Спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій

1 Спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій, що полягає у ПОСІВІ мікроорганізмів на живильне середовище, вирощуванні при температурі культивування збудника та здобуванні токсичних продуктів, який відрізняється тим, що патогенну культуру бактерій засівають на щільне живильне середовище, наприклад агар, а токсичні субстанції здобувають із середовища протягом 20-24 годин дифузією крізь нижню поверхню агарової пластинки в поглинаючий розчин 2 Спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій за п 1, який відрізняється тим, що ділянку агару з ізольованою колонією бактерій кладуть усередину пеніцилінового флакона та зістиковують його з верхнім кінцем покривного скла, заглибленого в поглинаючий розчин, об'ємом 1,0-1,5 см 3 , при цьому флакон ставлять на опору під гострим кутом 3 Спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій за п 1, який відрізняється тим, що ділянку агару з культурою бактерій, зрощеною газоном, відокремлюють на відстані не менше 1,0 см від кінцевої зони росту мікроорганізмів, перекладають у чашку Петрі на опорні елементи та заповнюють об'єм між елементами поглинаючим розчином до зіткнення його з нижньою поверхнею агару 4 Спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій за п 1, 2, 3, який відрізняється тим, що як поглинаючий розчин використовують 0,85-0,90 % розчин хлористого натрію Винахід належить до медицини, а саме, мікробіологи і може бути використаний для визначення основних факторів вірулентності, які секретують патогенні бактерії, наприклад, холерні вібріони або дифтерійні бактерії, та при виготовленні імунобюлопчних препаратів Розроблений спосіб може бути використаний в практичних лабораторіях для встановлення токсигенності виділених штамів патогенних бактерій і оцінки їх епідемічного потенціалу, а також в наукових дослідженнях при вивченні біологічних властивостей патогенних бактерій, для виявлення високотоксигенних штамів та накопичення токсинів з метою приготування імунобюлопчних препаратів для об'єктивної оцінки епідемічної ситуації [5, 11, 12, 13] Висновок про токсигенність має виключно важливе значення для діагностики захворювання, адекватного лікування та своєчасного проведення протиепідемічних та профілактичних заходів [1, 10] Одержання токсичних субстанцій патогенних бактерій необхідне і для виготовлення імунобюлопчних препаратів, вивчення патогенезу та імунітету [2, 3, 4, 8] Однак проблема одержання очищених токсичних субстанцій патогенних бактерій зі збереженими нативними властивостями залишається складною Основна трудність полягає у виділенні нативних токсинів вільних від компонентів живильного середовища та продуктів руйнування бактерій, наприклад, їх соматичних антигенів Присутність цих компонентів значно затрудняє імунологічне та біологічне тестування позаклітинних токсичних субстанцій, виготовлення імунобюлопчних препаратів, вивчення факторів вірулентності та захисних механізмів Необхідно В умовах періодичного епідемічного неблагополуччя з холери, дифтерії та інших небезпечних інфекційних хвороб, виділення від хворих і об'єктів зовнішнього середовища штамів патогенних бактерій різного ступеня вірулентності, особливого значення набуває визначення здатності до токсиноутворення і його рівня у циркулюючих штамів 1 CO Ю 59737 підкреслити складність та високу вартість існуючих способів виділення токсичних речовин Відомий спосіб одержання позаклітинних токсичних субстанцій V cholerae [6] полягає в культивуванні досліджуваних штамів холерних вібріонів в рідкому триптоновому живильному середовищі протягом 18-36 годин в умовах шутелювання, та подальшому ультрацентрифугуванні бульоної культури ЗО хвилин при 8000об/хв Недоліками способу є необхідність наявності спеціального обладнання для шутелювання та ультрацентрифугування, що має використовуватись в умовах дотримування протиепідемічного режиму роботи зі збудниками особливо небезпечних інфекцій, присутність в супернатантах компонентів живильного середовища та продуктів розпаду вібріонів, зокрема, ліпополісахаридів, значні затрати електроенергії Відомий також спосіб одержання препаратів холерного токсину, вільних від компонентів живильного середовища [4] Після трьох послідовних пересівів на бульон і агар Мартена холерні вібріони вносять в 3-літрові колби з 300 мл 5% пептонної води і вирощують протягом 8 годин при 28°С в умовах постійного струшування на шутельапараті Потімбульонну культуру центрифугують в рефрижераторній центрифузі при 4°С ЗО хвилин при 5-6 тисячах об/хв , супернатант пропускають через керамічні бактерійні свічки і токсин концентрують за допомогою охолодженого до - 40° ацетону, знову центрифугують при температурі - 68°С і проводять очищення на хроматографічних колонках з сефадексом G-100 На цьому етапі в отриманих зразках виявляють холерний токсин в суміші з соматичним О-антигеном Подальше очищення здійснюють за допомогою препаративного диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі та елюції з окремих ділянок гелю речовин, що розділяли, виявляють елюат, котрий містить холерний токсин На заключному етапі вивчають біологічні властивості та антигенну подібність з природним холерогеном одержаних зразків токсину Недоліками цього способу є виключна складність, трудомісткість, дорожнеча ХІМІЧНИХ речовин та обладнання Відомий спосіб одержання позаклітинних токсичних продуктів С diphtenae [11] включає культивування протягом 7 діб штамів цього збудника в рідкому живильному середовищі Лінгуда або Мартена, ультрацентрифугування з подальшою фільтрацією крізь бактерійні фільтри Основними недоліками цього способу є довготривалість культивування, дорожнеча живильного середовища, необхідність звільнення від бактерійних клітин ультрацентрифугуванням та фільтрацією, наявність в кінцевому продукті компонентів живильного середовища та соматичних антигенів У наведених вище способах одержання позаклітинних токсичних субстанцій є СПІЛЬНІ ознаки (етапи) а) накопичення токсичних продуктів в рідкому живильному середовищі в суміші з бактеріями, б) подальше звільнення від бактерій Отже, узагальнюючи, необхідно наголосити, що недоліками аналогів є наявність у фільтратах або супернатантах (окрім позаклітинних токсичних продуктів) компонентів живильного середовища та продуктів розпаду бактерій, використання в процесі видобутку токсинів значних об'ємів живильного середовища та дорогого обладнання Методи подальшої очистки від побічних домішок дуже складні та трудомісткі Вони передбачають накопичення токсичних продуктів в великих об'ємах рідкого живильного середовища в умовах шутелювання, ультрацентрифугування на холоді, хроматографію на колонках з сефадексом, та ІНШІ процедури На цьому етапі в кінцевому продукті, окрім холерного токсину, все ще міститься соматичний антиген, а можливо і ІНШІ компоненти Прототипом способу, який пропонується, є метод Лобанова В В , Сальникової О В , Олексієвої Л П та ш [5] Він складається з таких етапів 1) вирощування досліджуваного штаму V Cholerae на пластинках агару Мартена протягом 18-20 годин, 2) пересів на 10мл бульону Мартена та вирощування протягом 2-3 годин при 28-29°С, 3) другий пересів на 50мл цього ж середовища та вирощування протягом 20-22 годин при 28-29°С, 4) центрифугування бульонної культури 30-40 хвилин при 5000об/хв, ВІДПОВІДНО до правил протиепідемічного режиму роботи зі збудниками, особливо небезпечних захворювань, 5) одержання супернатантів Основними недоліками прототипу є 1) присутність в супернатанті, окрім холерних токсинів, компонентів рідкого живильного середовища та продуктів розпаду бактерій, 2) багатоетапність процесу отримання токсичних субстратів, 3) необхідність звільнення від мікроорганізмів центрифугуванням, ВІДПОВІДНО ДО правил протиепідемічного режиму роботи з особливо небезпечними збудниками, 4) дорожнеча живильного середовища, електроенергії та апаратури, яка використовується в процесі накопичення і видобутку токсичних субстанцій, 5) секреція токсинів в рідке живильне середовище, що гальмує подальший синтез токсину холерними вібріонами в цьому середовищі В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб одержання позаклітинних субстанцій патогенних бактерій шляхом використання щільного живильного середовища у якості молекулярного сита, що дозволить накопичувати позаклітинні токсичні субстанції патогенних бактерій вивільнені від компонентів рідких живильних середовищ і продуктів розпаду мікроорганізмів, скоротити етапи видобування, убезпечити одержання токсичних субстанцій та підвищити економічну ефективність способу Задача винаходу досягається тим, що одержання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій, здійснюють шляхом посіву мікроорганізмів на поживне середовище, вирощування при температурі культивування збудника, а як поживне середовище застосовують щільне поживне середовище, наприклад, агар і токсичні субстанції здобувають із середовища протягом 20-24 годин 59737 дифузією крізь нижню поверхню агарової пластинки у поглинаючий розчин У тому разі, коли необхідно одержати токсичну субстанцію від ізольованої колонії бактерій, ділянку агару с ізольованою колонією бактерій, кладуть усередину пеніцилінового флакону та зістиковують його з верхнім кінцем покривного скла, заглибленого в поглинаючий розчин, об'ємом 1,0-1,5см3, при цьому флакон ставлять на опору під гострим кутом Поглинаючим розчином є 0,85-0,90% розчин хлористого натрію У разі вирощування культури бактерій газоном, ділянку агару з культурою бактерій, зрощеній газоном, відокремлюють на відстані не менше 1,0см від кінцевої зони росту мікроорганізмів, перекладають у чашку Петрі на опорні елементи та заповнюють вільний об'єм між ними поглинаючим розчином до зіткнення його з нижньою поверхнею агару Суть винаходу полягає в накопиченні позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій у щільному живильному середовищі та їх видобуток у поглинаючий розчин шляхом дифузії Для цього досліджуваний штам холерного вібріона висівають в 5 мл 1% лептонної води і після 4 х годинного під рощення при 37°С пересівають на чашку Петрі з лужним агаром рН 7,6 В залежності від мети дослідження і необхідної КІЛЬКОСТІ секретованих токсичних продуктів холерного вібріона посів виконують або штрихом для отримання ізольованих колоній, або газоном з метою отримання суцільного росту діаметром 6-7,5см в центрі чашки Петрі Культури бактерій вирощують протягом 24-48 годин при 37°С для накопичення секретованих токсичних продуктів в шарі агару Потім ділянку агару з ізольованою колонією або культурою бактерій, що виросла газоном, вирізають і переносять на опорні елементи ВІДПОВІДНО В ПЄНІЦИЛІНОВІ флакони та чашки Петрі 3 метою попередження потрапляння мікроорганізмів в поглинаючий розчин ділянку агару з культурою вирізають на відстані 1-2мм від краю росту культури при використанні ізольованих колоній і не менше 1см у випадку використання зон суцільного росту бактерій Простір під агаром заповнюють поглинаючим розчином, наприклад, фізіологічним, вносячи ВІДПОВІДНО 1-1,5см3 та 6-8см3 розчину до зіткнення з нижньою поверхнею агару Токсичні продукти добувають з агару, розміщуючи вказані ємності на 24 години при температурі культивування збудника Дифузія токсинів в поглинаючий розчин оптимізує процес токсиноутворення, тому що присутність токсинів в середовищі культивування пригнічує продукцію бактеріями токсинів Одержані дифунданти переносять в стерильний посуд, перевіряють на специфічну стерильність шляхом висіву на поживні середовища ВІДПОВІДНО до інструкції і додають антибіотик абактал в кінцевій концентрації 0,2 мг/мл перфлоксацину (активна речовина препарату), до якого холерні вібріони є високочутливими Вміст ТОКСИЧНИХ продуктів визначають в культурі НеІ_а за числом пошкоджених клітин з морфологічними проявами цитотоксичної дії холерного токсину або ЦИТОЛІЗИНІВ [9], вміст білка в пробах визначають за методом Лоурі КІЛЬКІСТЬ ЙОГО В більшості проб не перевищує 1мкг/мл Щоб уникнути шактивування токсичних субстанцій, збереження їх спектру та нативних властивостей отримані дифунданти використовують без будь-яких додаткових етапів очищення і концентрування Розроблений нами спосіб виключає потрапляння в поглинаючий розчин такої КІЛЬКОСТІ бактерій, яку можна було б визначити, а також продуктів їх розпаду та компонентів живильного середовища При цьому КІЛЬКІСТЬ ТОКСИНІВ, ЩО по ступають в поглинаючий розчин, характеризує інтенсивність і спектр токсичних субстанцій, що секретуються досліджуваним штамом бактерій В таб 1 представлені порівняльні дані про активність продукції та антигенну специфічність токсичних субстанцій, що секретують ізольовані колони високотоксигенного еталонного штаму 569 В V cholerae та 10 ctx+ штамів V cholerae eltor, котрі були виділені від хворих на холеру в період епідускладнень в 1994-1995р р З матеріалів таблиці випливає, що в дифундантах штамів V cholerae eltor знаходилась приблизно однакова (40% штамів) або менша (60% штамів) порівняно з штамом 569 В, КІЛЬКІСТЬ холерного токсину При цьому антигенна структура останнього у всіх вивчених штамів була ідентичною, тому що антитоксична сироватка до штаму 569 В повністю нейтралізувала цитотоксичний ефект токсичних субстанцій Ці дані підтверджують можливість встановлення за допомогою запропонованого способу ступеню антигенної спорідненості та інтенсивності продукції токсинів, що виділяють штами холерного вібріона, і таким чином прогнозувати важкість захворювань, визначати рівень антигенної МІНЛИВОСТІ основного фактора патогенності, оцінювати епідемічний потенціал штамів холерного вібріона, що виділяються Таблиця 1 Інтенсивність токсиноутворення ctx штамами V cholerae eltor, ізольованими від хворих на холеру в Миколаївській області в 1994-1995 р р КІЛЬКІСТЬ штамів V cholerae 4 2 4 Високотоксигенний шт 569В Специфічна нейтралізація токсичного Число пошкоджених клітин ефекту антитілами до токсину шт 569 в осередку (24 год ) В 10-15 і > повна нейтралізація -"5-Ю -"2-3 10-15 і > -" 59737 8 Можливість визначення токсигенності та рівня токсиноутворення за допомогою запропонованого способу продемонстрована і для штамів С diphthenae, виділених від хворих на дифтерію (таб 2) Таблиця 2 Рівень токсиноутворення штамами С diphthenae, ізольованими в період епідемії дифтерії в Україні в1993-1994рр КІЛЬКІСТЬ пош № штаму С diphthenae коджених КЛІТИН 56 64 75 182 228 302 PW - 8 (Торонто), етал шт 10648 (еталон штам) 80 90 20 95 80 100 98 95 Токсин нейтралізуючий ефект антитоксичної сироватки до дифтерійного токсину PW-8 Повна нейтралізація пошкоджуючої дії -"-"-"-"-"-"-" Із даних таблиці 2 випливає, що всі вивчені штами були токсигенними, рівень токсиноутворення у переважного числа штамів був високим і антигенна структура токсинів була ідентичною у свіжовиділених від хворих штамів та еталонного штаму PW-8 Ці дані дозволяють заключити, що виготовлені з токсину штаму PW-8 профілактичні (дифтерійний анатоксин) та лікувальні препарати (дифтерійна антитоксична сироватка) зберігають специфічну ефективність і в період останньої епідемії дифтерії в Україні Високий рівень токсиноутворення вказує на необхідність використання максимально допустимих доз лікувальної сироватки на самих ранніх строках захворювання Другий варіант запропонованого способу отримання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій, що передбачає збільшення площі зони суцільного росту культури, дозволяє накопичувати токсичні продукти в КІЛЬКОСТІ, необхідній для імунізації тварин з метою виготовлення антитоксичної сироватки Наприклад, в результаті імунізації кроликів анатоксином, виготовленим з токсичних продуктів високотоксигенного штаму 569 В V cholerae classica, отримана антитоксична сироватка, яка повністю нейтралізує токсини в розведенні 1 15 - 1 ЗО, котрі продукуються однією колонією цього штаму та ctx+ штамами холерних вібріонів бювару ельтор Анти-О-антитіла виявляються лише в низьких концентраціях - при розведенні сироватки 1 5 Отримані результати свідчать про можливість отримання позаклітинних токсичних субстанцій патогенних бактерій вільних від компонентів рідких поживних середовищ та продуктів розпаду холерних вібріонів при скорочені етапів їх одержання та здешевлення способу При порівнянні заявленого способу із способом-прототипом необхідно відзначити, що використання відомого способу одержання токсинів не дозволяє КІЛЬКІСНО оцінити рівень токсиноутворення і визначити таким чином ступінь вірулентності збудника, тому що інтенсивність його росту та секреції токсинів варіює залежно від умов культивування і складу рідкого поживного середовища КІЛЬКІСТЬ дифтерійного екзотоксину, що визначена на морських свинках (Dim/ml) ЗО ЗО Окрім того, присутність значної КІЛЬКОСТІ соматичних антигенів в супернатантах маскує наявність токсинів і не дозволяє одержувати сироватки, що містять переважно антитоксичні антитіла, як це має місце при використанні запропонованого способу Так, сироватки, одержані при імунізації супернатантами лабораторних тварин, містять в 10 і більше разів анти-О-соматичних антитіл Таким чином, запропонований спосіб має слідуючі переваги 1) виключається необхідність культивування патогенних мікроорганізмів у великих об'ємах коштовного поживного середовища, а також етап швидкісного центрифугування в режимі роботи зі збудниками особливо небезпечних інфекцій 2) з'являється можливість отримання позаклітинних токсичних продуктів, вільних від компонентів рідких поживних середовищ та продуктів розпаду мікроорганізмів 3) оптимізується токсиноутворення за рахунок дифузії токсинів в агар, а потім в поглинаючий розчин 4) дає можливість отримання антитоксичних сироваток з переважним вмістом токсиннейтралізуючих антитіл 5) забезпечує можливість оцінки рівня токсиноутворення і ступеня антигенної спорідненості еталонних та циркулюючих штамів Метод технічно не складний, економічно вигідний, може бути використаним в медичних установах для визначення епідемічного потенціалу циркулюючих штамів патогенних бактерій та антигенної структури секретованих факторів патогенності ВІДОМОСТІ, котрі підтверджують виконання способу Приклад 1 Штам холерного вібріона вирощують протягом 4-х годин на 1% лептонній воді і засівають на чашку Петрі з лужним агаром Посів проводять легким дотиком до агару петлею діаметром 1 мм з інтервалом не менше 1см Через 24 години росту при 37°С очним пінцетом вирізають ділянку агару з бляшкою або колонією розміром 0,7x0,7см таким 59737 10 фундант) збирають пастерівською піпеткою в стерильну ємність і визначають КІЛЬКІСТЬ та спектр токсичних субстанцій на моделі клітин НеІ_а [9] Безпосередньо після цього до дифунданту додають мертиолят натрію з кінцевою концентрацією 1 10000, перевіряють його на специфічну стерильність і використовують для одержання анатоксину з метою імунізації кроликів і приготування антитоксичної сироватки Вказана сироватка повністю нейтралізувала в розведенні 1 15-1 ЗО токсини, які продукуються однією колонією цього штаму Джерела інформації 1 Бароян О В Холера эльтор -М -1971 -276с 2 Джапаридзе М Н , Караева Л Т , Дертева И И и др Изучение иммунологической эффективности холерогена-анатоксина при испытании на экспериментальных животных // ЖМЭИ - 1974№3- С 58-61 3 Джапаридзе М Н , Караева Л Т , Дертева И И и др Изучение иммунологической эффективПриклад 2 ности холерогена-анатоксина на добровольцах // З косяка еритроагару, на якому зберігається ЖМЭИ- 1974-№8-С 106-109 штам С diphthenae, культура штрихами засівається на чашку Петрі з МЛА (м'ясо-пептонний агар) 4 Ефременко В И Получение кристалличедля отримання 1 добової культури, котру знову ских препаратов холерогена и холерогеноида пересівають на чашку Петрі з МЛА легким дотиком //ЖМЭИ -1978 - №4- С 45-49 до агару петлею діаметром 1мм з інтервалом не 5 Ломов Ю М , Лобанов В В , Сальникова О И менше 1см Через 24 години росту при 37°С очним и др Оценка эпидемиологической значимости пінцетом вирізають ділянку агару з бляшкою або свежевыделенных холерных вибрионов // Эпидеколонією розміром 0,7x0,7см таким чином, щоб миология и инфекционные болезни - 2001 - №3 відстань між краєм зони росту і краєм вирізаної С 30-32 ділянки складала 1,5х2мм Вирізану ділянку очним 6 Мазрухо А Б , Михась Н К , Монакова Е В и пінцетом обережно розміщують в пеніциліновому др Определение оптимальных условий продукции флаконі з 1,5мл фізіологічного розчину і закріплюряда факторов патогенных холерных вибрионов // ють її на верхньому краї покривного скла Флакони Журн микробиологии - 2000 - №1 - С 21-24 кладуть під кутом 45° При цьому з поглинаючим 7 Оценка способности холерных вибрионов розчином стикується тільки нижня поверхня агару, продуцировать холерный токсин Метод рекоменщо забезпечує дифузію токсичних субстанцій в дации - Ростов-на-Дону-1999 поглинаючий розчин і попереджує потрапляння в 8 Патент України №39348А Спосіб отримання останній мікроорганізмів та їх продуктів Флакони позаклітинного дифтерійного антигена Щетініна поміщають в термостат на 24 години Потім пасВ М , Ніколєнко В М , Альсабан Абдулхакім та ш , терівською піпеткою відбирають поглинаючий розопубл 15 02 2001р чин, вміщуючий токсичні субстанції (дифундант) 9 Патент України №4593 ОА Спосіб визнаПровіряють на специфічну стерильність, додають чення токсигенності холерних вібріонів Стопабактал в концентрації 0,2мг/мл активної речовини чанська А Г , Винник В Д , Дронова ІЮ та ш , і використовують для визначення наявності та опубл 28 02 2002р КІЛЬКОСТІ токсину за морфологічними проявлення10 Смирнова Н И , Кукушкин А М Эпидемичеми цитотоксичного ефекту на культурі клітин ски значимые штаммы холерного вибриона генетические особенности и возникновение // ЭпидеПриклад З миология и инфекционные болезни - 2001 - №3 Штам V cholerae 569 В засівають газоном с 25-29 (d=6-7cM) на 4-5 або більше чашок Петрі з 25мл 1% лужного агару Посіви шкубують 24-48 годин 11 Щетинина В Н , Шинкаренко А А Москапри 37°С Ділянку агару з вирощеною культурою ленко В Н и др Изучение токсинсодержащих холерних вібріонів вирізають скальпелем по перифильтратов из культуральных жидкостей клиничеметру на відстані не менше 1 см від краю ских штаммов Corynebactenum diphthenae мікроорганізмів і поміщають в стерильну чашку //Микробиол журнал -1997 - т 59,- №1 -с 65-69 Петрі на скляні запаяні з обох сторін трубочки 12 Otteman KT and J J Mekalanos Regulation діаметром 1-2мм, які укладаються паралельно на of Cholera Toxin Expression // Vibrio chlerae and відстані не більше 1 см одна від одної При цьому Cholera Molecular to Global Perspectives /Ed by агар стикується з поглинаючим розчином тільки Kaye Washmuth, Paul A Blake and Orjan Olsvikсвоєю нижньою поверхнею, закриті чашки Петрі 1994- American Society for Microbiology - Washingпоміщають в термостат при 37°С на 24 години для ton дифузії токсичних продуктів в поглинаючий роз13 Reeves PR and R Lan Cholera in the 1990 чин Вміщуючий токсичні субстанції розчин (ди// British Medical Bulletin -1998 - 54 (№3)-P 611-623 чином, щоб відстань між краєм зони росту та краєм вирізаної ділянки складала 1,5-2мм Вирізану ділянку очним пінцетом обережно розміщують в пеніциліновому флаконі з 1,5мл фізіологічного розчину і закріплюють и на верхньому краї покривного скла Флакони кладуть під кутом 45° При цьому з поглинаючим розчином стикується тільки нижня поверхня агару, що забезпечує дифузію токсичних субстанцій в поглинаючий розчин і попереджує потрапляння в останній мікроорганізмів та їх продуктів Флакони поміщають в термостат на 24 години, потім пастерівською піпеткою відбирають поглинаючий розчин, вміщуючий токсичні субстанції (дифундант) Провіряють на специфічну стерильність, додають абактал в концентрації 0,2мг/мл активної речовини і використовують для визначення наявності, КІЛЬКОСТІ та антигенної структури токсину за морфологічним проявленням цитотоксичного ефекту на культурі клітин НеІ_а [9] 11 Комп'ютерна верстка Т Чепелєва 59737 12 Підписано до друку 06 10 2003 ТиражЗЭприм Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна