Спосіб одержання вакцини для лікування гострих та хронічних захворювань сечостатевих органів

1. Спосіб одержання вакцини для лікування гострих та хронічних захворювань сечостатевих органів шляхом виділення від хворого бактеріальної мікрофлори, відбору вирослих колоній, інактивації мікроорганізмів та отримання антигенного матеріалу, який відрізняється тим, що додатково визначають наявність у хворого вірусної інфекції і, в залежності від виявленого набору умовнопатогенних та патогенних бактерій та вірусів, готують антигенний матеріал, причому інактивацію мікроорганізмів та їх токсинів здійснюють залежно від їх специфічних особливостей біологічними, хімічними чи фізичними засобами, після чого до антигенної композиції додають офіцинальні протиінфекційні препарати, зокрема протигерпетичну та протитрихомонадну вакцини, а одержану суспензію обробляють ультразвуком до отримання водно-ліпідних мікрочасток розміром 20-25мкм. 2. Спосіб одержання вакцини за п. 1, який відрізняється тим, що інактивацію грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів здійснюють гідро U 2 (19) 1 3 37776 ускладнює лікування хронічних хворих. Частіше за все причиною гострих запалень та перехід їх у хронічну форму є не окремі віруси та мікроорганізми, а їх поєднання в асоціації. З іншого боку імунітет, в цілому, у сучасного покоління людей, є значно послабленим. У зв'язку з таким становищем комбіновані або асоційовані бактерійновірусні вакцини мають значні переваги: - застосування асоційованої вакцинації дозволяє використовувати більшу кількість антигенів, уживання яких у вигляді моновакцин було б нездійсненним в зв'язку з неможливістю проведення вакцинації в необхідні інтервали між щепленнями [2]; - асоційована вакцина дозволяє утворювати необхідний імунітет у вакцинованого до збудників декількох інфекцій у скорочені терміни, що дає виграш у часі та є важливим в умовах ускладнення хвороби [2]; - об'єднання декількох антигенів в один препарат веде у більшості випадків до підвищення імуногенних властивостей окремих компонентів в порівнянні з моновалентними вакцинами [3]; - використання асоційованих вакцин значно спрощує проведення щеплень [3]. Відома заявка RU 2005112242 [4], в якій заявлена вакцина для перорального використання із 26 компонентів, що включають мікробних збудників, а також антивірусні вакцини, та вакцину виготовлену на основі онкогенних вірусів Еп штейн-Бара, папіломи вірусної інфекції. Композиція включає також вакцину проти холери, вакцину проти бактерійних збудників, що визивають діарею мандрівників. У заявці RU №97104479 [5] до складу оральної вакцини включено в якості імуностимулятора термолабільний антиген ентеротоксину кишкової палички. Композиція складається із 28 бактерійних антигенів патогенних бактерій як грампозитивних так і грамнегативних мікроорганізмів, а також вакцинних препаратів: протигрипозної вакцини, вакцини проти вітряної віспи, кору, краснухи, епідемічного паротиту, мікоплазми, японського енцефаліту, герпесу, поліомієліту, Campylobacter, Salmonella, Shigela, ентеропатогенної та ентеротоксичної кишкової палички, протихолерної вакцини, гепатиту В, ди фтерійний та правцевий анатоксини. Недоліком наведених вище двох композицій є те, що асоційована вакцина містить збудників інфекцій, з якими пересічна людина може не зустрітися впродовж усього життя, проте введення в організм величезної кількості мікробних та вірусних антигенів значно сприяє алергізації людського організму, та можливості появи невиліковних хвороб. Тому, на наш погляд, асоціювання різних бактерійних та вірусних антигенів має бути цільового призначення, спрямоване на подолання етіологічно споріднених інфекцій. Відомий патент RU 2095073 [6] "Способ лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта, вызванных бактериальной микрофлорой", що є найбільш близьким аналогом (прототипом). Відповідно до цього патенту пропонується вакцина «СИАМ» - стерильний індивідуальний антигенний матеріал для лікування хворих уретритами, простатитами та вагінітами, спричи 4 нених умовно-патогенною мікрофлорою. Проводять лабораторне дослідження патогенного матеріалу від хворої людини, відбирають колонії мікроорганізмів, зрощують їх на поверхні целофану, нанесеному на пластинку щільного живильного середовища. Із колоній мікроорганізмів, що виросли на целофані готують мікробну суспензію в апірогенній дистильованій воді, інактивують підігріванням при 100-110°С упродовж 45-60 хвилин. Отриманий антиген розміщують в ампули по 0,5мл., контролюють стерильність та запаюють. Вакцину вводять в шкіру по 0,5мл, 8-10 ін'єкцій на курс вакцинації. Запропонований метод одержання чистих культур вирощуванням на целофані, накладеному на щільне живильне середовище, може використовуватись лише для накопичення умовнопатогенних мікроорганізмів, менш вибагливих до компонентів живильного середовища. З іншого боку відомо, що саме патогенні мікроорганізми є першочерговими чинниками хвороби людей. До того ж вакцину «СИАМ» вводять у шкіру та м'язи без визначення можливої токсичної дії на введення препарату. Крім того, анатоксини отримують термічною обробкою мікроорганізмів, що може привести до теплової денатурації білку, руйн уванню ферментів, ліпополісахаридів, нуклеїнових кислот, внаслідок чого можуть змінюватися антигенні властивості мікроорганізмів. Термостабільні токсини деяких мікроорганізмів у даному способі не інактивують, внаслідок чого є ризик прояву токсичних властивостей вакцини. Зважаючи на перераховані недоліки вакцини цільового призначення за прототипом при гострих та хронічних захворюваннях сечостатевої системи, була поставлена задача розробити асоційовану бактеріально-вірусну вакцину, не реактогенну, з підвищеною імуногенністю, для лікування гострих та хронічних запалень сечостатевих органів чоловіків та жінок. Задача вирішується тим, що одержання вакцини для лікування гострих та хронічних захворювань сечостатевих органів здійснюють на основі способу прототипу (виділення від хворого бактеріальної мікрофлори, відбору вирослих колоній, інактивації мікроорганізмів та отримання антигенного матеріалу), а після додаткового визначення наявності у хворого вірусної інфекції і, в залежності від виявленого набору умовно-патогенних та патогенних бактерій та вірусів, готують антигенний матеріал, причому інактивацію мікроорганізмів та їх токсинів, здійснюють залежно від специфічних особливостей мікроорганізмів фармакологічними (фармпрепарат „Ектеріцид" у кількості 5,0-7,0мл), фізичними (ультразвук із силою струму 0,3-0,5А, з частотою 22-25кГц), чи хімічними (озон, в концентрації 1000-2000мкг/л, швидкість пропускання через суспензію 0,25-0,5л/хв.) засобами впродовж 15-20 хвилин. Інактивацію спорових грибів здійснюють, комбінуючи дію УЗ та озону. Інактивацію ендотоксинів токсичних грамнегативних бактерій здійснюють УЗ та протеолітичними ферментами, наприклад, трипсином. Композицію одержаних антигенів поєднують з існуючими офіцінальними вакцинами проти вірусу герпесу І та II типів та з протитрихо 5 37776 монадною вакциною та обробляють ультразвуком до отримання водно-ліпідних мікрочасток розміром 20-25мкм. Задачу вирішують наступним чином. 1. Відбір матеріалу. Патологічний матеріал відбирають із слизових оболонок людини при захворюваннях сечостатевих органів чоловіків та жінок. 2. Пророщування, диференціювання мікроорганізмів та відбір колоній. Патологічний матеріал кладуть у пробірки із стерильним глюкозним бульйоном та ставлять у термостат при +37°С на 18-20 годин. Відбирають колонії патогенних та умовнопатогенних мікроорганізмів, готують мазки з колоній, забарвлюють по Граму. Колонії патогенних й умовно-патогенних мікроорганізмів відсівають на живильний бульйон та після термостатування протягом 1 доби висівають на елективні середовища для одержання чистих культур. Культури вирощують 18-20 годин при +37°С. 3. Стерилізація мікробних суспензій. Для отримання антигенів мікроорганізмів використовували окремі методи інактивації як то: біологічні (обробка гідролізною ліпідною речовиною з бактерицидною активністю; фізичні (ультразвукова дезінтеграція мікроорганізмів); хімічні (обробка озоном); для інактивації токсинів - обробка ферментом трипсином), а також поєднання цих методів у різних комбінаціях. Для знезараження ізольованих патогенних грампозитивних та грамнегативних мікроорганізмів, окрім Pseudomonas aeruginosa, таких як: Neisseria gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus gr.D, та умовно-патогенних мікроорганізмів: Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris використали ектерицид (Ectericidium), який виробляється ЗАТ «Біолік», м. Харьків, Помірки. Його виробництво затверджено наказом МОЗ України від 11.12.2001р. №495. Для отримання бактерійної маси при виготовленні антигенів різних культур використовують одну й ту методику. А, саме, газон зрослих культур на щільному живильному середовищі змивають забуференим (рН 7,2-7,4) стерильним фізіологічним розчином (5-7мл) та вносять у центрифужні пробірки. Центрифугують при 5000об/хв.. - 1520хв. Після центрифугування надосадкову рідину видаляють у дезінфекційний розчин. Відповідно до стандарту мутності (ГІСК) концентрацію мікроорганізмів фізіологічним розчином доводять до 107 мікробних клітин в 1,0мл. До осаду поступово приливають 5,0-7,0мл ектерициду добре розбивають осад. Суспензії кожного мікроорганізму в ектерициді в окремих пробірках термостататують 3 доби (+37°С). Кожної доби пробірки енергійно струшують, контролюють стерильність. Кожний антиген додатково перевіряють на токсичність. При інактивації мікробів ектерицидом утворюються антигени, що містять такі біологічно активні сполуки: - мурамілдіпептиди (МДП), тейхоєві, гліцеринтейхоєві кислоти з грампозитивних коків (Staph. aureus, Staph. epidermidis, Streptococcus gr.D), 6 - ліпополісахариди (ЛПС ) із грамнегативних (Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Gardnerella vaginalis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis) - анатоксини (кишкова паличка та Staph. aureus). На стадії об'єднання всіх антигенів (в тому числі, і утворених біологічно активних сполук) в одне ціле з ліпідною основою ектерициду, утворюється потужний імуномодулюючий та імуностимулюючий комплекс. Для антигенів, з наявністю екзо- та ендотоксинів, зокрема, Pseudomonas aureginosa, використовували ультразвукову обробку мікроорганізмів культур. Готували суспензії з мікроорганізмів. На апараті УЗДН-1 в режимі: силою струму 0,3-0,5А в діапазоні 25-30кГц проводили обробку суспензії мікроорганізмів 15-20 хвилин. Якість обробки суспензії у ви ще наведених інтервалах дії та часу ультразвука оцінювали за стерильністю висівів на щільне середовище. Параметри дії УЗ силою струму менше за 0,3А, часто ти до 25кГц, з інтервалом обробки менше 15 хвилин не приводили до повної інактивації мікроорганізмів, а верхнього параметру дії УЗ, тобто 0,5А, 30кГц та 20 хвилин було цілком достатньо для повної стерилізації суспензії, за виключенням Pseudomonas aeruginosa. Для руйнування термостабільного токсину у складі антигену Pseudomonas aeruginosa лише УЗ обробки було недостатньо. Після ультразвукової обробки суспензії з цим антигеном, його необхідно додатково піддати обробці протеолітичним ферментом - розчином трипсину, у співвідношенні до суспензії з антигеном як 1:1. Одержану суміш витримують 18-20 годин у термостаті, перевіряють на токсичність на білих мишах при внутрішньочеревному введенні. Отриманий нетоксичний антиген об'єднують в рівних об'ємах з одержаними раніше іншими антигенами, отриманими після обробки ектерицидом. Інактивацію стійких до ектерициду спорових грибів, наприклад, Candida albicans обробляли ультразвуком аналогічно до вищенаведеного. Якість обеззараження перевіряли посівами суспензії на щільне елективне середовище Сабуро. Було встановлено, що вегетативні форми грибів гинули, але спорові форми проростали на 5-ту добу (100-150 колоній), тому суспензію додатково обробляють озоном з концентрацією озону 10002000мкг/л, котрий пропускали через емульсію у флаконі із швидкістю 0,25-0,5л/хв. Оптимальні параметри обробки озоном встановлені емпірично за наявності або відсутності росту колоній. Суспензія після комбінованої обробки ставала стерильною та нетоксичною, можливою для приготування асоційованої вакцини. Таким чином, можна констатувати, що знищення спорових форм мікроорганізмів можливо лише в комбінації УЗ та озону. Антиген був також не токсичним для білих мишей. Одноразової обробки озоном зазвичай буває достатньо для отримання стерильного антигену. Таким чином, отримували вакцину, що у своєму складі має асоціацію антигенів патогенних мікроорганізмів (Neisseriae gonorrhoeae, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus, Streptococcus 7 37776 gr.D, Candida albicans та антигени умовнопатогенних мікроорганізмів (Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris). Отриманий багатокомпонентний антигенний матеріал об'єднували з офіцінальними препаратами: вакциною проти герпесу 1 та 2 типів, та з протитрихомонадною вакциною з тібералом, а також з лікувальними препаратами (для лікування хламідій та мікоплазм) з препаратами протизапальної та протиалергійної дії, стимулюючими імуногенез (наприклад, вітамін С). Отримані стерильні та нетоксичні антигени з'єднували в рівних об'ємах, вносили протигерпетичну інактивовану та протитрихомонадну вакцини та обробляли на ультразвуковому апараті УЗДН-1, силою току 0,3-0,5А, частотою 20-22кГц, упродовж15-20 хвилин для приготування вакцини у вигляді водно-ліпідних мікрочасток (мікросфер) розміром 20-25мкм. їх розміри визначали методом темнопільної мікроскопії. Імуногенну активність запропонованої вакцини в комплексі з герпетичною вакциною випробовували на білих щура х та порівнювали одержані результати з дією вакцини прототипу. Рівень антитіл до бактерійних антигенів, що входять в комплекс асоційованої вакцини тапрототипу вивчали в реакції аглютинації у сироватках щурів. Результати наведені в таблиці 1. Було встановлено, що антигени заявленої вакцини мали у 2-2,5 рази більш високу імуногенну активність ніж антигени вакцини прототипу. Переваги заявленої вакцини порівняно із прототипом полягають у: - введенні до складу вакцини антигенів патогенних бактерій, що спричиняють запалення чоловічих та жіночих органів; 8 - розширенні компонентного складу вакцини за рахунок введення офіцінальних вакцин проти вірусів герпесу І та II типів та проти три хомоніазу; - здійсненні стерилізації та дезинтоксикації токсинів мікроорганізмів відповідно до особливостей їх виду, що забезпечило повне знезараження вакцини при збереженні біологічно активних речовин бактерій та імуногенної активності антигенів. Приклади виконання способу. І. Загальна частина способу для всі х прикладів 1.1. Відбір матеріалу. Патологічний матеріал відбирають із слизових оболонок людини при захворюваннях сечостатевих органів чоловіків та жінок, стерильними спеціальними синтетичними щіточками та при масажі передміхурової залози. 1.2. Пророщування, диференціювання мікроорганізмів та відбір колоній. Щіточки та сік передміхурової залози кладуть у пробірки із стерильним глюкозним бульйоном та ставлять у термостат при +37°С на 18 годин. Роблять прямі посіви відібраного матеріалу та після відрощування у рідкому живильному середовищі на агаровому диференціально-діагностичному середовищі вирощували посіви впродовж 18 год. при +37°С. Відбирали колонії, що є характерними для патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів, коків, грамнегативних мікроорганізмів, готували мазки з колоній, на предметному склі та забарвлювали по Граму. Колонії патогенних та умовнопатогенних мікроорганізмів відсівали на живильний бульйон та після витримки 24 год., при +37°С висівали на щільний живильний агар, середовище Ендо та середовище Сабуро, кров'яний агар, культури вирощували 18 годин при +37°С. Таблиця 1 Титри антитіл після імунізації білих щурів асоційов аною в акциною в порів нянні з в акциною запропонов аною прототипом Наймену-вання №№ білих в акцин щурів Вакцина за заяв кою 1 2 3 4 5 6 Klebsiella pneumoniа 1280 5120 5120 2560 5120 1280 М±m Вакцина прототипу не заяв лено 7 8 9 10 11 12 М±m Уров ень стат. значимости, Р Обернені титри антитіл до антигенів Klebsiella Staph. Staph. Proteus oxitoca aureus epider-midis vulgaris 2560 1280 1280 2560 1280 1280 640 1280 5120 640 1280 5120 5120 1280 640 5120 1280 2560 640 1280 2560 1280 1280 1280 2773,3±769, 1386±256,9 960,0±256,9 2 Staph. Staph. Proteus не заяв лено aureus epider-midis vulgaris 320 320 640 640 320 640 640 320 640 320 640 640 640 320 640 640 320 320 533,3±67,5 373,3±53,3 586,7±53,3 0,007 0,043 0,014 Gardn vagin. 2560 5120 5120 1280 5120 1280 не заяв лено 9 37776 10 II. Інактивацію мікроорганізмів здійснювали наступним чином (Табл. 2) Таблиця 2 Інактивація патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів Вид обробки Бактерії Параметри обробки Приклад №1 Приклад №2 Контроль стерильності Контроль токсичності нетоксичн. -"-"-"стерильний -"-"-"-"-"не стерильний Токсичний стерильний не токсичний стерильний не токсичний Е.соlі Кl.рnеumоn Kl.oxytoca Pr.vulgar. 3 доби, +37°С Pr.mirabilis Gardn. vagin. Ектерицид Pr. Vulg. Pr. Mirab. Neis. gonor. Candida albicans 3 доби, +37°С 5 діб +37°С Staphilococcus aureus 3 доби, +37°С Streptococcus 3доби,+37° С epidermidis Pseudomonas Сила струму Сила струму стерильний aerugenosa 0,3А, частота 0,5А часто та 25кГц, термін 30кГц, термін 15хв. 20хв Ультразвук Candida albicans Сила струму Сила струму не стерильний 0,3А, частота 0,5А, частота 25кГц, термін 30кГц, термін 15хв. 20хв. Ультразвук + Pseudomonas УЗ:0,3А,25кГц 0,5А,30кГц стерильний трипсин aerugenosa Трипсин :суспензія =1:1 Candida albicans УЗ:0,3А,25кГц 0,5А,30кГц стерильний Озон:1000мкг/л 2000мкг/лУльтразвук + швидкість швидкість озон 3,25л/хв., термін 0,5л/хв термін 15хв 20хв Після поєднання всіх Сила струму Сила струму стерильний інактивованих компо0,3А, частота 0,5А, частота нентів в рівних об'20кГц, термін 22кГц, термін Обробка УЗ ємах та додавання 15хв. 20хв для одержання протигерпетичної інакмікрочасток тивованої та протигрихомонадної вакцини Джерела інформації: 1.Виноград Н. О., Ковальська О. Р. Кореляція показників захворюваності на венеричні і невенеричні хвороби населення України. XI конгрес світової федерації Українських лікарських товариств, м. Полтава. Тези доповідей 28-30 серпня 2006 . Полтава - Київ – Чикаго 2006 С.451-452. 2. Труханов Б. Г. Ассоциированные вакцины. Медицина, 1964. С.274 3 .Рогозин И. И., Беляков В. Д. Ассоциированная иммунизация и экстренная профилактика. М.; Медицина, 1968. - 21 л. 4. Заявка RU 2005112242 Усовершенствованные вакцины. 5. Патент RU 2160606 Мутант энтеротоксина, эффективный в качестве нетоксичного орального стимулятора. Токсичний не токсичний не токсичний не токсичний не токсичний 6. Патент RU №2095073 Способ лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта, вызванных бактериальной микрофлорой. 7. Зайченко О. І., Романюк Ю. П., Черепанин В. І. Досвід застосування вакцини « Солкотриховак» для лікування хронічних трихомонадних уретро простатитів у чоловіків. Журнал Імунологія та алергологія 2004, №1, С.65. 8. Лоз юк Л. В., Лісняк О. І., Лозюк P. M. Перспективи застосування ізатізону в медичній практиці. XI конгрес світової федерації Українських лікарських товариств, м. Полтава. Тези доповідей 28-30 серпня 2006. Полтава – Київ - Чикаго 2006 С.457. 11 37776 9. Бідненко С. І. Перспективи методу ультразвукової дезінтеграції для одержання антигенів грибів роду Candida та вивчення їх у серологічних Комп’ютерна в ерстка Л. Купенко 12 реакціях. Доповідь на 111 з'їзді Українського мікробіологічного товариства 1-3 червня 1971 року, Київ, 1971р. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601