Спосіб оцінки бактерицидності бальнеологічних засобів

1 Спосіб оцінки рівня бактерицидності бальнеологічних засобів, що включає контамінацію досліджуваного матеріалу тест-культурою Е соїі заданої концентрації, реєстрацію відмирання тесткультури й оцінку результатів, який відрізняється тим, що досліджуваний засіб контамшують тесткультурою в концентраціях 101-И03 не менш ніж у чотирьох паралельних пробах по кожній сери, інтенсивність відмирання Е соїі визначають за числом позитивних проб, а оцінку рівня бактерицидності здійснюють за формулою " А4,2 п п..-ІдКУО 19 п В •100%, де А = t Винахід відноситься до області курортологи, зокрема, до способу визначення бактерицидності бальнеологічних засобів природних мінеральних вод, та препаратів на їх основі, а також грязьових розчинів екстрактів Оцінка якості природних бальнеологічних і преформованих засобів, отриманих на їх основі, необхідна для ефективного використання цих засобів в натуральному вигляді і після промислового розливу в лікувальному процесі на курортах і в амбулаторних умовах Бактерицидна і бактеріостатична дія власної мікрофлори натуральних бальнеологічних і преформованих засобів, отриманих на їх основі, обумовлені як аутохтонною мікрофлорою чи мікрофлорою субстрату, так і специфічним комплексом органічних речовин бітуми, феноли, гумінові і нафтенові та фульвокислоти тощо Виразність антибактеріальної активності залежить від КІЛЬКІСНОГО І ЯКІСНОГО змісту мікрофлори і продуктів її ЖИТТЄДІЯ ЛЬНОСТІ Необхідність визначення антимікробної дії де В - показник рівня бактерицидності бальнеологічного засобу, %, А-і 2 n - бал, що відбиває КІЛЬКІСТЬ проб з позитивною реакцією і концентрацію тест-культури в одній серії проб, 2 ^1,2 л - сумарний бал, що відбиває КІЛЬКІСТЬ проб з позитивною реакцією у всіх серіях, п х - число проб з позитивною реакцією, п 0 - вихідне число проб у серії, t - термін реєстрації відмирання тест-культури, доба, Ід КУО - показник ступеня концентрації дози тест культури і при значенні показника бактерицидності від 2,5 до 10,0 % засіб оцінюють як слабко-, від 15 до ЗО % - помірно-, від 37,5 до 60 % - значно бактерицидний 2 Спосіб оцінки рівня бактерицидності бальнеологічних засобів за п 1, який відрізняється тим, що реєстрацію загибелі тест-культури здійснюють на 10-ту добу від моменту контамінації досліджуваного засобу природних і преформованих бальнеологічних засобів продиктована також й тим, що застосування засобів з бактерицидним ефектом, статистичне вірогідно знижує число хворих - носіїв патогенних мікроорганізмів [1] Відомий спосіб визначення бактерицидної дії мінеральних вод [2], при якому виживаність різних патогенних мікроорганізмів здійснюється за підрахунком вирослих колоній До недоліків даного способу можна віднести його тривалість, що залежить від терміну відмирання тест-культури і складає в деяких випадках для Eschenchia coll 188 днів Праце-, енерговитрати та використання надлишку живильних середовищ при такій тривалій реєстрації процесу відмирання тест-культури є завеликими Відомий спосіб визначення бактерицидної дії мінеральних вод [3], у якому висновок про бактерицидність води роблять, виходячи з процентного відношення чисельності бактерій, що залишилися, до вихідної КІЛЬКОСТІ Спосіб полягає в тому, що з CO 49311 однодобових агарових тест-культур Е coh чи Staureus готують бактеріальні суспензії визначеної концентрації (за оптичним стандартом мутності), розводять до концентрації 10 визначають у них вихідну КІЛЬКІСТЬ живих бактерій, вносять у випробуваний матеріал Власну антибактеріальну дію мінеральної води вивчають у динаміці через певні терміни її збереження, шляхом обліку КІЛЬКОСТІ життєздатних мікроорганізмів, що залишилися Методика дуже трудомістка, реєстрація відмирання бактерій продовжується до 200 днів, унаслідок масивності дози зараження - 106КУО (колониєутворюючих одиниць) Е сої і, що ускладнює прояв бактерицидної дії Крім того, відсоток відмирання колонієутворюючих одиниць, з контамшованої тест-культурою проби мінеральної води, визначали після додаткового готування падаючих 10кратних розведень для подальшого висіву в диференційно-діагностичне середовище Одержані результати представляли в % до КІЛЬКОСТІ, внесених у мінеральну воду бактерій, без врахування термінів тривалості експерименту і дози зараження Таким чином, КІЛЬКІСНИЙ результат, одержаний при використанні даного способу, не дозволяє проводити порівняльну оцінку бактерицидної дії природних бальнеологічних засобів з-поміж собою, наприклад, різних генетичних типів, преформованих бальнеологічних засобів В основу винаходу поставлена задача удосконалити спосіб визначення бактерицидності різних бальнеологічних природних рідких засобів, а також преформованих засобів на їхній основі, шляхом розробки ЯКІСНО-КІЛЬКІСНОЇ оцінки на визначений фіксований день проведеного дослідження, що дасть можливість значно скоротити термін дослідження, працевтрати та витрачання електроенергії й інших матеріальних ресурсів, а також уніфікувати спосіб визначення бактерицидності різних бальнеологічних засобів Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі оцінки бактерицидності бальнеологічних засобів, що включає контамінацію досліджуваного матеріалу тест-культурою Е coh заданої концентрації, реєстрацію змін та оцінку результатів, здійснюють контамінацію Е coh в концентраціях 101 - 103 не менш, ніж у чотирьох паралельних пробах по кожній концентраційній серії Відмирання тест-культури реєструють на 10-ту добу (від моменту контамінації досліджуваного засобу) Для цього підраховують число позитивних проб у кожній концентраційній серії, а оцінку рівня бактерицидності здійснюють за формулою в= 1 '2п,деА=П*-|дКУО-100%, t по В - показник рівня бактерицидності бальнеологічного засобу, %, А1,2 п - бал, що відбиває КІЛЬКІСТЬ проб з позитивною реакцією і показник концентрації тесткультури, в одній сери проб, ІА1.2 п - сумарний бал, що відбиває КІЛЬКІСТЬ проб з позитивною реакцією по всіх серіях, пх - число проб з позитивною реакцією, по - вихідне число проб у сери, t-термін реєстрації відмирання тест-культури, доба ІдКУО - показник ступеня концентрації контамінуючої дози тест-культури При набуванні показником бактерицидності (В) значення від 2,5 до 10,0% засіб оцінюють як слабко-, від 15 до 30% - помірно-, від 37,5 до 60% значно бактерицидне Загальна схема реалізації способу полягає в наступному Використовують тест-культуру кишкової палички Е coh, штам 846 Наготовлюють 3 різні концентрації суспензій тест-культури на досліджуваному бальнеологічному засобі 101, 102, ЮЗКУО/смЗ (4 проби в кожній серії), всього 12 проб (Табл 1) У подальшому, застосовуючи диференційно-діагностичне живильне середовище, за кольором забарвлення, реєструють відмирання тест-культури у кожнім варіанті на 10-ту добу Оцінюють КІЛЬКІСТЬ позитивних реакцій по кожній концентрації і записують результат у таблицю (графа 2) У кожному рядку таблиці (1 - 3) обчислюють % позитивних проб до 4-х вихідних проб Результат, отриманий у 3-й графі, множать на ваговий коефіцієнт, за який приймають ступінь концентрації контамшуючої дози тест-культури (чи ІдКУО) Результат вносять у 4-ту графу Чим вище показник ступеню концентрації тест-культури, тим вищий ваговий коефіцієнт (ранг) привласнюється пробі з позитивною реакцією Добуток чисел 4-і і 5-і граф записують як бал, що привласнюється кожної сери, в 6-ту графу Підсумок у вигляді суми балів по всіх трьох серіях вносять до 7-і графи Восьма графа показник бактерицидності, який є результатом відношення сумарного балу до дня реєстрації відмирання тест-культури (нами емпірично встановлений 10-й день) або за формулою в= І>1,2 л t де £А1,2 п сумарний бал по серіях, a t=10 діб Таблиця 1 Спосіб розрахунку показника бактерицидності бальнеологічних засобів №№ серій 1 1 2 3 Конц-я тесткультури КУС/смЗ 2 101 102 103 Пробірки з позитивною Бал (з ІдКУО Е coh урахує р-цією (ваг коеф) вагового КІЛЬКІСТЬ % коеф-та) 3 4 5 6 + +++ 100 1 100 + — 25 2 50 0 3 0 Сумарний бал по серіях Показник бактерицидності на 10 добу В 7 8 150 15 49311 Методика готування і зараження досліджуваного матеріалу В флакони з випробуваним засобом вносять бактеріальну суспензію тест-культури Eschenchia coll, штам 846, з такими концентраціями, які дозволяють просто одержати розведення культури 101,102, ЮЗКОЕ/смЗ, по чотирьох паралелях в кожній Інкубацію тест-культури здійснюють при кімнатній температурі протягом 10 діб від моменту контамінації Для реєстрації загибелі тест-культури по 1,0мл випробуваного засобу вносять у пробірку з напіврідким середовищем, що містить лактозу й індикатор бромтимоловий синій Висіви досліджуваних бальнеологічних засобів, контамшованих тест-культурою кишкової палички на напіврідке середовище з лактозою [4], здійснюють на 10-ту добу після зараження Посіви на середовище з лактозою витримують у термостаті при температурі 37±0,5°С протягом 4 - 5 годин Відсутність газоутворення в пересіваннях і незмінений колір середовища свідчать про відсутність росту тест-культури кишкової палички Таку пробу вважають позитивною Пожовтіння середовища і газоутворення в ньому, навпаки, підтверджують наявність життєздатноїкишкової палички Усі МОЖЛИВІ КІЛЬКІСНІ показники рівня бактери цидності досліджуваних бальнеологічних засобів, що досягаються застосуванням пропонованого способу, наведені втабл 2 Таблиця 2 Спосіб розрахунку показника бактеріцидності бальнеологічних засобів Конц-я тесткультури КУО/ см 1 10 і 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ю 23 10 і 10 1032 10 102і ю3 10 102і ю3 10 10і 1 °з 10гі 10 ю3і 102 ю3 10і 102 ю3 10і 102 ю3 10і 102 ю3 10 102і ю 103і 10а 103 10 Пробірки з позитивною р-циєю Бал Ваговий коеф. (з врахує (Ід КУО ЕхоГі) вагового коеф-та) % 2 5 0 0 7 5 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 2 5 0 1 0 0 5 0 0 1 0 0 7 5 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2 5 1 0 0 1 0 0 : і:: 1 5 0 0 0 1 0 0 7 5 :::: 1 0 0 1 0 0 1 0 0 Кількість : : : : : : : : : : : : * . : : ; + + • — : : : : ; : : : oog №№ варіантів 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 25 0 0 50 0 0 75 0 0 100 0 0 100 50 0 100 100 0 100 150 0 100 200 0 100 200 75 100 200 150 100 200 225 100 200 300 Показник бакгері Сумарний бал ЦИДНОСТІ на 25 2,5 50 5 75 7,5 100 10 150 15 200 20 250 25 300 30 375 37,5 450 45 525 52,5 600 60 10 добу, В 8 49311 Заражуюча доза Е соїі не може бути менше 101КУО/смЗ через складність реєстрації и відмирання, тому, що клітини можуть розподілятися в об'ємі досліджуваного засобу нерівномірно і не потрапляти в об'єм проби, яку висівають на диференційно-діагностичне середовище (напіврідке лактозо-пептонне середовище (ЛПС) Заражуюча доза більш ніж 103 (ЮООКУО/смЗ) недоцільна через значне перевищення допустимого ДОСТом колі-індексу для питної води (ЗКУО/дмЗ) більш, як у 300 тисяч разів Таке значне перевищення колііндексу, про що свідчить наш багаторічний практичний досвід, у різних бальнеологічних засобах не відзначалося Приклади конкретного виконання способу наведені втабл З Приклад 1 В експерименті з вивчення бактерицидної дії використовували слабкомшералізовану воду з підвищеним вмістом органічних речовин зі свердловини №1 с Верхнє Синєвидне Львівської області Тест-культуру Eschenchia col і, штам 846, вирощували протягом доби на рибо-пептонному агарі при температурі 37°С±0,5°С 3 добової агарової тест-культури, через емульгування у фізіологічному розчині, готували бактеріальну суспензію з концентрацією Е сої і, що дорівнювала 109КУО/смЗ за оптичним стандартом, який отримували з ТИСК їм Тарасовича" (Москва) Розведенням у фізіологічному розчині и доводили до необхідних концентрацій 103, 104, 105КУО/смЗ і вводили по 0,2смЗ у флакони, попередньо маркіровані ВІДПОВІДНО ДО дози, що містили по 19,8смЗ досліджуваної води Кінцева концентрація Е соїі склала ВІДПОВІДНО 101, 102, ЮЗКУО/смЗ Інкубацію тест-культури здійснювали за кімнатної температури протягом 10 діб від моменту контамінації Для реєстрації загибелі тест-культури по 1,0смЗ води свердловини №1 з кожного флакона вносили в пробірки з напіврідким середовищем ЛПС з індикатором бромтимоловим синім Посіви витримували в термостаті при температурі 37°±0,5°С протягом 5 годин Після 10-добового культивування в термостаті, колір середовища залишався незміненим і було відсутнє газоутворення у всіх 3-х концентраціях тест-культури, тобто, у 12 пробірках, що дозволило такий результат вважати позитивним Результат записали в таблицю 3 (графа 4) Обчислили відсоток отриманих позитивних результатів по кожній концентрації тест-культури до вихідного числа паралельних проб Отриманий результат, записали у 5-й графі як 100%, його помножили на ваговий коефіцієнт, ВІДПОВІДНО логарифму концентрації заражуючої дози Е соїі (серії 1, 2, 3) Бал з урахуванням вагового коефіцієнта склав по кожній концентрації тест-культури, ВІДПОВІДНО 100, 200 і 300 (графа 8) Сумарний бал дорівнював 600 (графа 8) Визначили показник бактерицидності за формулою В= SA 1 i 2 л t де ІА1.2 п дорівнює 600, а 1=10 діб В=60% Такий результат дозволяє вважати цю воду значно бактерицидною Аналогічно прикладу 1 розраховували показник бактерицидності для мінеральних вод і преформованих бальнеологічних засобів, наведених у табл 3 природна столова вода (№3), лікувальностолові води - №4, №5 Преформовані засоби омагнічена слабко мінералізована лікувальностолова вода з підвищеним вмістом органічних речовин пгтСатанов Львівської обл , свердловина 1650 (№7) і пелобішофіт за патентом України №40233 (№8) Контролем були - автоклавована вода с Верхнє Синєвидне, свердловина 1 (№2) і мінеральна лікувально-столова вода санаторію Шкло (№6) Порівняння здобутого технічного результату у способі, що заявляється супроти прототипу, показує, що пропонований спосіб дозволяє - спростити й уніфікувати спосіб визначення бактерицидності різних бальнеологічних природних рідких засобів (лікувально-столових і лікувальних мінеральних вод), а також преформованих продуктів, одержаних на їхній основі, - значно зменшити фінансові витрати, - скоротити терміни дослідження в 15 - 20 разів, - розробити критерій визначення рівня бактерицидності, що розширює арсенал обов'язкових визначень компонентів ХІМІЧНОГО І мікробіологічного складу природних і преформованих бальнеологічних засобів 9 49311 10 Таблиця З Конкретні приклади розрахунків показника бактеріцидності бальнеологічних засобів Приклади Пробірки з позитивною реакцією Конц-я тесткультури КУО/см3 Кількість % Ваговий коеф (їдКУО Е.СОІІ) Бал (з врахує. вагового коеф-та) Сумар ний бал Показник бактеріцидності на 10 добу. В •і 1 2 3 4 5 Львівська обл., Верхнє Синєвид. свердл.№1 Та ж вода (автоклавована) Природна столова вода Помярка, сверд. №122, Трускавецьке родовище Хмельн.обп, с.Маків, вода свердл.№ 2 Мінер, лікувальностол. вода санатор. Шюіо {бювет) я D Та ж вода (автоклавована) 7 Вода свердл №1650 Збручанського родовища, Хмельницької nfin 10 і 2 ю 3 10і 10 2 10 3 101 10 2 + + + + 100 1 100 + + + + 100 2 200 + + + + 100 3 300 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 1 0 _ 0 2 0 — — — — 0 3 0 50 1 50 0 2 0 0 3 0 _ _ _ _ _ 10 3 10 10' а 10 3 10 і 10 + + + + 100 1 + + + + 100 2 0 3 0 0 1 2 0 3 0 + 100 1 ПелобІшофіт 0 50 5 300 ЗО 0 0 600 60 600 60 100 ю 3 101 10 _ _ _ + + ю2 3 10і 10 + + + 2 + + + + 100 2 200 10 10' ю2 3 + + + + • 100 3 300 + + + + 100 1 100 + 100 2 200 і 8 0 0 „ 0 0 0 0 200 — — —— 60 100 2 600 + + + + 100 3 300 ю 10 + + + Література 1 Дагилис П Ю , Дзекунскене Н А К вопросу действия минеральных вод на носительство патогенных стафилококков//Вопросы курортологии и физиотерапии Матер науч практ конф физиотерапевтов и курортологов Лит ССР - Вильнюс, 1983 - С 403 - 407 2 Гаранина О П Выживаемость патогенных комменсальных микробов в минеральной воде курортов «оз Шира» и «оз Учум» // Автореф канд дис мед наук, Томск -1972 -22с 3 Феодосиади Н И Микрофлора, бактериостатическое и бактерицидное действие термальных вод Зауралья//Автореф канд дис мед наук, Свердловск -1970 - 20с 4 ГОСТ 18963-73 Вода питьевая Методы санитарно-бактериологического анализа 11 49311 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71 12