Середовище для зберігання сперми бугаїв

Винахід належить до штучного осіменіння сільськогосподарських тварин. Відоме глюкозо-цитратно-жовткове середовище для зберігання сперми бугаїв при температурі 2 15°C, яке складається з глюкози медичної безводної, натрію лимоннокислого трьохзаміщеного п'ятиводного, жовтка курячих яєць і дистильованої води, мас.%: Глюкоза медична безводна 2,412 Натрій лимоннокислий трьохзаміщений п'ятиводний 1,125 Жовток курячих яєць 16,077 Вода дистильована Решта (Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 1981. - С.68). Недоліком даного середовища є те, що термін зберігання в ньому сперматозоонами нормального прямолінійно-поступального руху і запліднювальної здатності становить не більше 72 годин, тобто отриману від плідника і розбавлену цим середовищем сперму потрібно використати для осіменіння самок протягом трьох діб. Короткий термін збереження сперми не забезпечує 100% - го її використання та призводить до зайвих витрат реактивів на приготування середовища. За виробничими даними сперма, розбавлена відомим середовищем, використовується на 70% її об'єму. Суть винаходу полягає у подовженні строку збереження сперматозоонами бугаїв прямолінійнопоступальних рухів та високого рівня запліднювальної здатності протягом 120 годин, розширенні діапазону температур збереження сперми від 2 до 15°C за рахунок зниження активності метаболічних процесів у сперматозоонах шляхом внесення в середовище додаткових речовин - бікарбонату натрію та газоподібного діоксиду вуглецю і встановлення певного рівня концентрації водневих іонів (pH 6,6 - 6,8) у середовищі. В основу винаходу поставлено задачу розробити середовище для зберігання сперми бугаїв, що забезпечує гальмування активності метаболічних процесів сперматозоонів в умовах плюсових температур, подовжує термін зберігання ними високого рівня запліднювальної здатності протягом 120 годин (5 діб) шляхом добавки у відоме середовище (прототип) натрію двовуглекислого та діоксиду вуглецю у співвідношеннях, що утримують концентрацію водневих іонів у ньому на рівні 6,6 6,8, забезпечити технічний результат продовження терміну використання сперми до 5 діб, умови збереження її при плюсових температурах (2 ... 15°C) та підвищити долю використання сперми до 100%. Вказаний технічний результат досягається тим, що в середовище для розбавлення сперми бугаїв, яке містить глюкозу медичну безводну, натрій лимоннокислий трьохзаміщений п'ятиводний, жовток курячих яєць і дистильовану воду, додатково вводять бікарбонат натрію і газоподібний діоксид вуглецю при такій кількості компонентів, мас.%: Глюкоза медична безводна 2,404 - 2,406 Натрій лимоннокислий трьохзаміщений п'ятиводний 1,122 - 1,123 Жовток курячих яєць 16,029 - 16,039 Натрій двовуглекислий 0,202 - 0,269 Діоксид вуглецю 0,028 - 0,034 Вода дистильована Решта, при цьому pH розбавленої сперми складає 6,6 - 6,8, а температура її зберігання становить 2 - 15°C. Середовище готують так. У стерильну колбу вносять наважки глюкози, цитрату натрію і бікарбонату натрію за рецептом, додають прокип'ячену дистильовану воду і перемішують до повного розчинення компонентів. Середовище охолоджують до кімнатної температури і додають жовток курячих яєць за рецептом. Після чого середовище насичують газоподібним діоксидом вуглецю до концентрації водневих іонів 6,6 - 6,8 і розбавляють сперму з таким розрахунком, щоб в 1мл сперми було 25 - 30млн. сперматозоонів з прямолінійним рухом. Розбавлену сперму якомога швидше розфасовують у стерильний скляний посуд, який заповнюють на 2/3 місткості і щільно закривають корком. Сперму зберігають при температурі 2 - 15°C. Порівняно з прототипом запропоноване середовище додатково містить газоподібний діоксид вуглецю, який гальмує метаболічні процеси в спермі. Ця властивість вуглекислого газу давно відома, і тому багато вчених у різний час пропонували його в складі розріджувачів для сперми: Іллінойський розріджувач, бікарбонатнофосфатний та ін. (Смирнов І.В., Зорін І.Г., Невада В.Ю., Бахмет К.О. Довідник по штучному осіменінню сільськогосподарських тварин. - К.: Урожай, 1971. - С.191 - 192). Але в усіх цих середовищах автори не звертали уваги на надмірну кількість діоксиду вуглецю, яка призводить до ацидозу і загибелі сперматозоонів. Солі вугільної кислоти застосовувались тільки для хімічної реакції, в результаті якої утворювався вуглекислий газ. Оптимізація запропонованого середовища проходила одночасно за трьома факторами: кількості бікарбонату натрію, концентрації водневих іонів і кількості газоподібного діоксиду вуглецю. Зрозуміло, що ці фактори мають тісну взаємозалежність. Крім того, pH відомого середовища (прототип) становить 7,1 - 7,2, тоді як у нативній спермі бугая стандартної якості концентрація водневих іонів дорівнює 6,6 - 6,7. У результаті проведених досліджень встановлено, що при введені в запропоноване середовище бікарбонату натрію в кількості 0,202 0,269мас.% і діоксиду вуглецю таку кількість, що вирівнює концентрацію водневих іонів у ньому до 6,6 - 6,81 при збереженні розбавленої ним сперми при t = 2 - 15°C значно подовжується сперматозоонами придатність до використання (на 36 годин) за рахунок підтримання їх гіпобіотичного стану під час зберігання, а також підвищується запліднювальна здатність на 7,7% (табл.1). При температурах збереження нижче 2°C виживаність сперматозоонів дещо зменшувалась, а при вищих (16°C і вище) - концентрація водневих іонів знижувалась, що приводило до зменшення виживаності клітин. Сперму від 16 бугаїв-плідників голштинської породи розділили на 5 частин: одну, розбавили відомим середовищем (прототип), а другу, третю, четверту і п'яту - пропонованим середовищем, приготовленим за рецептами (табл.2, №1 - 4). Концентрація сперматозоонів в усіх частинах становила 25 - 30млн/мл. Сперму зберігали при температурі 2 - 15°C до появи поодиноких рухливих гамет. Дослідні зразки сперми зберігалися в скляних щільно закритих флаконах, заповнених на 2/3 місткості. В усіх зразках рухливість сперматозоонів перевірялась двічі на добу під мікроскопом при температурі 38°C. Відмічалось зниження рухливості сперматозоонів у пропонованих зразках з наступним її відновленням після нагрівання препарату до 38°C. Приклад 1. Виживаність гамет у першій і другій частині сперми була однакова - 180 годин. Це можна пояснити тим, що надмірна кількість вуглекислого газу в середовищі, приготовленим за рецептом №1 (табл.2), при такій кількості бікарбонату натрію (0,135мас.%) викликала спочатку глибокий гіпобіоз статевих клітин, а потім їх руйнування. Приклад 2. Третю частину сперми розбавили середовищем, приготовленим за рецептом, який наводиться в рецепті №2. Виживаність сперматозоонів у дослідних зразках становила порівняно з контрольними на 24 години більше. Цей результат викликаний тим, що рівень pH ближчий до природного, а підвищена кількість бікарбонату натрію (0,202мас.%) гальмує руйнівні процеси в спермі під впливом вуглекислого газу. Приклад 3. Четверта частина сперми, яку розбавили середовищем №3, досліджувалась так само, як і перші три. Виживаність сперматозоонів у ньому становила 216 годин, порівняно з прототипом - 180 годин. Руйнівна дія кислот тут також стримувалась буферними властивостями бікарбонату натрію. Приклад 4. П'ята, остання, частина сперми була розбавлена середовищем, склад якого наведено у рецепті №4. Рівень pH цього середовища був нейтральний (7,0) і, таким чином, наближався до рівня pH прототипу (7,1 - 7,2). Виживаність гамет у цій частині була найнижчою - 96 годин, що пояснюється суттєвим підвищенням концентрації водневих іонів.