Спосіб захисту організму від дії стресорних впливів

Спосіб профілаїсгики та лікування стресів шляхом введення вітаміну Е-активного препарату, який відрізняється тим, що як вітамш-Е активного препарату вводять а -ТФА - С-6 2-(4'-метил-3' пентеніл)-6-ацетокси-2,5,7,8-тетраметилхроману формули Винахід відноситься до медицини, може бути використаний як адаптоген для профілактики та лікування стресових станів шляхом введення похідного вітаміну Е з вкороченим до шести вуглецевих атомів бічним ланцюгом (а-ТФА-С-6), що є його метаболітом у організмі і виявляє більш виражену активність порівняно з вітаміном Е ( а ТФА) Стрес, або загальний адаптаційний синдром єдиний стереотипний механізм реакції живої системи на впливи різних, не залежно від природи, екстремальних факторів Доведено, що стресреакція є важливим компонентом механізму виникнення і розвитку найбільш розповсюджених захворювань людини - атеросклерозу, ішемічної хвороби серця, інфаркту міокарда, гіпертонічної хвороби, аритмій серця, онкологічних, гематологічних патолопй та інших, що супроводжуються порушенням процесів вільно радикального пере тання недостатнє, емпіричне і до кінця не обґрунтоване Стресові ситуації та патологічні процеси як їх наслідок стають дедалі частішими, але методи боротьби з ними остаточно не розроблені і саме це потребує пошуку нових високоефективних способів захисту організму від різноманітних небажаних впливів За прототип винаходу, як найбільш близький за технічною суттю вибрано використання а-ТФА при пперхолестеринозі (5) Недоліком цього методу є той факт, що а ТФА при даній стресовій ситуації використовується лише у великих дозах (від 15 мг на кг маси тіла) і досить довгостроково (до трьох МІСЯЦІВ) (3) Окрім того нині а -ТФА на Україні не синтезується, а той, що використовується, випускається з імпортної сировини і має високу вартість, що економічно не кисного окислення ЛІПІДІВ та ГІПОКСІЄЮ Використання при різноманітних стресорних ситуаціях а-ТФА, пов'язано з тим, що при стресах порушуються процеси ліпопероксидацм та тканинного енергетичного обміну, а саме а-ТФА ефективно регулює вищевказані порушення (1) Про позитивний вплив а -ТФА при гіпоксії, ішемії, штоксикаціях, холестеринозі та інших стресорних факторах відомо (2-4), але його викорис СНз ;нз в дозі 5-50 мг на кг маси тіла ВИГІДНО У порівнянні з прототипом пропонується використання нового похідного а-ТФА, з вкороченим до шести вуглецевих атомів бічним ланцюгом а-ТФА С-6-, який є його активним метаболітом у організмі, і відрізняється тим, що виявляє вищу захисну дію при таких стресорних станах як ГІПОКСІЯ, гіповітаміноз, інтоксикація і холестериноз Вказана сполука значно активніша порівняно з а-ТФА при інгібуванні надмірно активованих процесів перекисного окислення ЛІПІДІВ та регуляції енергетичного О ю 59010 обміну, порушення функціонування яких є універсальним механізмом виникнення патолопй, що пов'язані з стресорним впливом Це неминуча реакція живої системи, яка не залежить від природи, що викликала стрес Вона супроводжує не тільки вищевказані патологи, а й багато інших (радіаційне опромінення, емоційний, больовий стрес та ІНШІ) В основу винаходу поставлена задача розробити ефективний спосіб захисту організму від різноманітних стресових впливів Поставлене завдання вирішується за рахунок введення олійного розчину не використовуваного раніше при стресових станах біологічно активного похідного а-ТФА з вкороченим до шести вуглецевих атомів бічним ланцюгом- а-ТФА-С-6 2-(4'-метил-3'-пентеніл)-6ацетоксі-2,5,7,8-тетраметилхромана, формули СНз СНзСО Винахід ілюструється прикладами впливу запропонованого препарату на різноманітні пору шення, що викликані стресовими факторами різної етіології, не залежно від природи агента, що його викликає, а також можливості корекції змін, які виникли, шляхом введення запропонованого похідного вітаміну Е Приклад 1 Досліди виконані на білих безпородних щурах віком 28-30 тижнів, що утримувались на стандартному раціоні віварію в умовах ппоксичного стресу, який викликали "підйомом" тварин у барокамері на умовну висоту 11тис м (93,ЗЗгПА, 170мм рт ст), зі швидкістю 37,5м /сек Тварини знаходились у барокамері протягом 20 хв , або при визначенні строків виживання до їх смерті Гіпоксичний стрес призводить до інтенсифікації процесів вільно радикального окислення ЛІПІДІВ, інгібування процесів тканинного дихання та утворення АТФ, що негативно впливає на всі види обміну і веде до цілого ряду ускладнень (6) а-ТФА та а-ТФА-С-6 вводили щурам з розрахунку 20мг на кг маси тіла внутрішньовенне за З години до ппоксичного стресу Досліджували виживання тварин в умовах ппоксичного стресу Результати продемонстровані в табл 1-2 Таблиця 1 Виживання тварин (в хв ) при гіпоксичному стресі та після введення внутрішньом'язево а -ТФА та а -ТФА-С-6, 20 мг/кг маси тварин, (М±т, п=37-56) Гіпоксичний стрес (контроль) Після введення а-ТФА 25,1±0,7 33,0*±0,9 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) а -ТФА-С-6 35,4*±0,8 Таблиця 2 Виживання тварин (в хв ) при гіпоксичному стресі та після введення внутрішньовенне а -ТФА а -ТФА-С-6, 20 мг/кг маси тварин (М±т, п=37-56) Гіпоксичний стрес (контроль) Після введення а-ТФА 24,0±1,25 35,5*±0,81 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) Як видно з представленого матеріалу, запропоноване похідне а -ТФА подовжує виживання тварин в умовах ппоксичного стресу при обох способах його введення Препарат, що заявляється, проявляє виражену біологічну активність, що перевершує активність а -ТФА фармакопейного і може бути використаним для попередження та профілактики ппоксичного стресу Приклад 2 Ішемія міокарду, ГІПОКСІЯ та інтоксикація організму є ведучими факторами в КЛІНІЧНИХ проявах стресових ситуацій різноманітного генезу У зв'язку з цим використовували комбіновану модель, що дає ураження міокарду у вигляді тканинної гіпоксії і ішемії після токсичного дії адреналіну з додатковим ГІПОКСИЧНИМ ВПЛИВОМ а -ТФА-С-6 38,8*±0,86 Адреналінове ішемічне ураження міокарду, викликали у щурів-самців вагою 160-180г, що утримувались на раціоні віварію шляхом внутрішньом'язевого введення 0,4мл 0,1% розчину адреналіну пдрохлориду на фізіологічному розчині Це призводить до циркуляторно-тканинної гіпоксії, порушення біоенергетики, кровообігу та ішемії міокарду У тварин з ішемією (для посилення стресового впливу) через 24 години після введення адреналіну, у період максимальних морфологічних порушень в міокарді (7), викликали додатково гіпоксичний стрес, як описано у прикладі 1 а-ТФА та а-ТФА-С-6 вводили внутрішньом'язево в дозі 50мг на кг маси тварин через три години після введення адреналіну одно 59010 разово, або 1 раз на день щодоби За тваринами спостерігали і після набору "висоти" 11тис м реєстрували їх виживання у хв Результати представлені втабл З Таблиця З Показник виживання щурів (в хв) з експериментальною ішемією міокарду в умовах додаткової гострої гіпоксії та після внутрішньом'язевого введення їм протягом 5 діб а-ТФАта а-ТФА-С-6 (М±т, п=10-13) Ішемія міокарду та ппоксичний стрес Після введення (контроль) а-ТФА 9,9±1,8 25,9*±4,6 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) Як видно з табл похідне а -ТФА значно підвищувало виживання тварин в умовах ішемії та ппоксичного стресу, його дія перевершує вплив на досліджуваний показник фармакопейного а-ТФА У зв'язку з цим препарат може бути адаптогеном в умовах комбінованих стресорних впливів Приклад З У зв'язку з тим, що останнім часом не тільки в Україні та країнах СНД, а й у провідних високо розвинутих країнах спостерігається багато випадків гіповітамінозів, які можна віднести до групи харчових стресорних факторів (8), і оскільки запропонований нами антистресовий препарат відноситься до метаболітів а -ТФА (9), в якості моделі харчового стресу використовували тварин з вітамін Е-пповітамінозом, який викликали утриманням білих щурів вагою 70-80 г на раціоні, збідненому за а-ТФА за методикою Едвіна (10) протягом двох МІСЯЦІВ Е-пповітаміноз характеризується підсиленням процесів перекисного окис а -ТФА-С-6 27,5*±3,9 лення ЛІПІДІВ, зниженням вмісту убіхінона в тканинах та зменшенням активності ферментів ланцюгу транспорту електронів, де він являється кофактором, а саме сукцинат- та НАДН-убіхінон-редуктаз (11, 12) Ефективність запропонованого похідного а -ТФА вивчалася в умовах in vitro на мітохондріях та тканині печінки щурів після відтворення у щурів Е-недостатньої стресової ситуації а -ТФА та досліджуваний препарат вводили безпосередньо в інкубаційне середовище у двох дозах - 5 та 25 мкг на мл середовища Після інкубації мітохондрій та гомогенатів печінки протягом ЗО та 120хв, ВІДПОВІДНО, в пробах визначали швидкість утворення малонового диальдепду (МДА) (13), за яким оцінювали інтенсивність процесів перекисеутворення, які неодмінно супроводжують стресові ситуації і можуть бути критерієм їх вираженості Дані представлені втабл 4 Таблиця 4 Інгібування а -ТФА і його похідним в дозі 25 мкг/мл середовища швидкості утворення МДА в мітохондріяхта гомогенаті печінки в умовах in vitro (M±m, n=10-12) Е-пповітаміноз (контроль) Після введення а-ТФА а Гомогенат 76,1±1,91 15 25*±0,65 Мітохондрм 140,86±8,66 98, 61*±14,24 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) Як показали дослідження а-ТФА-С-6, що пропонується, інгібує процеси перекисеутворення в гомогенатах печінки та мітохондріях значно активніше, ніж препарат порівняння - а -ТФА Приклад 4 На вітамін Е - недостатніх щурах досліджувався вплив похідного а-ТФА з вкороченим бічним ланцюгом в умовах in vivo Тварин утримували аналогічно як і у прикладі 3 а -ТФА та а -ТФА-С-6 -ТФА-С-6 5, 4*7±0,34 18 54*±0,22 вводили внутрішньовенне за три години до забою одноразово у КІЛЬКОСТІ 5 мг на кг маси тіла тварин Досліджували вміст ЛІПІДІВ, вітаміну Е та убіхінонукофактора ланцюгу транспорту електронів (табл 5), та активність деяких оксидоредуктазних ферментних систем мітохондрій печінки (табл 6) (11, 12) 59010 Таблиця 5 Вміст ЛІПІДНИХ компонентів в печінці щурів з Е-недостатнім стресом та після введення їм а -ТФА та аТФА-С-6 (М±т, п=7-10) Групи тварин Досліджувані показники Вітамін Е, мкг/мг білка ЛІПІДИ, МГ/Г Контроль 49,18±0,78 0,47±0,02 Давали вітамін Е 54,61 *±2,27 0,52±0,04 Давали похідне вітаміну Е 68,60*±3,51 0,70*±0,03 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) Як видно з табл 5, введення похідного вітаміну Е призводить до підвищення вмісту загальних ЛІПІДІВ, убіхінона і вітамша Е в печінці щурів з Е-недостатнім стресом значно активніше, ніж при введенні їм а -ТФА Результати експерименту, що представлені в табл 6, свідчать про більш значну активацію ро Убіхінон, мкг/мг білка 0,93±0,03 1,52*±0,09 1,66*±0,12 боти ферментів ланцюгу транспорту електронів сукцинат - та НАДН-убіхінон-редуктаз, запропонованим похідним вітаміну Е з вкороченим бічним ланцюгом порівняно з вітаміном Е Таблиця 6 Вплив а-ТФАта його активного метаболіту а -ТФА -С-6 на активність ферментів ланцюгу транспорту електронів в мітохондріях печінки тварин з Е-пповітамінозом (препарати вводили per os no 5 мг/кг маси), (М±т, п=10-12) Ферментативна активність Інтактні тварини (конПісля введення (мкМ/мг білка за хв ) троль) а-ТФА а -ТФА-С-6 NADH-депдрогеназна 2901±162 3229*±80 3437*±202 NADH-убіхшон-редуктазна 0,59±0,03 0,61 ±0,03 0,85*±0,06 Сукцинат-убіхінон-редуктазна 23,38±0,9 26,80*±0,99 32,51*±1,23 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) Зростання КІЛЬКОСТІ ЛІПІДІВ, вітаміну Е і убіхінону, а також активності досліджуваних ферментів ланцюгу транспорту електронів після введення тваринам похідного а-ТФА (табл 5, 6) свідчить про нормалізацію процесів метаболізму, що пов'язані з перекисним окисленням ЛІПІДІВ (ПОЛ) і тканинним енергетичним диханням та активацію адаптаційних сил організму в період стресу, вірогідно як за рахунок гальмування препаратом процесів ПОЛ, так і підвищення біосинтезу убіхінону та процесів тканинного дихання Приклад 5 Враховуючи широку розповсюдженість серцево-судинних захворювань і той факт, що саме стрес - індуковане підсилення вільнорадикальних процесів окислення відіграє провідну роль у їх виникненні і прогресуванні, було доцільним вивчити вплив аналога а -ТФА на структурнофункціональний стан кардюмюцитів тварин з експериментальною пперхолестеринемією В раціон безпородних кролів додавали холестерин в дозі 0,5г на 1кг ваги тіла щоденно протягом 2-х МІСЯЦІВ (14) Тварин ділили на 3 групи по 18 в кожній інтактні тварини (контроль) і тварини, що отримували холестерин (пперхолестеринемічний стрес), і таку ж КІЛЬКІСТЬ холестерину з додатковим введенням олійного розчину похідного а-ТФА через ЗО днів після початку пперхолестеринового стресу перорально із розрахунку 5мг на 1 кг ваги тіла тварини щоденно За даними літератури відомо, що застосування а -ТФА при холестеринозі приводить через півтора МІСЯЦІ до достовірного зменшення рівня МДАта дієнових кон'югатів (ДК) порівняно з холестеринозом, що автори пов'язують з впливом токоферолу на глутатюнредуктазну активність (ГР) (5) Проте рівні МДА і ДК залишаються ВІДПОВІДНО на 34% і 10% вищими за контрольні величини Саме тому через 24 години після останнього патологічного впливу визначали вміст продуктів ПОЛ - ДК і МДА, які характеризують загальний стан процесів ПОЛ, інтенсивність індукованої хемілюмінесценції (ІХЛ), що відображає стан процесів вільнорадикального окислення ЛІПІДІВ Крім того визначали співвідношення холестерину до фосфоліпідів (Хс/Фл) для оцінки ЛІПІДНОГО складу мембран та ступеню пперхолестеринемм, глутатіонредуктазну активність з метою виявлення змін у функціонуванні ферментативної ланки антиоксидантного захисту організму та функціонуванні життєво важливого для кардюмюцитів іонного насосу - Na+, К+АТФ-ази (15, 13, 16, 17, 18, 19) Дані досліджень наведені в табл 6 9 Результати досліджень свідчать про те, що в результаті введення запропонованого аналога вітаміну Е з лікувально-профілаїсгичною метою в добовій дозі 5мг/кг ваги тіла 1 раз на добу протя 59010 10 гом ЗО діб спостерігається достовірне зменшення величини співвідношення Хс/Фл, що може свідчити про нормалізацію ліпідної фази мембран кардюмюцитів Таблиця 7 Захисна дія а -ТФА та а -ТФА -С-6 при холестериновому стресі (М±т, п=6) Показники, що досліджуються Умови експерименту Контроль (інтактні Вводили холесте- Вводили холестерин тварини) рин та а-ТФА-С-6 Хс/Фл 1,25±0,12 2,27*±0,21 1,42±0,14 ДК, Егзг/мг білка 36,6±2,9 59,5*±5,8 43,6*±5,6 МДА, мкмоль/мг білка 0,47±0,05 0,83*±0,11 0,50±0,07 ІХЛ, імп/хв 279,2±41,4 1117,5*±132,3 610,2*±134,8 ГР, Ез4о/мг білка за хв 5,17±0,34 3,25*±0,42 4,14*±0,48 Na+, К+АТФаза, мкмоль Фн /мг білка за год 9,4±0,4 6,3*±0,5 8,4*±0,4 Примітки * - різниця достовірна порівняно з контролем (р < 0,05 ) При цьому спостерігається помітне зниження інтенсивності процесів ПОЛ у фракції плазматичних мембран міокарда кролів - рівень МДА досягає такого у інтактних тварин в контролі, а вміст ДК залишається підвищеним всього лише на 19% порівняно з контрольними величинами Інтенсивність ІХЛ достовірно зменшується порівняно з експериментальною пперхолестеринемією Зміни В ЛІПІДНІЙ структурі мембран при дії похідного вітаміну Е супроводжуються збереженням рівня Na+, К+АТФ-азноі і ГР активностей, величини яких наближаються до таких у інтактних тварин Таким чином, порівняння отриманих результатів з прототипом (5) свідчить про більш виражені антиоксидантні властивості запропонованого похідного вітаміну Е порівняно з а-ТФА, що проявляється у більш значному гальмуванні процесів ПОЛ, підвищенні активності глутатюнредуктази Приведені у прикладах 1-5 експериментальні дані підтверджують переваги препарату, що заявляється, порівняно з а-ТФА фармакопейним у здатності підвищувати адаптивні реакції організму як стосовно підвищення виживання, так і стосовно нормалізації метаболічних зрушень, що виникають під впливом стресових навантажень Одержані принципові дані по перевагам цільового продукту в усі строки спостережень і в усіх використовуваних нами дозах (від 5 до 50мг на кг маси тварин) Запропонований спосіб захисту організму від дії стресових факторів за допомогою введення активного метаболіту а-ТФА забезпечує подовження життя та виживання тварин в стресових умовах, нормалізує ліпідну структуру мембран та функціонування життєво важливого для міокарду іонного насосу Na+, К+АТФ-ази ефективно нормалізує процеси вільно радикального окислення, забезпечує збереження активності ферментів антиоксидантної системи захисту організму (ГР), та тканинного енергетичного обміну (активність НАДН-депдрогенази, НАДН-убіхінон-редуктази та сукцинат-убіхінон-редуктази), що може свідчити про значну антиоксидантну властивість та досить високу антистресову та адаптогенну дію препарату В результаті проведених досліджень встановлено, що при впливі таких стрес-факторів, як ппоксична ГІПОКСІЯ, комбінований вплив токсичної дії адреналіну, що виражається в основному у виникненні ішемії міокарду, з додатковим комбінованим впливом ппоксичного стресу, Е-пповітамінозу та навантаження холестерином спостерігаються одно направлені зміни - розвиток оксидативного стресу Запропоноване похідне а-ТФА значно знижує негативний вплив дії усіх досліджуваних стресових факторів За сумою функціональних показників, що досліджувались, препарат, що заявляється, має суттєві переваги перед його прототипом - а ТФА Крім того, спосіб відрізняється простотою застосування і невеликими дозами препарату (550мг/кг ваги тіла ), який приймають один раз на добу перорально одноразово, або протягом ЗО діб в залежності від виду стресу та терміну дії стресового фактора з метою підвищення резистентності організму до різноманітних стресових впливів Після проведення КЛІНІЧНИХ випробувань запропонованого препарату він може бути використаним в медицині та експериментальній біологи як антистресовий препарат Література 1 Донченко Г В Биохимия убихинона (Q)-К Наукова думка,1988 -240 с 2 Шилов П И , Яковлев Т Н Основы клинической витаминологии -Л Медицина, 1974 3 Заявка WO 01/13 901, РСТ, МКИ А 61К 31/00, заявл 18022000, публ 0103 01 4 Патент № 200800, РФ, МКИ 5А61К 31/00, заявл 02 07 91, публ 15 09 95 5 Деримедвщь Л В // Фармацевтичний журнал -2000 -№2 -С 69-72 6 Гацура В В //"Фармакол и токсикол ", 1978, 5, 517-529 7 Непомнящих Л Н , Курбатов В С , Фуксман В И и др // В кн "Метаболизм и структура сердца в норме и патологии" Ред Непомнящих Л Н Изво АН СССР, Новосибирск // 12 11 59010 8 Терехин С П , Муравлева Л Е, Боденова склеротических средств Метод рекомендации Т Г //Вопросы питания -2001 -Т 70, № 4-С 13-16 М , 1988-16с 9 Куница Н И , Кузьменко И В , Алексеев С М 15 Стальная И Д //Современные методы в и др //Биохимия- 1993-Т 58, вып 11 -С 1709биохимии// Под ред ВН Ореховича 1713 М Медицина, 1977-С 63-64 10 Edwin Е Е , Diplock А Т , Bunyan J , Green 16 Владамиров Ю А , Шерстнев МП ХемиJ // Biochem J -1961 -V 79 -P 91 -105 люминесценция клеток животных //Под ред М П Мерзляк- Итоги науки и техники, серия Биофизи11 Ziegler D , Doeg К A //Methods in Enzymolка-Т 24-М ВИНИТИ,1986-176с ogy-1967-V10-P231-235 12 Тарасова Н В , Иванова Г И , Гололобов 17 Folch J M, Lees G H, Sloane-Stanley A А Д // Микробиология-1976-Т 45, № 3-С 400/J Biol Chem -1957 -У 226, № 1 -Р 497-509 405 18 Крутикова Г О , Штугман ИМ // Укрбиохим журн-1976-Т48, № 2 - С 223-228 1913 Стальная И Д, Гаришвили ТГ Даниленко М П , Ким Э А , Омарова Р Д //Вопросы //Современные методы в биохимии// Под ред В Н мед химии -1983 - Т 29, № 1 -с 29-33 Ореховича-М Медицина, 1977-С 66-68 14 Климов А Н , Рыженков BE Экспериментальное изучение гиполипидемических и анти Комп'ютерна верстка М Мацело Підписано до друку 05 09 2003 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна