Рослинний матеріал цукрового буряку, стійкий до імідазолінонового гербіциду, спосіб надання рослинам буряку стійкості до гербіцидів та спосіб боротьби з бур’янами

Винахід стосується способу отримання цукрово-бурякових рослин (Beta vulgaris L), стійких до імідазолінонових гербіцидів, що використовуються для контроля бур'янів, зокрема, стосується цукровобурякових рослин, що походять від сприйнятливого цукрового буряка шляхом мутації генної кодуючої ацетолактатсинтази (ALS), відомої також як ацетогідроксикислотна синтаза (AHAS) з послідовним використанням гербицидів з клітинами у середовищі культури. У патентах США 5 013 659, 5 141 870 та 5 378 824 описано генетичну зміну ацетолактатсинтази у гені рекомбінантними засобами. Такий спосіб модифікування цукрово-бурякових рослин ілюстрована прикладом IV у патенті 5 378 824. Одержані результати були незадовільними щодо отримання рослий, стійких до гербіцидів. Saunders et al. (Crop Science 32:1357-1360, 1992) також описують отримання цукрово-бурякової рослини (CR1-B), стійкої до сульфонілсечовини, з сприйнятливого автофертильного клону (REL-1) селекцією клітин мутанта у к ультурі, що містить гербіциди. Були одержані і піддані перехресному схре щуванню різні резистантні рослини. Hart et al. (Weed Science 40378-383, 1992 and 41:317-324, 1993) описують подальші резистантні лінії і відзначають наявність резистантності, зумовленої зміною активності ALS і відсутність перехресної резистантності до інших гербіцидів, придушуючи х ALS, а також кодування її одним напівдомінантним геном. Відсутні публікації, присв'ячені наданню стійкості до імідазолінону модифікуванням ALS або AHAS у цукрово-бурякових рослинах, Різні лінії кукурудзи, стійкої до імідазолінону були створені і описані Newhouse et al. (Theoretical and Applied Genetics 83:65-70, 1991). Промисловий спосіб захисту культурних рослин полягає у використанні "захисників", описаних, наприклад, у Европатенті 375 875. Цей спосіб передбачає внесення у грунт іншого хіміката. Бажаним способом є створення цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінонових гербіцидів. У основу винаходу покладено задачу створення способу надання стійкості до імідазолінонових гербіцидів цукрово-буряковим рослинам шляхом селекції кодуючого цю стійкість гена ацетолактатсинтази, який зазнав мутації. Крім того, задачею винаходу є отримання цукрово-бурякових рослин, стійких до цього гербіциду. Ці задачі і ознаки винаходу пояснюються більш детально у подальшому описі з посиланням на супроводжуючі креслення. Фіг.1 містить схему способу отримання цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінону, згідно з винаходом. R - резистентний, ІМ - імідазолінон, S - чутливий, SU - сульфонілсечовина, Sur - домінанта алелі ALS щодо SU-R, TP-R та IM-S, SIR-13 - домінанта алелі ALS щодо SU-S, TP-S та IM-R, ТР - тріазолпіримідин. 93R3B - це SU-R, IM-R та TP-R. REL-1 є вихідним матеріалом, що використовується для надання стійкості до імідазолінону. Фіг.2 ілюструє послідовність операцій створення мутанта цукрово-бурякової рослини. Фіг.3 містить графік кількісного аналізу стійкості рослин цукрового буряка до імазетапіру, внесеного розприскуванням після сходження. Фіг.4 містить графік кількісного аналізу стійкості ALS до імазетапіру. Винахід стосується цукрово-бурякового рослинного матеріалу, який містить клітини, що зазнали мутації внаслідок змін у кодуючому синтазу гені ацетолактатсинтазі і внаслідок цього набули стійкості до імідазолінонового гербіциду, причому ця стійкість передається звичайним перехресним схрещуванням рослин, одержаних з клітин. Крім того, винахід стосується способу створення стійкості до гербіцидів у цукрово-буряковій рослині, який передбачає у середовищі культури піддання дії імідазолінонового гербіцида чутливих до нього перших клітин цукрового буряка і селекцію други х клітин, стійких до гербіциду, причому ця резистентність може передаватись перехресним схрещуванням рослин, що містять другі клітини. Нарешті, винахід стосується способу надання цукрово-буряковій рослині стійкості до гербіциду, який передбачає підданий дії імідазолінонового гербіцида чутливих до нього перших клітин цукрового буряка у середовищі культури, селекцію других клітин, стійких до гербіциду, вирощування з других клітин першої рослини, стійкої до гербіциду, і одержання стійких до гербіциду схрещених рослин, перехресним схрещуванням першої рослини з другою рослиною. Цукрово-бурякову рослину REL-1 (Регенерування, East Lansing-1), одержану у 1987p., можна придбати безкоштовно від Dr. Joset Saunders, Research Geneticist, US Department of Agriculture, East Lansing, Michigan. REL-1 чутлива (S) до імідазоліноно-вих (ІМ-S), суль фонілсечовинних (SU-S) і тріазолпіримідинсульфонанілідних гербіцидів (Фіг.1). На калусних і суспензійних культурах була створена лінія, гетерозиготно стійка до імідазолінону (IM-R). Цю клітинну лінію (насіння) було депоновано у American Type Culture Collection як АТСС 97534 6.05.1996 згідно з Будапештською угодою і позначено Sir-13. Цю клітинну лінію можна одержати за вимогою з посиланням на ім'я та номер, однак, це депонування не супроводжується ліцензією. Схрещуванням з елітними лініями цукровобурякових рослин, зокрема, з Beta vulgaris L, можна отримати резистантні рослини цукрового буряка, придатні для промислового використання. Звичайним схрещуванням стійкість до імідазолінону можна передати іншим бурякам, наприклад, червоному. Використання цукрово-бурякових рослин, стійких до імідазолінонових гербіцидів, особливо, імазетапіру, дозволяє вирішити проблему, пов'язану з залишками гербіцидів у гр унті на ділянках, де вирощуються цукрові буряки. Сьогодні ділянку для цукрових буряків після використання цих гербіцидів треба витримувати протягом 40 місяців. Крім того, висока стійкість до імідазолінону дозволяє використовувати імідазолінонові гербіциди для захисту цукрового буряка від бур'янів. Подальші приклади ілюструють відокремлення і вирощування нової цукрово-бурякової рослини Sir-13 (Фіг.1). Приклад 1. 1. Селекція варіанту цукрового буряка Sir-13, стійкого до імідазолінону. Матеріал REL-1 (Регенерований East Lansing-1) - чоловіча лінія цукрового буряка з високою здатністю до регенерації, використана для початкової селекції резистентного мутанта, стійкого до імідазолінону і для високочутливого контроля у більшості експериментів. Sir-13 - цей ізолят цукрового буряка одержано висіванням клітин REL-1 у середовищі, що містить Імазетапір. Цей варіант стійкий до імідазолінону і не має перехресної стійкості до сульфонілсечовини. Sir-30 - цей ізолят, одержаний селекцією, має схильність до неродючості і є аберантним результатом процедур у клітинній культурі. а) Рослини, призначені для використання як вихідний матеріал для сомаклональної селекції, були обрані за їх здатністю утворювати калус у середовищі з високим вмістом цитокініна (середовищі В1) і регенерувати з калуса. Середовище В1 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л KNO3 - 1,90г/л СаСІ2×2Н2О - 0,44г/л MgSO4×7H2 O - 0,37г/л КН2РО4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H 2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O - 10,6мг/л КІ - 0,88мг/л Na2MoО4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л СоСІ2×6Н2О - 0,025мг/л Na2ЕДТА - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л бензиламінопурин - 1мг/л рН 5,95 Тверде середовище В1 витримували у автоклаві з 9г/л агарової культури рослини і модифікували стерилізованим фільтруванням концентрованим розчином гербіциду згідно з процедурою селекції. Агарове середовище вливали у одноразові пластмасові чашки Петрі (15´100мл). Аліквотними порціями 40мл рідке середовище В1 вливали у 125 мл-ві колби Ерленмейера і витримували у автоклаві для використання з рідкими суспендованими культурами. б. Для селекції стійкого до імідазолінону варіанту було застосовано процедуру Фіг.2. Експлантати листяних дисків були приготовлені з швидко зростаючого листя вихідної рослини. Поверхню листя стерилізували (крок 1) двома послідовними 20-хвилинними обробками 15%-им комерційним відбілювачем з 0,025%-им Triton X-100 (Т-9280, Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo) з подальшим двократним промиванням стерильною деіонізованою водою. Диски з листя вирізали за допомогою коркового бура, стерилізованого полум'ям. Листяні диски були асептично розміщені на твердому середовищі В1 (крок 2) і інкубовані у темряві при 30°С протягом 4-8 тижнів до появи з диска пухкої білої тканини калуса. Цю тканину відокремлювали механічно пінцетом і переносили у 125 мл-ві колби Ерленмейера (крок 3) з 40мл рідкого середовища В1 кожна. Колби розміщували у гірошейкер робочої частоти 50Гц і витримували під слабким флюоресцентним освітленням (30мкЕ/м 2с). Через 1 тиждень рідкі культури субкультур ували свіжим середовищем В1. Через два тижні після ініціювання рідкої культури грудки клітин відокремлювали за допомогою клітинного дисоціативного сита (Sigma CD-1, 60 меш). Після седиментації клітин клітин приблизно дві третини рідкого середовища видаляли і клітини ресуспендовали (крок 4) у залишку середовища, а на твердому середовищі В1 рівномірно розсіювали 1 мл-ві аліквотні проби разом з 50нМ імазетапірового гербіциду (PURSUIT, American Cyanamid, Waine, NJ). Чашки були обгорнуті і інкубовані у неяскравому флюоресцентному світлі (5-10мкЕ/м 2с) протягом 8-12 тижнів. в. При 50 нМ-ій концентрації імазетапіру усі чутливі клітини загинули. Грудки клітин, що залишились живими при цій концентрації, були відзначені як можливі резистантні варіанти. Ці грудки (діаметром 1-3мм) були перенесені (крок 5) у свіже тверде безгербіцидне середовище і залишені рости під слабким освітленням (10-20мкЕ/м 2с). Кожний з можливих резистентних варіантів ідентифікували і доглядали індивідуально. г. Кожні 4-6 тижнів (крок 6) білий пухкий калус розділяли і тримали у свіжому твердому середовищі В1, до проростання з калуса окремих пагінців. Ці пагінці були перенесені у середовище М20 для догляду. Середовище М20 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л KNO3 - 1,90г/л СаСІ2×2Н2О - 0,44г/л MgSO4×7H2 O - 0,37г/л КН2РО4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H 2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O - 10,6мг/л КІ - 0,88мг/л Na2MoO4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л СоСІ2×6Н2О - 0,025мг/л Na2EДTA - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л бензиламінопурин - 1мг/л рН 5,95 Тверде середовище М20 витримували у автоклаві з 9г/л агарової культури рослини і модифікували стерилізованим фільтруванням концентрованим розчином гербіциду згідно з процедурою селекції. Агарове середовище вливали у одноразові пластмасові чашки Петрі (20´100мл). Культури пагінців були під доглядом під флюоресцентним освітленням (10-20мкЕ/м 2с), і їх розповсюджували розсіченням культур скальпелем. Культури-кандидати розповсюджували і оцінювали за рівнем резистентності, як це описано далі. 2. Рівень стійкості культури пагінців до імідазолінону. Оцінювання гербіцидної резистантнрості (крок 7) проводили розміщенням трьох малих відрізків пагінця відповідної довжини у чашках з середовищем М20 з доданням імазетапірового гербіцида логарифмічно зростаючої концентрації у межах від 1нМ до 0,1мМ. Реакцію культури Sir-13 порівнювали з реакцією культур пагінців контрольної чутливої гр упи (ReІ-1). Пагінцеві культури витримувались при температурі 25°С і освітленні 20мкЕ/м 2с протягом 3 тижнів. Реакцію пагінців визначали кількісним оцінюванням пошкоджень і маси (свіжої) через три тижні після перенесення у селекційне середовище, Резистантність до гербіцида (R/S) визначали як відношення значень І50 для резистантних рослин до І50 для чутливи х (І50 - концентрація гербіцида, що викликає пошкодження 50% зразків). Комплексні характеристики резистентності кожного з варіантів визначались у спосіб, описаний вище, але з заміною гербіцидів, що уводились у середовище. У пагінцевій культурі Sir-13 було виявлено 220-кратний рівень стійкості до імазетапіру і не виявлено перехресної стійкості до сульфонілсечовинного, хлорсульфорону або тріазолпіримідинсульфонанілідового (флуметсулам) гербіцидів (табл.1). Таблиця 1 Кількісні оцінки резистантності і комплексної резистентності пагінцевої культури і ALS- резистантності. Клон Имазетапір Имазаметабенз Имазакін АС2992631 Хлорсуль фурон 2 Флуметсулам 3 НеІ-1 І50 5 пагінцева культура 18нМ 800нМ 40нМ 30нМ 2,5нМ 28нМ Sir-13 (Sir) І50 ALS 2,7нМ 430нМ 10нМ 150нМ пагінцева культура R/S4 3,9мкМ 220х >100мкМ >125х 3,0мкМ 75х 3,5мкМ 120х 3,0нМ 1х 20нМ 1х ALS 400мкМ R/S 150х 11нМ 1х 1 - Імідазолінон RAPTOR (American Cyanarnicl, Waine, NJ) 2 - Сульфонсечовина Glean (Dupont, Wilmington, DE) 3 - Тріазолпіримідинсульфонанілід (BROADSTRIKE, Dow Elanco, Indianapolis, IN) 4 - відношення значень I50 для резистантних рослин до I50 для чутливи х 5 - концентрація гербіцида, що викликає пошкодження 50% пагінцевої культури 3. Регенерація і розведення рослини На кроці 8 пагінцеві культури Sir-13 регенерують до повних рослин. Через два тижні після пагінцевої субкультури пагінці Sir-13 для розвитку коріння були перенесені у 125 мл-ві колби Ерленмейера з 40мл середовища N3. Середовище N3 сахароза - 30г/л міоінозитол - 100мг/л NH4NO3 - 1,65г/л КNО3 - 1,90г/л CaCI2×2H2O - 0,44г/л MgSO4×7H2 O - 0,37г/л KH2PO4 - 0,17г/л Н3ВО3 - 6,2мг/л MnSO4×H 2O - 16,8мг/л ZnSO4×7H2O - 10,6мг/л Кl - 0,88мг/л Na2MoO4×2H2O - 0,25мг/л CuSO4×5H2O - 0,025мг/л СоСl2×6Н2О - 0,025мг/л Na2ЕДТА - 37,3мг/л FeSO4×7H2O - 27,8мг/л тіамін - 1мг/л піридоксин - 0,5мг/л нікотинова кислота - 0,5мг/л нафтилоцтова кислота - 3мг/л рН 5,95 У 125 мл-ві колби Ерленмейера порціями 40мл додавали середовище N3 і 0,45г агару (конц. 9г/л) і витримували у автоклаві, щоб потім використати для розвитку коріння у пагінцевих культурах. Культури потім на 24год. кожного дня переносили під світло середньої інтенсивності (40-60мкЕ/м 2с) при температурі 25°С. Формування коріння звичайно відбувалось через 6-8 тижнів. Пагінці з корінням (генерація R0) потім переносили (крок 9) у горщикову суміш Baccto (Michigan Peat Co., Houston, TX) у теплиці. Після цього рослини R0 регенератів Sir-13 схрещували з гладкокорінним цукровим буряком 293. Самозаплідненням насіння F1 цих гібридів було одержане насіння F2. Вважалось, що стійкість до імідазолінону зумовлюється домінантним або напівдомінантним моногеном. Рослини генерації F2, стійкі до імідазолінону, мають розщеплюватись за ознакою у пропорції “гомозиготно резистантні:гетерозиготно резистентні:гомозиготно чутливі = 1:2:1”. Спадковість Sir-13 як моногенна домінантна ознака Це співвідношення було перевірене на нащадках кожної з рослин F2. Для Sir-13 рослини F2 були залишені самозапліднюватися, а насіння збирали окремо від кожної рослини. Це потомство було висаджене у теплиці і на стадії 2-4-го листа обприскане імазетапіром (PURSUIT) у кількості, учетверо меншій, ніж для поля (0,625 фунтів/акр (0,072кг/га) + 1кварта/акр (2,25л/га). Sunlt-ll (AGSCO Fargo) + 1кварта/акр (2,25л/га) 28%-ої аміачного нітрату сечовини. Ця кількість дозволяє відділити від чутливи х рослин рослини з 1 або 2 копіями алелі Sir-13. Кожна родина Sir-13 була класифікована як гомозиготно резистентна, гетерозиготно резистантна або гомозиготно чутлива на основі розщеплення нащадків у тесті. Результати підтверджують, що розщеплення рослин F2 Sir-13 узгоджується з відношенням 1:2:1 для відповідних категорій (табл.2). Таблиця 2 Батьки Гомозиготно резистантні Гетерозиготно резистантні Гомозиготно чутливі Розщеплення нащадків Кількість батьків Усі R 12 3R:1S 35 Усі S 15 Ці результати показують, що Sir-13 є моногенною домінантною ознакою. Рівень домінантності або напівдомінантності не визначено. 4. Стійкість цілої рослини до імідазолінону. Гомозиготні (нерозщеплені) рослини F2 Sir-13 були піддані самозаплідненню для одержання насіння F3 Sir13. Клони Rel-1 були залишені самозапліднюватись для одержання чутливого насіння F1. Насіння було висаджене у горщикову суміш Baccto у теплиці і через 14 днів пагінці були розріджені до 1 рослини на горщик. На стадії 4-6-го листа рослини були обприскані активним інгредієнтом імазетапіру (PURSUIT) або АС 299263 (RAPTOR) з витратою 0, 0,26, 1,1, 4,4, 17,5, 70 або 280г/га. Усі засоби вносились у об'ємі 239л/га і включали: 1% (за об'ємом) Sunlt-ll і 1% (за об'ємом) аміачного нітрату сечовини. Кожну обробку повторювали 4 рази. Масу свіжих пагінців визначали через 20 днів після посадки. Реакцію Sir-13 і чутливого буряка наведено на Фіг.3. Гомозиготи Sir-13 мали 120- і 90-кратну стійкість, відповідно, до імазетапіру і АС 299263. 5. Реакція ензима ALS на дію імазетапіру. Для часткового очищення ALS від швидко розвиненого листя цукрово-бурякових рослин, вирощених у теплиці, були використані стандартні процедури (Hart et al., Weed Science, 40:378-383, 1992). Екстракти з гомозиготних рослин F1 Sir-13 і насіння S1 Rel-1 були піддані кількісному аналізу для визначення активності ALS у присутності логарифмічно зростаючої концентрації імазетапіру. Активність ALS визначали у екстрактах з листя цукрових буряків ліній Sir-13 і Rel-1. Рослини вирощувались у теплиці, як це описано вище, до стадії 4-6го листа. Активність ALS визначали у свіжих екстрактах у присутності імазетапіру у логарифмічно зростаючих концентраціях, Способи і процедури були модифіковані порівняно з описаними у Ray (Plant PhysioІ., 75:827831, 1984) і Shaner et al. (Plant Physiol., 76:545-546, 1984). 10г листя цукрового буряка гомогенізували у 40мл холодного гомогенізаційного буфера (0,1М К2НРО 4, рН 7,5, 1мМ пірувата натрію, 0,5мМ МgСІ2, 0,5мМ тіамінпірофосфату, 10мкМ флавінаденiндинуклеотиду, 10% (обє'мних) гліцеролу) з 2,5г полівінілполіпіролідону. Гомогенат фільтрували через 8 шарів тонкої бавовняної тканини і центрифугували при 27000g протягом 20хвил. Верхній шар зняли і довели до 50%-го насичення доданням (NH4)2SO4. Розчин витримували при 0°С протягом 1год., після чого центрифугували при 18000g протягом 15хвил., гранули знову розчиняли у 1мл суспендуючого буфера (0,1М К2НРО4, рН 7,5, 20мМ пірувата натрію, 0,5мМ МgСІ2) і опріснювали на колонці Sephadex G-25 PD-10. Екстракти ензима були піддані кількісному аналізу негайно. Активність ALS виміряли доданням 0,2мл препарату ензима (розрідженого до концентрації 1:3 суспензійним буфером) до 1,3мл реакційного буфера (25мМ К2НРО4, рН 7,0, 0,625мМ МgСІ2, 25мМ пірувата натрію, 0,625мМ тіамінпірофосфату, 1,25мк флавінаденіндинуклеотиду) і інкубували при 35°С протягом 1год. Реакційні суміші мали фінальні концентрації 0, 4, 40, 400, 4000, 40000, 400000 або 4000000нМ імазетапіру або 0, 0,9, 9, 90, 900, 9000, 90000нМ хлорсульфурону. Реакцію зупиняли доданням 50мкл 6N H2SO4 і інкубуванням при 60°С протягом 15хвил. Цією процедурою (див. Westerfield, J. Bioi. Chem., 16:495-502, 1945) можна також видаляти з ензимного ALS-продукта (ацетолактата) карбоксилати, одержуючи ацетоїн. Кольоровий ацетоїновий комплекс був сформований доданням 1мл 2,5%-го (за масою) a-нафтолу і 0,25%-го (за масою) креатину у 2,5N NaOH з подальшим інкубуванням при 60°С протягом 15хвил. Як стандарт для колориметричної реакції був використаний комерційний ацетоїн. Концентрації ацетоїну визначались вимірюванням абсорбції реакційною сумішшю при 530нм. Експерименти з кожним гербіцидом були повторені з трьома реплікаціями. Концентрацію протеїну визначали способом, описаним у Bradford (Anal. Biochem., 72:248-254, 1976), з використанням альбуміну бичачої сироватки для стандартної кривої. Експерименти виконували двічі і тричі повторювали обробку. На Фіг.4 наведено реакцію екстрактів ALS з гомозиготного Sir-13 і чутливого Rel-1. У Sir-13 було виявлено 150-кратну стійкість до імазетапіру на рівні ензима (за відношенням І50 для резистантної і чутливої ліній). На Фіг.3 показано 44-кратну стійкість цілої рослини. 6. Кількість копій гену ALS Для визначення кількості копій гену ALS у чутливому цукровому буряку був проведений аналіз з використанням електрофорезної процедури для ДНК. Геномну ДНК ізолювали від чутливи х рослин F3 нащадків мутанта первісної Sir-13 і аналізували, застосовуючи загальноприйняту процедуру (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons» New york, 1991) . Подібним чином був підданий аналізу комерційний сорт цукрового буряка. У обох лініях цукрового буряка був виявлений тільки один екземпляр геномної ДНК. Це може вказувати на те, що уся ензимна активність ALS у гомозиготному мутанті цукрового буряка зумовлюється резистантною формою ензима. 7. Мутація гена ALS Для виявлення молекулярної основи стійкості ALS до ензима була використана стандартна процедура секвенування двох ділянок гена ALS, де мали місце усі раніше виявлені мутації, що сприяли стійкості до гербіцидів (Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley and Sons, New York, 1991). Ген ALS цукрового буряка був раніше секвенований (патент США 5 378 824) і були створені праймери ланцюгової реакції полімерази для підсилення двох ділянок гена, відповідальних за раніше виявлені випадки стійкості рослини до гербіцидів. Порівняння даних секвенування для резистантних (Sir-13) і чутливи х (Rel-1) цукрових буряків вказує на те, що відбулась одиночна зміна нуклеотида з гуаніна на аденін у позиції 337 нуклеотидної послідовності, що призводить до заміни треоніна аланіном у позиції 113 амінокислотної послідовності ALS цукрового буряка. Раніше вже був виявлений вплив цього сайта на стійкість до імідазолінону у дурнишнику (Bernasconi et al., J. Biol. Chem., 270:17381-17385, 1995), і стійкість до сульфонілсечовини у дріжджах (патент США 5 378 824). Дослідження не виявили ніяких інших базових змін у нуклеотидних послідовностях дикого типу у цих двох ділянках гена ALS. Наведений опис лише ілюструє винахід, об'єм якого визначено Формулою.