержимое ампул лиофилизуют следующим образом: замораживают на 6 часов при -45°С и нормальном давлении, сушат вымораживанием в течение 54 часов при 0,16 мбар и -20°С, а затем для дальнейшей интенсивной сушки еще в течение 5 часов при -20°С и 0,02 мбар. Таким путем получают 65-66 ампул, содержащи х по 0,150 г легочного поверхностно-активного вещества (рассчитано без NaCI). Сухие пробы легочного поверхностно-активного вещества хранят в холодильной камере при 4°С, а перед применением их необходимо ресуспендировать водой или физиологическим раствором NaCI (суспензионная концентрация 25 мг/мл). В каждой ампуле содержится: 95,6 мг дипальмитоилфосфатидилхолина; 42,1 мг пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (аммониевая соль); 2,7 мг SP-C(FF/I); 6,8 мг пальмитиновой кислоты; 2,9 мг хлорида кальция (безводного). __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 6