Спосіб визначення мембраностабілізуючої функції організму і пристрій для його здійснення

1.Спосіб визначення мембраностабілізуючої функції організму, який включає постановку і автоматизовану реєстрацію реакції кислотного гемолізу, який відрізняється тим, що додатково здійснюють постановку реакції кислотного гемолізу з попередньо обробленою ультрафіолетовими променями ізольованою пробою крові та пробою крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, а результати порівнюють з контролем, оцінюючи за формулою: Ims=(1+V-C)·V2·C2 де Ims- інтегральний індекс мембраностабілізуючої функції; V - показник резистентності мембран еритроцитів проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму; С - показник резистентності мембран еритроцитів проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro, причому показник V визначають за допомогою формули: V=(tv-tk)·tg φ v де tv і tk - час 50% гемолізу проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, і контрольної проби - відповідно, с; A (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МЕМБРАНОСТАБІЛІЗУЮЧОЇ ФУНКЦІЇ ОРГАНІЗМУ І ПРИСТРІЙ ДЛЯ ЙОГО ЗДІЙСНЕННЯ 38074 тичного чинника ізольованих клітин крові, а саме, еритроцитів. При цьому не враховується адаптаційна ресурсність мембраностабілізуючих механізмів організму як цілого. В основу винаходу поставлене завдання удосконалити відомий спосіб, в якому шляхом додаткової постановки реакцій на резистентність клітинних мембран до гемолітичного чинника в умовах впливу стандартизованого фізичного чинника як на ізольовані клітини, так і на весь організм з наступним аналізом отриманих результатів досягають підвищення інформативності способу. При розгляді технічного завдання були взяті до уваги фізіологічні особливості регуляторних механізмів стабілізації резистентності клітинних мембран. Ці механізми залежно від природи регуляторного стимулу мобілізуються на різних рівнях структурної організації організму, зберігаючи при цьому тісний характер системних взаємозв'язків. Так, наприклад, на подразнення організму як цілого чинником будь-якої природи відбувається нейроендокринна мобілізація системи циклічних нуклеотидів, в результаті чого адекватно підвищується резистентність клітинних мембран до дії будьякого пошкоджуючого чинника. Цілком зрозуміло, що при дії аналогічного чинника на ізольовані клітини останні обмеженні у виборі мембраностабілізуючих резервів порівняно з цілим організмом. Так, при дії ультрафіолетових променів на ізольовану кров відбувається прискорення процесу гемолізу, тоді як при дії випромінювання на весь організм має місце гальмування цитолітичного процесу [2]. Без ура хування зазначених особливостей висновки про рівень функціональних можливостей мембраностабілізуючих механізмів в організмі будуть далеко не повними. Саме встановлення різниці потенційної здатності протистояти руйнівному впливу чинників ендогенної або екзогенної природи з боку ізольованих клітин, з одного боку, та організму як цілого - з іншого, очевидно, забезпечує необхідний рівень інформативності досліджень мембраностабілізації як функції організму. Поставлене завдання вирішують тим, що у відомому способі, який включає постановку і автоматизовану реєстрацію реакції кислотного гемолізу, відповідно до винаходу, додатково здійснюють постановку реакції кислотного гемолізу з попередньо обробленою ультрафіолетовими променями ізольованою пробою крові та пробою крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, а результати порівнюють з контролем, оцінюючи за формулою: Ims=(1+V-C)·V2 ·C2 де Ims- інтегральний індекс мембраностабілізуючої функції; V - показник резистентності мембран еритроцитів проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму; С - показник резистентності мембран еритроцитів проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro; причому показник V визначають за допомогою формули: V=(t v-t k)·tg φ v де tv і t k - час 50% гемолізу проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромі нення організму, і контрольної проби відповідно, с; tg φv - тангенс кута з вершиною у серединній точці перпендикуляру, опущеного з найвищої точки кривої контрольного гемолізу (100% гемоліз), утворений горизонталлю, що проходить через цю точку, і прямою, яка проходить через неї і аналогічну серединну точку на перпендикулярі, який опущено з найвищої точки кривої гемолізу проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму; а показник С визначають при допомозі формули: C=(tk-tc)·tg φc де tk і tc - час 50% гемолізу проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro, і контрольної проби - відповідно, с; tg φc - тангенс кута з вершиною у серединній точці перпендикуляру, опущеного з найвищої точки кривої контрольного гемолізу, утворений горизонталлю, що проходить через цю точку, і прямою, яка проходить через неї і аналогічну серединну точку на перпендикулярі, який опущено з найвищої точки кривої гемолізу проби крові, взятої в реакцію після ультрафіолетового опромінення її in vitro. Відомий пристрій для ультрафіолетового опромінення крові, який складається з джерела ультрафіолетового випромінювання у вигляді розрядної двохелектродної лампи і кювети, виконаної з прозорого для ультрафіолетових променів матеріалу у вигляді циліндричної трубки [3]. Вплив ультрафіолетових променів на кров у трубці здійснюється в динамічному (проточному) або статичному режимах. Відомий пристрій має недолік, який полягає у недостатній технологічності і пов'язаному з цим недостатнім рівнем стандартизації умов опромінення крові, чим зумовлена недостатня точність результатів дослідження. До недоліків відомого пристрою слід віднести недостатню економічність, оскільки передбачена конструкцією відомого пристрою віддаленість трубчатої кювети з кров'ю і розрядної лампи приводить до значних (понад 70%!) втрат електричної і випромінювальної енергії. В основу винаходу поставлене завдання удосконалити відомий пристрій, у якому шляхом введення в конструкцію рухомого блоку безелектродного ультрафіолетового випромінювача досягають підвищення технологічності, точності і економічності пристрою. Поставлене завдання вирішують тим, що у відомому пристрої, який складається з джерела ультрафіолетового випромінювання і кювети, відповідно до винаходу, джерело ультрафіолетових променів виконано у вигляді безелектродної розрядної трубки, виконаної з прозорого для ультрафіолетових променів кварцового скла, наповненої сумішшю Пеннінга, розряд в якій індукується генератором електромагнітного поля високої частоти, а генератор з вмонтованим джерелом ультрафіолетового випромінювання має елементи фіксації до штати ву з можливістю переміщення по вертикальній вісі, причому джерело має робочу частину, яка при опроміненні крові вводиться всередину кювети. Перелік фігур креслення: фіг. 1 - загальний вигляд пристрою: 2 38074 1 - блок живлення і керування; 2 - вертикальний штатив; 3 - кронштейн; 4 - стопорний гвинт; 5 - генератор; 6 - джерело ультрафіолетових променів. Фіг. 2 - занурення робочої частини джерела всередину кювети з кров'ю при її опроміненні: 7 - опромінювальна кювета з пробою крові. Фіг. 3 - криві реакцій кислотного гемолізу: A) контрольна реакція; Б) реакція після ультрафіолетового опромінення ізольованої проби крові; B) реакція після ультрафіолетового опромінення організму. Конструктивно пристрій складається з блоку 1 живлення і керування, на верхній поверхні корпусу якого встановлено вертикальний штатив 2, до якого за допомогою кронштейна 3 і стопорного гвинта 4 кріпиться генератор 5 з вмонтованим джерелом 6 ультрафіолетових променів. Пристрій працює таким чином. У дослідний розчин крові в скляній кюветі 7 занурюють робочу частин у джерела 6 ультрафіолетових променів, користуючись при цьому елементами фіксації, а саме, послаблюючи стопорний гвинт 4, включають блок 1 живлення і керування, індукуючи ультрафіолетове випромінювання в джерелі 6, і опромінюють вміст кювети протягом відповідного часу, наприклад, 5 хвилин, після чого джерело 6 гасять і обережно виймають з розчину, пересуваючи генератор 5 з елементами фіксації вгору по штативу 2, фіксуючи джерело у верхньому положенні, після чого кювету з розчином крові досліджують відповідно до обраної методики. Спосіб здійснюють таким чином. Для дослідження готують три проби крові. Для цього в пацієнта шляхом проколу пальця з дотриманням правил асептики і антисептики беруть 0,05 мл крові для визначення контрольної реакції кислотного гемолізу, а також для постановки аналогічної реакції крові після її попереднього ультрафіолетового опромінення in vitro. Крім того, область спини пацієнта одночасно опромінюють від джерела ультрафіолетових променів при стандартній дозировці в 1,0 біодозу, витримують інтервал в 15 хвилин, після чого повторно набирають з пальця 0,05 мл крові для проведення реакції кислотного гемолізу на фоні попереднього ультрафіолетового опромінення організму. З першої проби взятої крові готують робочу суміш еритроцитів в розведенні 1:10 шляхом змішування 0,05 мл нативної крові з 0,45 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. Для визначення контрольної реакції кислотного гемолізу у вимірювальну кювету фотоколориметра вносять 0,2 мл робочої суміші еритроцитів і змішують з 1,8 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, кювету вставляють у вимірювальну кювету та вносять стандартний гемолітик - 2,0 мл соляної кислоти на ізотонічному розчині натрію хлориду і реєструють на стрічці самописця реакцію кислотного гемолізу за характером зниження екстинкції інкубаційної суміші. Далі 0,2 мл робочої суміші еритроцитів вносять у кювету, додають 1,8 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, обережно змішують, вводять все редину кювети робочу частину джерела ультрафіолетових променів і опромінюють протягом 5 хвилин, після чого джерело гасять, обережно виймають з розчину у кюветі, додають до нього 2 мл 2·10-3 М соляної кислоти і реєструють реакцію гемолізу опроміненої in vitro проби крові. Реєстрацію гемолізу з пробою крові, взятою у пацієнта після опромінення організму, здійснюють аналогічно постановці контрольної реакції. Для цього до 0,2 мл робочої суміші еритроцитів у співвідношенні 1:10 у вимірювальній кюветі фотоколориметра вносять 1,8 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, вносять 2,0 мл розчину соляної кислоти і реєструють гемоліз. Обчислення результатів здійснюють таким чином. Побудову трьох кривих швидкості гемолізу, а саме, контрольної, після опромінення крові in vitro та після опромінення організму здійснюють у системі координат. По осі абсцис відкладають час з кроком 30 с, а по осі ординат - величину екстинкції кожної з реакцій (фіг. 3). З точки k кривої контрольної реакції, яка відповідає 100% завершенню гемолізу, на вісь абсцис опускають перпендикуляр, через серединну точку якого о k проводять горизонталь MN. Аналогічні перпендикуляри навісь абсцис проводять з точки с кривої гемолізу опроміненої in vitro крові і з точки v - після опромінення організму. Сполучивши серединні точки ос і оv на перпендикулярах з точкою о k, отримують кути φc і φv та знаходять відповідні їм значення tg φc і tg φv. Спочатку визначають показник V резистентності мембран еритроцитів проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, користуючись формулою: V=(t v-t k)·tg φ v де tv і t k - час 50% гемолізу проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, і контрольної проби - відповідно, в секундах. Аналогічно визначають показник С резистентності мембран еритроцитів проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro за допомогою формули: C=(tk-tc)·tg φc де tk і tc - час 50% гемолізу проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro, і контрольної проби - відповідно, в секундах. Користуючись формулою: Ims=(1+V-C)·V2 ·C2 визначають інтегральний індекс Ims мембраностабілізуючої функції. Приклад 1. У дорослої здорової людини шляхом проколу пальця в стерильних умовах взяли 0,05 мл крові для визначення контрольної реакції кислотного гемолізу, а також для постановки аналогічної реакції крові після її попереднього ультрафіолетового опромінення in vitro. Після цього область спини пацієнта одномоментно опромінювали від розрядної лампи типу ДРБ-8 - джерела ультрафіолетових променів з відстані 50 см при експозиції 4 хвилини, що відповідало дозировці в 1,0 біодозу. Через 15 хвилин у пацієнта повторно взяли з пальця 0,05 мл крові для проведення реакції кислотного гемолізу. З першої проби взятої крові приготували робочу суміш еритроцитів в розведенні 1:10 шляхом змішування 0,05 мл нативної крові з 0,45 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. 3 38074 Спочатку провели контрольну реакцію кислотного гемолізу, для чого у вимірювальну кювету фотоколориметра внесли 0,2 мл робочої суміші еритроцитів, змішали її з 1,8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, внесли стандартний гемолітик - 2,0 мл соляної кислоти на ізотонічному розчині натрію хлориду в концентрації 2·10-3 М і реєстрували на стрічці самописця, визначаючи час 100% завершення гемолізу (tk). Далі 0,2 мл робочої суміші еритроцитів внесли у кювету, змішали з 1,8 мл ізотонічного розчину натрію хлориду і опромінювали від джерела ультрафіолетового випромінювання шляхом занурення його робочої частини в розчин проби крові протягом 4 хвилин, що відповідало загальній енергетичній дозі опромінення 300 Дж·м -2, після чого в кювету внесли 2 мл 2·10-3 М соляної кислоти і реєстрували реакцію, визначаючи час 100% гемолізу (tc). Аналогічним чином провели постановку реакції кислотного гемолізу з третьою пробою крові: до 0,2 мл робочої суміші еритроцитів проби крові, взятої у пацієнта після опромінення області спини, внесли послідовно 1,8 мл ізотонічного розчину хлориду натрію, 2,0 мл розчину соляної кислоти, після чого реєстрували гемоліз з визначенням часу 100% його завершення (tv). Отримані результати у вигляді графіків були перенесені на міліметровий папір. З точок k, с і v, які відповідали 100% завершенню реакцій кислотного гемолізу трьох проб крові пацієнта, на вісь абсцис були опущені три відповідні перпендикуляри. Через серединну точку оk провели горизонталь MN, а шляхом сполучення точки ok з точками oc і ov визначили кути φc і φv та відповідні їм значення tg φc i tg φv. Потрібні для обчислення отриманих результатів дані наведені в табл. 1. Таблиця 1 Назва показника tk tc tv tg φv tg φc Користуючись формулою V=(t v-t k)·tg φ v, визначили показник V резистентності мембран еритроцитів проби крові, взятої після стандартизованого ультрафіолетового опромінення організму, який становив: V=(450-300)·0,3443=66,78 За допомогою формули C=(tk-tc)·tg φc знайшли показник С резистентності мембран еритроцитів проби крові після стандартизованого ультрафіолетового опромінення in vitro, який становив у наведеному прикладі: С=(300-180)·0,3443=41,32 На основі отриманих показників V і С за допомогою формули Ims=(1+V-C)·V2 ·C2 визначили інтегральний індекс мембраностабілізуючої функції: Іms=(1+61,78-41,32)·61,78-2·41,32-2=0,504 Високий рівень інформативності запропонованого способу значною мірою визначається достатньо високою точністю і технологічністю пристрою для ультрафіолетового опромінення крові в кюветі, оскільки конструктивною особливістю його є забезпечення сталості умов опромінення. При цьому в те хнологічному процесі обробки крові ультрафіолетовими променями практично використовується до 80% енергії оптичного випромінювання, що забезпечує значно вищий, ніж у прототипу, рівень економічності. Приклад 2. Досліджували мембраностабілізуючу функцію у лабораторних тварин - 12 білих непородних білих щурів, самців, приблизно однакового віку і маси. За допомогою запропонованого способу досліджували мембраностабілізуючу функцію організму тварин в умовах фізіологічної норми і під впливом модельованого цитотоксичного ураження легень. Останнє викликали внутрішньовенним введенням ксеногенної сироватки, а саме, крові великої рогатої худоби у сублетальній дозировці, яка становила для даної серії дослідів 0,8 мл·кг-2. Кров для дослідження мембраностабілізуючої функції у дослідної групи тварин (8 особин) брали через 30 хвилин після інфузії ксеногенної сироватки. Контролем була кров 6 інтактних тварин. Результати дослідження наведені в табл. 2. Значення 300с 180с 450с (24°) 0,4452 (19°) 0,3443 Таблиця 2 Показники Tk Тc Тv Tg φv Tg φc C V Ims Контроль (X±m) Дослід (X±m) ∆% P 366+15 174±12 496±17 0,5436±0,023 0,1288±0,017 24,723±0,792 70,669±0,104 1,12±0,09 269±14 138±14 290±16 0,1914±0,015 0,1584±0,011 20,120±0,816 4,142±0,291 -1,64±0,13 36,0 22,9 41,5 64,3 23,0 18,6 94,0 146,0