Спосіб довготривалого зберігання сперми людини в лабораторних умовах

Реферат: Спосіб довготривалого зберігання сперми людини в лабораторних умовах включає розведення сперми людини розчином ТЕСТ буферу з рН=7,35 у комбінації з 20 % жовтком та 8 % глюкозою у співвідношенні 1:1. До суміші додатково вноситься гліцерол в концентрації 6,5 % після чого новоутворена суміш спочатку заморожується до -5 °C, а потім до -193 °C. UA 70150 U (12) UA 70150 U UA 70150 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі медицини, зокрема до репродуктивних біотехнологій, і може бути використана у науково-дослідних установах, де вивчають фізіолого-біохімічні особливості сперматозоїдів людини, а також у андрологічних лабораторіях при проведенні серійних аналізів з діагностики фертилізаційного потенціалу сперми. Відомі способи кріоконсервації сперми людини при низьких температурах з використанням кріоконсерванту гліцеролу, а також антиосмотичних речовин таких, як глюкоза, фруктоза або цитрат натрію [1, 2]. Недоліком цих способів є те, що за їх протоколом не вдається в значній мірі уникнути утворення великих кристалів льоду та солі в цитоплазмі сперматозоїда, що згодом при розморожуванні сперми у багатьох випадках призводить до руйнування суцільної структури поверхневих мембран сперматозоїдів, а також до суттєвого погіршення рухливості та втрати життєздатності сперматозоїдами. Вказаний недолік частково вдається подолати застосуванням способів кріоконсервації сперми у спеціальних автоматизованих системах контролю за зниженням та зростанням температури в біологічному матеріалі [3, 4]. Однак такі автоматизовані системи з технічної точки зору є достатньо складними і, відповідно, досить недешевими в експлуатації, що обмежує їх практичне використання. Крім того, температурні діапазони контрольованої кріоконсервації в цих приладах обмежені. Прототипом способу, що заявляється, слід вважати спосіб короткотривалого кріозберігання сперми людини при 5 °C у середовищі, що складається з ТЕСТ буферу (85 мМ тригідроксиметиламінометану та 189 мМ n-тригідроксиметил-метил 1,2-аміноетансульфонової кислоти у фізіологічному розчині) з додаванням 20 % яєчного жовтку [5]. Недоліком даного способу є те, що він дозволяє зберігати сперму лише протягом декількох днів без погіршення її кінетичних та морфологічних характеристик. Тому довготривале зберігання сперми за цим методом неможливе. Задачею корисної моделі є оптимізація компонентного складу поживного середовища для її збереження протягом кріоконсервації в лабораторних умовах з тим, щоб досягти найменшої втрати сперматозоїдами їх кінетичних властивостей і життєздатності у процесі заморожування-розморожування сперми в лабораторних умовах. Заявлений нами спосіб довготривалого зберігання сперми людини усуває недолік прототипу і забезпечує довготривале зберігання сперми людини протягом дванадцяти місяців з майже незмінними морфо-функціональними характеристиками, оскільки розбіжності у показниках не перевищують 10 % порівняно із щойно зібраною спермою. При розробці корисної моделі поставлену задачу було вирішено шляхом оптимізації складу кріоконсервуючого середовища завдяки внесення 6,5 гліцеролу та 8 % глюкози до ТЕСТ буферу з pH 7,35, що містить 20 % яєчного жовтку, а також застосуванням двостадійного процесу заморожування сперми, яке передбачало початкове охолодження до -5 °C з наступним швидким перенесенням зразків у пластикових пробірках до рідкого азоту. Після кріозберігання сперму швидко розморожували при 37 °C в термостаті протягом 20 хв. Ефективність запропонованого способу продемонстровано наступними прикладами. Приклад 1. Збір сперми проводили шляхом мастурбації після 4 днів статевого утримання від 16 чоловіків-нормодонорів, що були, за їх власною згодою, задіяні у дослідженні. Кожний зразок сперми поділявся на 2 частини. Першу частину використовували для негайного визначення рухливості та життєздатності сперматозоїдів, для чого сперму спочатку розріджували у термостаті при 37 °C 45 хв., а потім добре перемішували. Краплину суміші за допомогою скляної палички переносили на предметне скло та накривали покривним скельцем. Підготовлений препарат використовували зразу ж для підрахунку загальної рухливості сперматозоїдів на збільшенні х400 під мікроскопом "МБИ-6" (Росія). Для кожного препарату підраховували 200 навмання відібраних сперматозоїдів у 4 різних полях зору. Визначення життєздатності проводили за допомогою вітального фарбування сперматозоїдів сумішшю 10 % нігрозину та 1 % еозину (10:1) у фізіологічному розчині. Життєздатні сперматозоїди залишались не пофарбованими, оскільки були непроникними для барвника. В той же час у мертвих сперматозоїдів відбувалось накопичення барвника в цитоплазмі, тому вони мали рожеве або червоне забарвлення. Другу частину кожного еякуляту нормальної за критерієм ВООЗ сперми направляли на заморожування та кріозберігання. Сперму заморожували наступним чином. Спочатку до кожного зразка додавали кріоконсервуюче середовище, добре перемішували скляною паличкою і переносили у поліетиленову пробірку з кришечкою, а потім пробірку зі спермою ставили у охолоджувач з температурою -5 °C. Еквілібрацію проводили протягом 3-х годин. Після чого зразки сперми занурювали у рідкий азот, що зберігався у дьюарі. 1 UA 70150 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Випробовували 4 варіанти кріоконсервуючого середовища. У варіанті 1 до сперми додавали гліцерол до кінцевої концентрації 6,5 %. У варіанті 2 сперму розводили розчином ТЕСТ, що містив яєчний жовток у концентрації 20 % у співвідношенні 1:1. У варіанті 3 до сперми спочатку додавали такий же за об'ємом розчин ТЕСТ з 20 % яєчним жовтком, а потім у суміш вносили гліцерол до кінцевої концентрації 6,5 %. У варіанті 4 все робили так, як і у варіанті 3 з однією відмінністю, оскільки у поживне середовище ТЕСТ-яєчний жовток додатково вносили глюкозу у концентрації 8 %. Після дванадцятимісячного кріозберігання сперми у рідкому азоті, сперму розморожували шляхом витримування при кімнатній температурі протягом 20 хвилин з наступним розрідженням у термостаті при 37 °C протягом 45 хв. У розмороженій спермі мікроскопічно вивчали рухливість та життєздатність сперматозоїдів порівняно із свіжою спермою. Результати дослідження представлені у табл. 1. Як бачимо найкращі результати було отримані у варіанті 4, де відмінності з контролем (варіант 5) були незначними і не мали статистично достовірної значущості. У всіх інших варіантах (1, 2, 3) показники рухливості і життєздатності сперматозоїдів суттєво відрізнялись від контрольних величин (р